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Neuroscience

Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Delle vescicole sinaptiche (SV) la bicicletta è il meccanismo di base della comunicazione intercellulare alle sinapsi neuronali. Rilascio e l'assorbimento della tintura di FM sono il mezzo primario di quantitativamente analizzante SV endo - ed esocitosi. Qui, mettiamo a confronto tutti i metodi di stimolazione per guidare FM1-43 ciclismo alla sinapsi Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) modello.

Abstract

FM coloranti vengono utilizzati per studiare il ciclo delle vescicole sinaptiche (SV). Queste sonde di amphipathic hanno una testa idrofila e coda idrofobica, rendendoli solubili in acqua con la possibilità di reversibilmente entrare ed uscire lipidici di membrana. Questi coloranti styryl sono relativamente non fluorescente in ambiente acquoso, ma inserire il foglietto esterno della membrana plasmatica provoca un > 40 X aumentare in fluorescenza. Nelle sinapsi neuronali, FM coloranti sono interiorizzati durante endocitosi SV, smerciata sia all'interno che tra piscine SV e rilasciato con esocitosi SV, fornendo un potente strumento per visualizzare le fasi presinaptici della neurotrasmissione. Un modello genetico primario di sviluppo di sinapsi glutammatergiche e funzione è la Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ), dove FM tingere imaging è stato ampiamente utilizzata per quantificare la dinamica di SV in una vasta gamma di condizioni mutante. Il terminale sinaptico NMJ è facilmente accessibile, con una bella serie di grandi boutons sinaptici ideale per applicazioni di imaging. Qui, mettiamo a confronto e contrasto i tre modi per stimolare la drosofila NMJ guidare tintura l'assorbimento/rilascio di attività-dipendente FM1-43: applicazione 1) vasca di alta [K+] a depolarizzarsi tessuti neuromuscolari, 2) del nervo motore elettrodo di aspirazione stimolazione a depolarizzarsi nervi presinaptici terminali e 3) mirati transgenici espressione delle varianti channelrhodopsin per luce-stimolato un controllo spaziale di depolarizzazione. Ciascuno di questi metodi presenta vantaggi e svantaggi per lo studio degli effetti di mutazione genetica sul ciclo SV presso la drosofila NMJ. Discuteremo di questi vantaggi e svantaggi per facilitare la scelta dell'approccio stimolazione, insieme con le metodologie specifiche per ogni strategia. Oltre a formazione immagine fluorescente, FM coloranti possono essere photoconverted a elettrone-densi segnali visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per lo studio dei meccanismi di ciclo SV a livello ultrastrutturale. Forniamo i confronti di confocale e la microscopia elettronica imaging da diversi metodi di stimolazione di Drosophila NMJ, per aiutare a guidare la selezione dei futuri paradigmi sperimentali.

Introduction

Il modello splendidamente caratterizzato Drosophila larvale della giunzione neuromuscolare (NMJ) glutamatergic sinapsi è stato utilizzato per studiare la formazione della sinapsi e funzione con un vasto spettro di perturbazioni genetica1. Il terminale del neurone di motore è costituito da più rami dell'assone, ognuno con molti boutons sinaptici allargata. Queste varicosità capiente (fino a 5 µm di diametro) contengono tutte la macchine di neurotrasmissione, comprese le vescicole sinaptiche glutamatergic uniforme (SVs; ~ 40 nm di diametro) nella riserva citosolico e facilmente rilasciabile piscine2. Queste vescicole attraccano a zone attive di sito del fusione di membrana presinaptica (AZs), dove l'esocitosi media il rilascio di neurotrasmettitore glutammato per trans-comunicazione sinaptica. Successivamente, il SVs vengono recuperato dalla membrana plasmatica tramite bacio-and-run riciclaggio o endocytosis clathrin-mediato (CME) per cicli ripetuti exo/endocitosi. La Drosophila NMJ è facilmente accessibile e ben adatto per isolamento e caratterizzazione di mutanti di ciclo SV. Utilizzando schermi genetici avanti, mutazioni novelle hanno portato all'identificazione di nuovi geni critici per il ciclo di SV3. Inoltre, approcci genetici inverso a partire con geni già noti hanno portato alla delucidazione dei meccanismi di ciclo nuovi SV attraverso la descrizione accurata del mutante ciclismo fenotipi4. La Drosophila NMJ è quasi ideale come preparazione per dissezione meccanismi di endocitosi ed esocitosi SV tramite metodi di otticamente della vescicola di pista in bicicletta durante la neurotrasmissione sinaptica sperimentale.

Una gamma di marcatori fluorescenti permettono tracking visivo delle vescicole durante la pedalata dinamica, ma il più versatile sono analoghi di tintura di FM che è sintetizzato per la prima volta da Mao, F., et al. 5. strutturalmente, FM coloranti contengono una testa idrofila e una coda lipofilica collegato attraverso un anello aromatico, con una regione centrale che conferisce proprietà spettrali. Questi styryl coloranti partizione reversibilmente in membrane, non 'Flip-flop' tra membrana volantini e così non sono mai gratuito nel citosol e sono molto più fluorescente in membrane di acqua5. Inserimento reversibile in un bilayer del lipido provoca un volta 40 aumento nella fluorescenza6. Alle sinapsi neuronali, gli esperimenti d'etichettatura di colorante classici di FM consistono di balneazione la preparazione sinaptica con la tintura durante la depolarizzazione stimolazione per caricare tintura via il endocytosis SV. Tintura esterna viene quindi lavata e il ciclo SV viene arrestato in una soluzione di ringer senza calcio all'immagine caricata sinapsi7. Un secondo ciclo di stimolazione in un bagno di tintura-libero innesca il rilascio di FM attraverso l'esocitosi, un processo che può essere seguito misurando la diminuzione di intensità di fluorescenza. Popolazioni di SV da una vescicola singola per piscine contenenti centinaia di vescicole possono essere quantitativamente monitorati6,7. FM coloranti sono stati utilizzati per sezionare la mobilitazione di attività-dipendente delle piscine SV funzionalmente distinte e per confrontare bacio-and-run vs CME ciclismo8,9. Il metodo è stato modificato alla separatamente saggio evocato, ciclo sinaptica spontanea e miniatura attività (con attrezzature altamente sensibile per rilevare le variazioni molto piccole di fluorescenza e ridurre photobleaching)10. Le analisi possono essere estesa a livello ultrastrutturale di photoconverting il segnale FM fluorescente in un'etichetta elettrone-densi per trasmissione microscopia elettronica11,12,13,14 .

Storicamente, la balneazione preparazioni sinaptiche in un'alta concentrazione di potassio (in appresso denominato "alta [K+]") è stato il metodo di scelta per depolarizzazione stimolazione per indurre SV ciclismo; compreso tra la rana colinergici NMJ5, coltivate roditore cervello neuroni ippocampali15, per il modello16,di Drosophila glutamatergic NMJ17. Questo approccio [K+] alto è semplice, non richiede nessun attrezzature specializzate e pertanto è accessibile alla maggior parte dei laboratori, ma ha limitazioni per applicazione e interpretazione dei dati. Un metodo molto più fisiologicamente appropriato consiste nell'utilizzare l'aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo4,5,12. Questo approccio unità terminale la propagazione del potenziale d'azione per stimolazione diretta dei nervi presinaptici e risultati possono essere confrontati direttamente per le analisi elettrofisiologiche di neurotrasmissione funzione13,14, 15, ma richiede attrezzature specializzate ed è tecnicamente molto più impegnativo. Con l'avvento di optogenetica, l'uso della stimolazione di un neurone channelrhodopsin ha altri vantaggi, tra cui uno stretto controllo spazio-temporale dell'espressione di canale utilizzando il binario sistema Gal4/UAS20. Questo approccio è tecnicamente molto più facile che la stimolazione di aspirazione elettrodo e non richiede niente di più di una sorgente di luce LED molto a buon Mercata. Qui, ci avvaliamo di formazione immagine della FM1-43 (dibromuro di pyridinium-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)N) sia e confrontare questi tre metodi di stimolazione diversi presso la drosofila NMJ: semplice alta [K+ ], sfidando channelrhodopsin elettrici e nuovi approcci.

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Protocol

1. larvale colla dissezione

  1. Mescolare bene 10 parti di elastomero di silicone base con 1 parte di elastomero di silicone induritore dal kit di elastomero (Tabella materiali).
  2. Cappotto 22x22 mm lamelle di vetro con l'elastomero e cura su un piatto caldo a 75 ˚ c per diverse ore (fino a quando non è più appiccicoso al tatto).
  3. Posizionare un coprioggetto in vetro rivestite con elastomero singolo nella camera di dissezione di vetro plexi su misura (Figura 1, in basso) in preparazione per la dissezione larvale.
  4. Preparare le pipette di colla dal capillare di vetro borosilicato con l'estrattore microelettrodo standard per ottenere la conicità desiderata e dimensione della punta.
  5. Delicatamente rompere fuori la punta della micropipetta e a altra estremità, allegare 2 ft di tubo di plastica flessibile (1/32" diametro interno, ID; 3/32" diametro esterno, OD; 1/32" parete; Tabella materiali) con bocca raccordo (punta della pipetta P2).
  6. Riempire un piccolo contenitore (cappuccio del tubo Eppendorf 0,6 mL) con un piccolo volume (~ 20 µ l) di colla (Tabella materiali) in preparazione per la dissezione larvale.
  7. Riempire la camera con soluzione fisiologica (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, saccarosio 70 e l'acido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) pH 7.2.
  8. Aggiungere anti-rafano perossidasi (HRP) anticorpo coniugato a Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluito 01:10 da uno stock di 1 mg/mL) per l'etichettatura NMJ terminale presinaptico durante la dissezione21,22.
  9. Usando un pennello fine (taglia 2), rimuovere un errante instar terzo dal flaconcino di cibo e posto sul coperchio vetro rivestite con elastomero.
  10. Riempire la punta di una micropipetta di vetro con una piccola quantità di colla usando pressione aria negativa generata dalla bocca con allegato (punto 1.5).
  11. Posizione della larva dorsale dal lato con il forcipe e colla testa per il coprioggetto rivestite con elastomero con una piccola goccia di colla utilizzando la pressione dell'aria positiva per bocca.
  12. Ripetere questa procedura con l'estremità posteriore della larva, assicurandosi che l'animale sia teso teso tra i due allegati di colla.
  13. Utilizzando le forbici (lame 3 mm; Tabella materiali), fare un taglio orizzontale (~ 1 mm) al posteriore e un taglio verticale lungo la linea mediana dorsale.
  14. Utilizzando una pinzetta (n. 5, Tabella materiali), delicatamente rimuovere trachea dorsale, dell'intestino, del grasso corporeo e altri organi interni che copre la muscolatura.
  15. Ripetere la procedura di incollaggio per i quattro lembi di parete del corpo, facendo attenzione a stendere delicatamente la parete del corpo sia orizzontalmente che verticalmente.
  16. Sollevare il cavo ventrale del nervo (VNC) usando il forcipe, accuratamente tagliato i nervi motori con le forbici e quindi rimuovere completamente il VNC.
  17. Sostituire le saline di dissezione con Ca2 +-gratis salino (stesso come le saline di dissezione sopra senza il CaCl2) per interrompere SV in bicicletta.

2. opzione 1: High [K+] FM Dye caricamento

  1. Da una soluzione madre di FM1-43 (4 mM), è necessario aggiungere 1 µ l ad 1 mL di soluzione di KCl (alto [K+] in soluzione salina dissezione) per una concentrazione finale di 4 µM di 90 mM.
  2. Utilizzando una pipetta, sostituire il Ca2 +-soluzione fisiologica gratis nella camera di imaging con la soluzione di colorante [K+] FM alta per stimolare l'assorbimento del colorante di endocitosi SV.
  3. Avviare immediatamente un timer digitale per la durata predeterminata dell'alto [K+] depolarizzanti periodo di stimolazione (ad es., 5 min; Figura 2).
  4. Per confermare una sana preparazione larvale, notare le forti contrazioni della muscolatura per tutta la durata del periodo di depolarizzazione alta [K+].
  5. Al termine del periodo di timer, rimuovere la soluzione di colorante [K+] FM alta e sostituire rapidamente con Ca2 +-libera soluzione fisiologica per interrompere SV in bicicletta.
  6. Lavare in rapida successione con il Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante [K+] FM alta viene completamente rimosso.
  7. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.

3. imaging: Microscopia confocale

  1. Utilizzare un microscopio confocale dritto con un 40 X obiettivo a immersione in acqua a fluorescenza di tintura NMJ immagine (possono essere usati altri microscopi).
  2. Immagine 4 NMJ dei segmenti addominali 2-4 (può essere imaged altri NMJs) del muscolo e raccogliere immagini usando il software adatto (Tabella materiali).
  3. Utilizzare laser HeNe 633 nm per eccitare HRP:647 (con filtro passa-lungo > 635 nm) e un laser di Argon 488 nm per eccitare FM1-43 (con passa-banda filtro 530-600 nm).
  4. Operativamente determinare ottima guadagno e offset per entrambi i canali.
    Nota: Queste impostazioni rimarrà costante per tutto il resto dell'esperimento.
  5. Prendere uno Z-stack confocale attraverso intero NMJ selezionato dall'alto HRP-segnata verso il basso del terminale sinaptico.
  6. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire in eccesso di NMJ stesso esatto dopo FM tingere lo scarico.

4. alta [K+] stimolazione: FM Dye scarico

  1. Sostituire Ca2 +-libera soluzione fisiologica con la soluzione fisiologica [K+] alta (senza tintura FM1-43) a depolarizzazione in auto, rilascio di esocitosi e tintura SV.
  2. Avviare immediatamente un timer digitale per la pre-determinata durata del periodo di stimolazione [K+] alta (ad es., 2 min; Figura 2).
  3. Al termine del periodo di timer, immediatamente rimuovere le saline [K+] alta e sostituirli con Ca2 +-libera soluzione fisiologica per interrompere SV in bicicletta.
  4. Lavare in rapida successione con Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire l'alta soluzione salina [K+] viene completamente rimosso.
  5. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
  6. Essere certi di immagine la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni confocale.

5. opzione 2: Stimolazione elettrica FM Dye caricamento

  1. Preparare una pipetta aspirazione usando l'estrattore di microelettrodi (Tabella materiali) per ottenere la conicità necessaria e dimensione della punta.
  2. Fuoco-polacco la punta microelettrodo con un micro-forge fino a quando un singolo nervo motore può essere aspirato con una perfetta aderenza.
  3. Far scorrere aspirazione pipetta sul supporto elettrodo un micromanipolatore e collegare il tubo di plastica lungo e flessibile e una siringa.
  4. Impostare i parametri dello stimolatore (ad es., 15 V, frequenza di 20 Hz, 20 ms durata e tempo di 5 min (Figura 2) o 1 min (Figura 3)).
  5. Sostituire il Ca2 +-salino gratuito sulla preparazione larvale con sopra salino FM1-43 (4 µM; 1 mM CaCl2) sull'impianto di perforazione di elettrofisiologia.
  6. Mettere il preparato sulla fase di microscopio e alzare il tavolino fino a quando la larva e pipetta di aspirazione sono a fuoco (obiettivo a immersione in acqua X 40).
  7. Aspirare con un ciclo di taglio del nervo motore che innerva il selezionato hemisegment con pressione aria negativa generata dalla siringa in aspirazione elettrodo.
  8. Verificare la funzione di aspirazione elettrodo con una breve raffica di stimolazione monitorando visivamente per la contrazione muscolare nella hemisegment selezionata.
  9. Stimolare il nervo motore utilizzando parametri selezionati (punto 5.4) per guidare endocitosi SV e l'assorbimento della tintura di FM1-43 (Figura 2).
  10. Lavare in rapida successione con Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante FM1-43 viene completamente rimosso.
  11. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-salino gratuito per formazione immagine immediata utilizzando il protocollo di imaging confocale dall'alto.
  12. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire l'accesso a NMJ stesso esatto dopo lo scarico della tintura di FM.

6. elettrostimolazione: FM Dye scarico

  1. Sostituire il Ca2 +-gratis salino con soluzione salina normale (senza tintura FM1-43) e posizionare la preparazione torna sulla scena del impianto di perforazione di elettrofisiologia.
  2. Impostare i parametri di stimolatore per lo scarico (per esempio, 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 2 min (Figura 2) o 20 s (Figura 3)).
  3. Succhiano il nervo motore stesso l'elettrodo stesso come sopra e quindi stimolare per attivare SV esocitosi e rilascio di tintura FM1-43.
  4. Lavare in rapida successione con Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la tintura esterna è completamente rimosso.
  5. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
  6. Garantire per la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni di confocale di immagine.

7. opzione 3: Channelrhodopsin stimolazione FM Dye caricamento

  1. Sollevare le larve ChR2-esprimendo il cibo contenente retinico ChR2 co-fattore tutto-trans (disciolto in etanolo; una concentrazione finale di 100 µM).
  2. Luogo la preparazione larvale nella camera di plexiglass su una fase di microscopio di dissezione dotata di una porta di fotocamera.
  3. Collegare un LED blu (470 nm; Tabella materiali) a uno stimolatore programmabile tramite un cavo coassiale e posizionare il LED alla porta della fotocamera.
  4. Focalizzare il fascio di luce LED blu sulla funzione larvale dissecata utilizzando la funzione di zoom microscopio.
  5. Sostituire il Ca2 +-salino gratuito sulla preparazione larvale con sopra salino FM1-43 (4 µM; 1 mM CaCl2) sul palco optogenetica.
  6. Impostare i parametri di LED utilizzando lo stimolatore (ad es., 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 5 min (Figura 2)).
  7. Avviare la stimolazione luminosa e traccia con un timer per la pre-determinata durata del periodo di stimolazione di optogenetica (ad es., 5 min; Figura 2).
  8. Quando il timer si arresta, rapidamente rimuovere la soluzione di colorante FM e sostituirli con Ca2 +-salino gratuito per fermare la SV in bicicletta.
  9. Lavare in rapida successione con il Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la soluzione di colorante FM viene completamente rimosso.
  10. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-salino gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale mediante imaging protocollo dall'alto.
  11. Prendere nota delle NMJ imaged (segmento, lato e muscolare) per garantire l'accesso a NMJ stesso esatto dopo lo scarico della tintura di FM.

8. Channelrhodopsin stimolazione: FM Dye scarico

  1. Sostituire Ca2 +-libera soluzione fisiologica con salino normale (senza tintura FM1-43) sul tavolino del microscopio di dissezione con porta telecamera LED focalizzato sulla larva.
  2. Impostare i parametri di stimolatore per scarico (ad es., 15 V, frequenza 20 Hz, 20 ms di durata e tempo di 2 min (Figura 2)).
  3. Avviare la stimolazione luminosa e traccia con un timer per il pre-determinata durata del periodo di stimolazione optogenetica (ad es., 2 min; Figura 2).
  4. Al termine del periodo di timer, rimuovere la soluzione di colorante FM e sostituire rapidamente con Ca2 +-salino gratuito per fermare la SV in bicicletta.
  5. Lavare in rapida successione con Ca2 +-gratis salino (5x per 1 min) per garantire la tintura esterna è completamente rimosso.
  6. Mantenere la preparazione larvale in fresco Ca2 +-soluzione fisiologica gratuito per formazione immagine immediata con il microscopio confocale.
  7. Garantire per la fluorescenza di tintura FM1-43 alle NMJ stesso indicato in precedenza utilizzando le stesse impostazioni di confocale di immagine.

9. fluorescenza quantificazione

  1. Caricare l'immagine in immagine J (opensource NIH) e creare una proiezione di massima intensità cliccando immagine | Stack | Progetto di Z.
  2. Usando l'anti-HRP:647 canale, vai a immagine | Regolare | Soglia e far scorrere la barra degli strumenti in alto finché non viene evidenziato solo NMJ.
  3. Usando lo strumento bacchetta, fate clic sulla giunzione neuromuscolare. Se la giunzione neuromuscolare è discontinuo, tenere premuto il tasto MAIUSC e selezionare tutte le parti.
  4. Cambiare l'immagine per il canale di tintura FM1-43 e andare a Analyze | Misura per ottenere la misura della fluorescenza.
  5. Ripetere i passaggi 9.1-9.4 per l'immagine "scaricato" dalla stessa giunzione neuromuscolare (segmento identificato, lato e muscolo).
  6. Per ottenere la percentuale di tintura che è stata scaricata, prendere il rapporto tra le intensità di fluorescenza scaricati/caricati.
    Nota: Questa procedura può essere modificata per analizzare fluorescenza su una base di bouton-a-bouton utilizzando gli strumenti di selezione "ovale" o "a mano libera". Fluorescenza di fondo può essere sottratto campionando la fluorescenza di muscolo. Agenti possono anche essere aggiunti per ridurre questo sfondo.

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Representative Results

La figura 1 Mostra il flusso di lavoro per la tintura di FM di attività-dipendente imaging protocol. L'esperimento inizia sempre con la dissezione larvale colla stessa, indipendentemente dal metodo di stimolazione utilizzato successivamente. Figura 1a è un disegno schematico di una larva dissecata, mostrando il cavo ventrale del nervo (VNC), irradiando i nervi e pattern muscolari ripetute hemisegmental. Il VNC è rimosso e la preparazione bagnata in una soluzione di 4 µM di FM1-43 (Figura 1b, rosa). La preparazione è quindi stimolata in presenza di colorante FM utilizzando uno dei tre possibili opzioni per caricare il colorante tramite endocitosi di attività-dipendente SV (Figura 1cI-III). Avanti, FM tintura ciclismo viene arrestato utilizzando Ca2 +-saline gratis e un terminale NMJ specifico che è stato caricato con la tintura di FM è Imaging utilizzando un microscopio confocale ("immagine caricata"; Figura 1 d). In questo caso, il muscolo che 4 NMJ è selezionata con il posizionamento di visualizzando schematici del nervo, ramificazione terminale NMJ e FM caricato boutons sinaptici. La preparazione sinaptica è stimolata per una seconda volta utilizzando lo stesso metodo selezionato sopra, ma in assenza di tintura di FM a guidare SV esocitosi e rilascio FM1-43 (Figura 1e). Lo stesso identificato NMJ (muscolare 4 NMJ in questo esempio) è quindi re-imaging utilizzando HRP:647 sinaptica etichetta e segnale di residuo FM1-43 della vescicola ("immagine scaricata"; Figura 1f). Lo sperimentatore determina la forza e la durata di carico e scarico fasi per ottimizzare le misure per un'analisi specifica o una condizione mutante. L'intensità di fluorescenza è quantificato dopo il carico e lo scarico (Figura 1D, 1f), per ottenere le misurazioni di endocitosi sinaptica tintura, esocitosi e la percentuale di caricato tintura FM rilasciata. Analisi possono essere fatto per l'intero NMJ o singolo boutons.

Tintura di FM in bicicletta può essere stimolata in tre modi: la depolarizzazione Salina 1) alta [K+] di tutta la preparazione, 2) aspirazione degli elettrodi di stimolazione del nervo motore, o 3) guidato fotoattivazione di channelrhodopsin mirati (ChR2; Figura 2). Per un confronto side-by-side diretto di tutti i tre metodi, abbiamo stimolato ogni approccio per 5 min in presenza di FM1-43 (caricamento) e poi per 2 min in assenza di FM1-43 (scarico) ed imaged HRP-denominata NMJs utilizzando impostazioni identiche confocale ( Figura 2). Il metodo di depolarizzazione salina [K+] alto segue il protocollo di FM1-43 ampiamente usato per la drosofila larvale NMJ23, tranne usiamo la colla invece di pin per la dissezione larvale. La colla evita le interferenze con gli obiettivi del microscopio e consente la determinazione più precisa della tensione della parete del corpo, ma richiedono una curva di apprendimento moderata. Tutti i tre metodi producono segnali fluorescenti forti e coerenti in tutta l'arbor bouton sinaptico NMJ e all'interno di singoli boutons sinaptici (inserti). Il metodo di depolarizzazione salina [K+] alto provoca tutti i NMJs essere FM-caricato tutta la larva come depolarizza ogni neurone nell'animale (Figura 2A, medio). Il metodo di stimolazione elettrica del nervo elettrodo aspirazione unità solo in un singolo hemisegment delle larve per i quali la corrispondente che innervano nervo motorio è stato stimolato (Figura 2B, medio). Segmenti non stimolate nello stesso animale sono distinguibili utilizzando l'etichetta HRP ma non contengono nessun colorante fluorescente osservabile di caricamento e servono come eccellenti controlli interni. L'optogenetica ChR2 metodo produce mirata depolarizzazione dipenda il driver Gal4 transgenico impiegato (Figura 2). Qui, l'autista era un trasportatore del glutammato vescicolare dei suini (vglut) Gal4, così tutti i neuroni glutamatergici sono depolarizzati con stimolazione luminosa blu, compresi tutti i motoneuroni glutamatergic. Di conseguenza, tutti i NMJs sono caricati con FM1-43 tintura in questo esempio (Figura 2, medio). Cellula-specifico driver possono essere utilizzati per etichetta specifico NMJs e lasciare gli altri senza etichetta per un controllo interno.

Lo scarico della tintura di FM è stato realizzato tramite lo stesso metodo utilizzato per caricare la tintura. Nel primo metodo, la preparazione larvale è stato semplicemente bagnata in alto [K+] soluzione salina in assenza di FM1-43 a depolarizzare le cellule, esocitosi di unità SV e scaricare i terminali sinaptici (Figura 2A, destra). Selezioniamo in genere un periodo più breve di scarico (2 min), quindi scaricando è parziale e terminali rimangono visibili nel canale FM. Lo scarico aspirazione elettrodo stimolazione elettrica è notevolmente più impegnativo, perché si tratta di ritornare il hemisegment stesso, identificando il nervo stesso e ri-stimolare quel nervo in assenza di FM1-43 per guidare lo scarico della tintura (Figura 2B , destra). Si noti che il colorante lo scarico era ancora parziale. Lo scarico di ChR2 comporta un secondo periodo di illuminazione LED blu della preparazione larvale in assenza della FM1-43 per attivare i canali, depolarizzare i motoneuroni e stimolano il rilascio di SV esocitosi tintura (Figura 2, destra). Con questa scala cronologica di scarico (2 min), ciascuno di questi depolarizzazione metodi scaricata solo una percentuale della tintura FM1-43 caricata, con l'alto [K+] più forte e ChR2 più deboli nell'azionamento della tintura rilascio (Figura 2). Abbiamo misurato il LED intensità luminosa utilizzata (140 µW/mm2), che era nella gamma pubblicati (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 è attivato al massimo di ~ 1 illuminazione di mW da fonti di luce di 50-200 mW, con efficacia ChR2 anche dipenda sulla concentrazione ATR alimentata a larva27,28. Così, ChR2 forza di stimolazione può essere manipolato. Inoltre, la relazione non può rimanere vera con altri punti di forza di stimolazione, scale cronologiche o genotipi. Se lo sperimentatore sta lavorando con un mutante che ha diminuito la endocitosi SV o insolitamente veloce esocitosi, i parametri di stimolazione potrebbero essere necessario essere modificato per mantenere un segnale osservabile dopo lo scarico. L'etichetta anti-HRP permette di identificare le NMJ anche in completa assenza del segnale FM, ma questo non è l'ideale per la quantificazione. In linea di principio, la stimolazione di scarico potrebbe essere anche di tipo diverso dalla stimolazione di caricamento.

Recentemente abbiamo studiato la perdita degli effetti Notum secreta deacylase sinaptica sul ciclo SV mediante stimolazione elettrica4. Qui, estendiamo questa analisi per confrontare 1) alta [K+] depolarizzazione e 2) aspirazione elettrodo del nervo motore stimolazione metodi (Figura 3). Abbiamo trovato che entrambi i metodi danno un risultato simile, visualizzando ridotto FM1-43 della tintura di caricamento in un mutante null Notum ; Tuttavia, il grado del fenotipo è distinto tra i due metodi. Dopo la depolarizzazione con alta [K+] soluzione fisiologica per cinque minuti, c'è una grande diminuzione nell'intensità di fluorescenza caricati tra controllo del background genetico (w1118) con alti livelli e Notum mutanti (NotumKO ) con i bassi livelli (Figura 3A, parte superiore). Nelle misurazioni quantificati, intensità di fluorescenza FM normalizzata all'interno di terminali NMJ HRP-delineato è ridotto significativamente in assenza di Notum (w1118 1.0 ± 0.05 vs NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0,0001; Figura 3B). Dopo stimolazione elettrica a 20 Hz per 1 min, troviamo una diminuzione insignificante caricato FM1-43 intensità tra controlli e valori null Notum nel quantificare intera fluorescenza NMJ (w1118 1.0 ± 0.05 vs NotumKO 0.86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figura 3A, B). Quando si misura la incorporazione di tintura su una base di bouton-a-bouton, troviamo una diminuzione significativa in tintura caricata con entrambi i metodi. Nelle misurazioni quantificati dopo stimolazione con alta [K+] salino, intensità di fluorescenza FM normalizzato per bouton è diminuita significativamente (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0,0001; Figura 3). Dopo stimolazione elettrica, intensità di fluorescenza normalizzata per bouton è diminuito significativamente anche, seppur in misura inferiore (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; Figura 3).

Le differenze di risultato tra i due paradigmi di stimolazione potrebbero essere dovuto un certo numero di fattori. In primo luogo, la forza di stimolazione è presunta per essere maggiore con alta [K+] rispetto alla stimolazione elettrica del nervo motore. Non possono essere fatte delle registrazioni di elettrofisiologia in presenza di alte saline [K+], ma il neuromusculature larvale è chiaramente robustamente stimolata, come contrazioni muscolari sono forte e continuo durante tutto il periodo di balneazione di 5 min. Tuttavia, non sappiamo l'intensità o la frequenza della stimolazione. Al contrario, la stimolazione elettrica è molto più controllata con l'utente che sceglie la tensione esatta forza e frequenza di stimolazione. In secondo luogo, la durata di stimolazione era maggiore con alta [K+] rispetto alla stimolazione elettrica del nervo (Figura 3). Abbiamo scelto 1 min di 20 Hz stimolazione elettrica dopo prove ripetute. Dopo 1 minuto di caricamento di tintura, c'era un segnale forte e affidabile di FM1-43, così abbiamo scelto quel paradigma per il nostro Studio4, anche se 5 min di stimolazione ha dato un segnale fluorescente ancora più forte (Figura 2). La lunghezza del paradigma stimolazione probabilmente è contribuendo in tal modo, alla variabilità di grandezza nel caricamento FM1-43 tra alta [K+] e la stimolazione elettrica (Figura 3B, C). Anche se il metodo [K+] alto hanno mostrato un fenotipo più robusto per Notum mutanti, abbiamo ancora usato il metodo elettrico a causa della maggiore controllo4. Ci sono molti parametri per controllare quali resistenza, frequenza e durata della stimolazione, e tali impostazioni devono essere decisa in base il mutante e la domanda. Ad esempio, la scelta del metodo di stimolazione può dipendere la SV piscina interrogato7 e il meccanismo di attività-dipendente studiato10.

Dopo FM1-43 caricamento nel terminale NMJ, uno può impiegare fotoconversione di tintura di fluorescenza per produrre il segnale elettrone-densi di microscopia elettronica (Figura 4). In questo metodo, la preparazione della tintura-caricato è esposto a luce fluorescente intensa in presenza di diaminobenzidina (DAB), con le specie reattive dell'ossigeno da tintura FM ossidanti DAB per creare un precipitato scuro (Figura 4A)11. Vedere l'articolo di JoVE su fotoconversione di styryl coloranti per i dettagli completi12. Il vantaggio di questo metodo è che SVs sono chiaramente rivelato a livello ultrastrutturale, anche se il ciclo SV è naturalmente arrestato con formazione immagine statica microscopio elettronico. In assenza di stimolazione, boutons sinaptici presso la drosofila NMJ densamente vengono caricati con vescicole (~ 40 nm di diametro; Figura 4B), con la rara presenza di organelli allargati (>100 nm di diametro) si presume che sia in bicicletta gli endosomi. Alta soluzione salina [K+] depolarizzanti stimolazione fortemente cambia questo profilo, con uno svuotamento parziale della popolazione SV e il rapido accumulo di numerosi organelli allargati (>100 nm di diametro) pensato per derivare da massa endocitosi della membrana plasmatica (Figura 4, sinistra). Anche se scomparti simili esistono nei controlli non stimolati, l'alta densità di questi organelli dopo alta [K+] Salina depolarizzazione solleva la preoccupazione che questo può essere una risposta non-fisiologica. Aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo motore è relativamente più efficiente in che riducono la popolazione di SV e non produce più delle vescicole endosomal allargata (Figura 4, sinistra). Ciò suggerisce che l'endocitosi di massa guidato da alta [K+] depolarizzazione aiuta a mantenere la popolazione di SV durante la richiesta più intensa.

FM1-43 fotoconversione può essere eseguita utilizzando alta [K+] Salina depolarizzazione o aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo motore, per confrontare l'ultrastruttura sinaptica rispetto una bouton riposa (Figura 4). Con alta [K+] depolarizzanti stimolazione, sia singoli SVs e vescicole allargate (>100 nm di diametro) possono essere etichettati con l'elettrone-densi DAB precipitato seguente luce-driven fotoconversione (Figura 4, destra). Per ragioni sconosciute, la membrana della vescicola allargata è in genere meno densamente con etichetta quello delle più piccole membrane SV. Inoltre, SVs appaiono spesso riempito con il precipitato DAB, piuttosto che solo la membrana, ma questo li rendono molto più facile da distinguere dalle vescicole senza etichetta. Con la stimolazione del nervo motore aspirazione elettrodo, la popolazione di SV in bicicletta possa anche essere marcata rispetto al SVs senza etichetta (Figura 4, destra). Con stimolazione elettrica, allargata vescicole (>100 nm di diametro) non rilevabile si formano in boutons e, coerentemente, le membrane della presunta endosomi non sono etichettati di fotoconversione FM1-43. Come sopra, ciclismo SVs sono tipicamente riempito con il DAB precipitato in modo un po ' definitivo e quindi più facilmente distinguibile da SVs che non sono state formate durante la stimolazione (Figura 4, destra). Non abbiamo ancora tentato fotoconversione dopo stimolazione con ChR2. Con corsi di diverso tempo di stimolazione, FM1-43 tintura fotoconversione consente di determinare dove si formano SVs, come SVs sono vittime della tratta e i tempi di movimento tra diverse piscine spaziale entro il bouton sinaptico. Il confronto delle alte [K+] e la stimolazione del nervo permette la dissezione di massa e singoli meccanismi di endocitosi SV.

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso della tintura FM1-43 caricamento protocollo presso la drosofila NMJ. La dissezione larvale colla produce una preparazione neuromusculature appiattito, con il cavo ventrale del nervo (VNC) proiettando nervi segmentali dalla linea mediana ventrale (Vm) per la hemisegmentally ripetuto corpo parete muscolare matrici (passo un). Il VNC è cut gratis, e la dissezione larvale intera viene quindi incubata nella soluzione FM1-43 rosa (4 µM) in preparazione per la stimolazione (punto b). FM1-43 viene quindi caricato con un paradigma di stimolazione selezionato (passaggio 3); con le opzioni di alta [K+] depolarizzazione della larva intera (cI), aspirazione elettrodo stimolazione di un singolo nervo motore (cII), o attivazione luce-driven di altamente mirati channelrhodopsin (cIII). FM1-43 incorporazione viene arrestato utilizzando Ca2 +-saline gratis e NMJ tintura-caricato imaged (punto d). Una seconda stimolazione avviene quindi senza FM1-43 nel bagno di tintura esocitosi delle vescicole sinaptiche (punto e) in auto. La stessa NMJ-quindi è immaginata per analizzare il terminale sinaptico scaricato (punto f). Intensità di fluorescenza è misurata da NMJs sia caricato e scaricato da quantificare endocitosi SV e SV esocitosi livelli. Il pannello inferiore mostra i parametri di costruzione e dimensioni per l'alloggiamento acrilico trasparente utilizzato per questi studi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: FM tingere confronto di carico e scarico di tutti i metodi di stimolazione. Confronto di FM1-43 della tintura di caricamento e scarico nell'errante terzo instar NMJ con depolarizzazione 1) alta [K+] di tutta la preparazione larvale (in alto), 2) di aspirazione, la stimolazione elettrica elettrodo del nervo motore (al centro) e 3) luce-driven attivazione delle channelrhodopsin mirati (ChR2) solo nei neuroni di motore (in basso). (A) il larvale NMJ etichettati con l'anti-marker di membrana presinaptica HRP:647 (blu, a sinistra), caricato con FM1-43 via alta [K+] depolarizzazione per 5 min (al centro) e poi scaricato via alta [K+] depolarizzazione per 2 min (B) Confronto con stimolazione elettrica del nervo elettrodo aspirazione con gli stessi periodi di stimoli per entrambi tintura FM1-43, carico e scarico. (C) mirati vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R espressione nei neuroni di motore attivato con il blu (470 nm) luce per gli stessi periodi di stimoli della tintura FM1-43 di carico e scarico. Asterischi si riferiscono a inserti in visualizzazione boutons ingrandimento superiore. La barra della scala è di 10 µm, con boutons sinaptici inserto allargata 3.5 X da pannelli principali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Notum mutanti mostrano ridotta FM tintura di caricamento in boutons sinaptici. FM1-43 caricati in terminali sinaptici di vagare terzo instar NMJ confrontando il controllo genetico (w1118) a Notum mutanti (NotumKO). (A) NMJ boutons etichettati con alta [K+] depolarizzazione di tutta la preparazione larvale (in alto) o aspirazione elettrodo stimolazione di un nervo di motore (in basso) in w1118 (a sinistra) e NotumKO (a destra). (B) Quantified caricato FM1-43 fluorescenza a NMJ come un grafico a dispersione confrontando l'alta [K+] depolarizzazione e stimolazione di aspirazione elettrodo nei controlli w1118 vs NotumKO mutanti. (C) Quantified caricato fluorescenza su base bouton-a-bouton come una trama di box-and-whisker confrontando alta [K+] depolarizzazione e stimolazione di aspirazione elettrodo nei controlli w1118 vs NotumKO . A due code t-test di Student sono stato eseguito per ogni confronto con p-valori visualizzati sui grafici. Le barre indicano media ± SEM fatta con prisma (versione 7.0 per Windows). I dati di stimolazione elettrica sono stati adattati con il permesso dal Kopke et al., sviluppo 144 (19): 3499-510, 2017. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: ultrastruttura sinaptica con FM tintura fotoconversione per contrassegnare vescicole. FM1-43 fluorescente può essere photoconverted ad un precipitato di elettrone-densi ossidato diaminobenzidina (DAB) per la visualizzazione tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM). (A) A diagramma schematico del metodo fotoconversione etichettare NMJ Drosophila dopo tintura FM1-43 attività-dipendente caricamento. (B) rappresentante TEM immagine di una bouton sinaptico wildtype a riposo (non stimolata). Nota densa popolazione di taglia uniforme SVs. (C) boutons sinaptici che sono stati stimolati con alta depolarizzazione salina [K+] per 5 min, senza fotoconversione (a sinistra) o con FM1-43 fotoconversione (a destra). Si noti la presenza di massa endosomal strutture, etichettato e senza etichetta. Boutons sinaptici (D) che sono stati stimolati elettricamente con un nervo di aspirazione elettrodo a 20 Hz per 5 min con nessun fotoconversione (a sinistra) o con FM1-43 fotoconversione (a destra). Si noti che le vescicole di tintura-caricato appaiono molto più adiacente scaricate vescicole scure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Alta [K+] Salina depolarizzazione stimolazione è di gran lunga la più semplice delle tre opzioni per tintura di FM di attività-dipendente in bicicletta, ma probabilmente il meno fisiologico29. Questo semplice metodo depolarizza ogni cellula accessibile nell'animale intero e così non permette studi diretti. Potrebbe essere possibile applicare localmente alta [K+] soluzione fisiologica con una micropipetta, ma questo sarà ancora depolarizzarsi cellule pre/post-sinaptica e probabile glia sinapsi-collegata1. Un'altra delle principale preoccupazioni è quella alta [K+] depolarizzazione unità rapida formazione di massa endosomi che solo raramente si vedono in boutons non stimolate. Tuttavia, alla rinfusa endosoma formazione è un meccanismo attivo bloccato da mutazioni29, che indica un processo vero e proprio fisiologico. Così, imaging FM1-43 con alta [K+] depolarizzazione utilizzabile per studiare in modo selettivo endocitosi di massa a livello delle sinapsi. Aspirazione degli elettrodi di stimolazione elettrica del nervo motore è un metodo molto più controllato. Ha il vantaggio che solo un fascio singolo assone è stimolato, e solo i termini presinaptici direttamente è depolarizzato (naturalmente, la fibra muscolare è quindi depolarizzata dall'azione del trasmettitore). Fornisce quindi un grande controllo interno di NMJs nello stesso animale che non vengono stimolate. Questo metodo consente di mantenere sotto stretto controllo i parametri di stimolazione, a differenza del metodo di stimolazione [K+] elevato, consentendo un confronto diretto con elettrofisiologia registrazioni4. Tuttavia, questa tecnica richiede attrezzature specializzate e un livello piuttosto elevato di abilità tecnica e pertanto è meno accessibile. Attivazione luce-driven di channelrhodopsin mirati (ChR2) ha il vantaggio di targeting neuroni selezionare30. Questo metodo non richiede alcuna familiarità con i metodi di elettrofisiologia e può essere fatto con attrezzature molto economico in ogni laboratorio, ma questo approccio richiede familiarità di base con la genetica della drosofila .

La scelta dei parametri di stimolazione è criticamente importante per la prova dinamica del ciclo SV eseguita una query all'interno di una gamma di circostanze genetiche con fenotipi altamente variabile1. Per tutti i metodi, l'external [Ca2 +] usato è un parametro fondamentale controllare la forza trainante della SV in bicicletta. Con il metodo di stimolazione [K+] alto, una scelta importante è [K+] utilizzato, che determina il grado di forza di depolarizzazione. Misure di Drosophila emolinfa indicano un [K+] di 5 mM e 90 mM è in genere la concentrazione più spesso scelto per attività stimolazione3,7,15,17 , 31. Tuttavia, un intervallo di [K+] da 30-90 mM è stato impiegato per variare la stimolazione forza5,16,32. Decisione di un altro parametro critico è la lunghezza della stimolazione alta [K+] per entrambi FM1-43, carico e scarico. Se l'intera popolazione di SV in bicicletta viene effettivamente caricata, o solo un sottoinsieme delle vescicole attivo7determina il periodo per il caricamento. Il periodo di scarico allo stesso modo dettami la percentuale di SVs che subiscono esocitosi nel periodo di stimolazione, che può rivelare o oscurare fenotipi mutanti dipendenti dal tasso cambia in SV ciclismo frequenza2. Con la stimolazione elettrica del nervo motore aspirazione elettrodo, scelte di parametri includono anche stimolazione tensione, frequenza, durata e impulso l'intervallo. Temporalmente modellato attività è un fattore determinante della SV ciclismo dynamics7e distinti pools SV pattern di stimolazione differenti è in grado di mobilitare in modo selettivo. Con mirate basate su luce ChR2 attivazione, le scelte includono tutto quanto sopra (con variabili di intensità della luce) e transgenici ulteriori opzioni illustrate nella sezione successiva. Con questi parametri, scelte viene controllo più sperimentale, ma anche una maggiore complessità tecnica.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) è un canale di luce-gated membrana permeabile a mono - e cationi bivalenti33. Se è selezionata la stimolazione ChR2, ci sono molte scelte da fare tra cui conducente Gal4, UAS-ChR2 costrutto e variabili di sorgente luminosa per l'attivazione del canale. Gamma di driver di Gal4 da onnipresente a altamente specifici. Ad esempio, onnipresente UH1-Gal4 (daughterless) vorrei esprimere ChR2 in ogni cellula, mentre CcapR-Gal4 (Janelia) unità ChR2 nel muscolo NMJ 6/7 ma non il muscolo 4 NMJ31,34. Questa selettività può essere utilizzata come un potente controllo interno. Allo stesso modo ci sono molte varianti di UAS-ChR2, tra cui ChR2-H134R (usato qui; il residuo mutato cause aumentato photocurrents)35, VChR1, ChIEF e molti più36. Ciascuna di queste varianti di canale ha proprietà distinte di luce gating, conduttanza, selettività ionica, cinetica e desensibilizzazione. Nota che alcuni costrutti contengono un tag fluorescente che poteva interferire con formazione immagine di FM. Ad esempio, l'UAS-ChR2-H134R usato qui è taggati con mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), ma non produce emissioni Amozone con FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) filtri di imaging. Parametro tecnico scelte includono la sorgente luminosa, la lunghezza d'onda e l'intensità per l'attivazione del canale. Un'opzione utilizzata qui è un LED emettitori blu a buon mercato, con stimolazione visivamente confermata testando le contrazioni muscolari. Siamo riusciti anche ad attivazione ChR2 con epifluorescenza, sebbene un scansione laser confocale non era sufficiente. Epifluorescenza potrebbe essere utilizzato nella stimolazione mirata (segmenti specifici anziché l'intero animale), ma i parametri di stimolazione sono difficili da controllare, mentre il LED collegato fino a un semplice stimolatore facilmente altera sia la durata e la frequenza della luce impulsi. Messa a fuoco la luce LED attraverso la porta di telecamera microscopio di dissezione permette più controllata, intensa stimolazione luminosa.

Spetta allo sperimentatore di decidere o meno di lasciare il nervo ventrali midollo/cervello intatto durante il paradigma di stimolazione. Abbiamo scelto di rimuovere l'intero sistema nervoso centrale per il confronto dei tre metodi utilizzati qui, ma a volte il cablaggio a Monte viene lasciato intatto15. Una complicazione è che l'attività neurale endogeno si verifica ogni volta che il sistema nervoso è lasciato intero. Il grado di questa attività è altamente variabile da animale a animale, dipende in larga misura le competenze di dissezione dello sperimentatore. Questa attività variabile può contribuire alla quantità di colorante FM1-43 che è caricato e scaricato, che non è pertanto esclusivamente dovuta alla stimolazione esogena impiegata15. Una complicazione di tecnica correlata è intatte larve dissecate contraggono la muscolatura in movimento fittizia, che questo spostamento interferisce notevolmente con formazione immagine NMJ. Questo movimento viene alleviato se viene rimosso il sistema nervoso centrale e anche attraverso l'applicazione di Ca2 +-libera soluzione fisiologica durante imaging4. Questi approcci utilizzati qui sono sufficienti a permettere eccellente FM1-43 colorante imaging nella preparazione NMJ. Tuttavia, alcuni sperimentatori scelgono di aggiungere farmaci per inibire la contrazione muscolare (ad es., rianodina, philanthotoxin-433), o utilizzare il potenziale di azione bloccanti (ad es., tetrodotossina)37,38. Una gamma di farmaci può essere utilizzata per manipolare in modo selettivo il ciclo SV, al fine di evidenziare alcuni passaggi, o accentuare fenotipi mutanti per esaminare meccanismi di neurotrasmissione. Ad esempio, alcuni sperimentatori hanno impiegato Veratridine (attiva tensione-gated di Na+ canali39) per aumentare il caricamento nel pool di riserva, Cyclosporin A (inibisce la calcineurina attività40) per migliorare la endocitosi SV, SV e Forskolin (attiva l'adenilato ciclasi41, che migliora la trasmissione sinaptica42) per aumentare la exo/endo Ciclismo Piscina7,43,44. Tali manipolazioni farmacologiche in grado di fornire ulteriori approfondimenti. Infine, priorità bassa FM1-43 può accadere in varia misura basata sulla qualità della dissezione, efficacia e stimolazione protocollo di lavaggio. Alcuni aggiungono un derivato sulfobutylated del β-ciclodestrina Advasep-745, o il fluoroforo acquose solforodamina46, per placare la fluorescenza aspecifica e migliorare il rapporto segnale--fondo.

Esistono numerose tecniche che possono accompagnare FM fluorescente di imaging ad ulteriore comprensione del ciclo SV (ad es., elettrofisiologia, synaptopHluorin, microscopia elettronica). Un esempio mostrato qui è FM fluorescenza fotoconversione che è utilizzato per studiare la SV ciclo dettagliatamente ultrastrutturale. SVs sono organizzati in diverse piscine che sono spazialmente e funzionalmente distinte2. La piscina pronto rilascio (RRP) contiene vescicole rilasciate immediatamente dopo stimolazione acuta. Una piscina più grande riciclaggio mantiene rilascio SV in condizioni di attività moderata. Un pool di riserva interna (RP) è assunto soltanto con stimolazione forte (apparentemente vicino non-fisiologica)2. Le piscine SV che vengono attivate dipendono dal tipo di stimolazione utilizzata47e rapporti da Drosophila NMJ utilizzando FM fotoconversione hanno rivelato spunti preziosi per le proprietà spaziali e funzionali di queste diverse piscine SV48. Fotoconversione FM può essere utilizzato per studiare piscine SV attivate sotto stimolazione diversi paradigmi e query domande come l'interazione di traffico lungo dibattuta tra gli endosomi e SVs49. Se lo sperimentatore è interessato nella formazione immagine di FM in combinazione con altre modifiche di attività-dipendente alla sinapsi, c'è un analogo riferito risolvibile della tintura FM1-43 (FM1-43FX). Questa sonda dovrebbe consentire uno correggere la drosofila NMJ dopo tintura di attività-dipendente di caricamento e poi seguire con anticorpo etichettatura per verificare le correlazioni tra livello di attività bouton (fluorescenza di tintura di FM) ed espressione di attività-dipendente di un proteina di interesse. In futuro, sarà estremamente gratificante per esplorare metodi aggiuntivi che potrebbero consentire la combinazione di tintura FM imaging con altri approcci di imaging alla sinapsi modello drosofila NMJ bella.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Ringraziamo i membri Broadie Lab per i contributi a questo articolo. Questo lavoro è stato supportato da NIH R01s MH096832 e MH084989 di K.B. e nella comunione predoctoral NIH F31 MH111144 D.L.K

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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References

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Tintura di FM in bicicletta alla sinapsi: confronto tra alto potassio depolarizzazione, elettrica e stimolazione Channelrhodopsin
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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