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Neuroscience

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Abstract

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K+] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Introduction

Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen1verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken2. Diese Bläschen dock an der präsynaptischen Membran Fusion Website aktive Zonen (AZs), wo Exozytose die Glutamat-Neurotransmitter-Freigabe für Trans vermittelt-synaptische Kommunikation. Anschließend werden die SVs für wiederholte Exo/Endozytose Zyklen aus der Plasmamembran über recycling-Kiss-and-Run oder Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) abgerufen. Die Drosophila NMJ ist leicht zugänglich und gut geeignet für Isolierung und Charakterisierung von SV Zyklus Mutanten. Mit vorwärts genetischer Bildschirme, führten neue Mutationen zur Identifizierung neuer Gene entscheidend für die SV-Zyklus3. Darüber hinaus haben reverse gentechnische Ansätze beginnend mit bereits bekannten Genen, die Aufklärung des neuen SV-Zyklus-Mechanismen durch die sorgfältige Beschreibung der Mutant Radfahren Phänotypen4geführt. Die Drosophila NMJ ist nahezu ideal als experimentelle synaptischen Vorbereitung für SV Endozytose und Exozytose Mechanismen über Methoden, um optisch Track Vesikel Radfahren während Neurotransmission sezieren.

Eine Reihe von fluoreszierenden Marker ermöglichen visuelle Verfolgung von Vesikeln während des Radfahrens Dynamik, aber das vielseitigste sind FM-Farbstoff-Analoga, die zuerst von Mao, F., Et al.synthetisiert wird. 5. strukturell FM Farbstoffe enthalten einen hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schweif, verbunden durch einen aromatischen Ring mit einem Mittelbereich spektrale Eigenschaften verleihen. Diese Styryl Farbstoffe in Membranen reversibel zu partitionieren, nicht "flip-flop" zwischen Membran Flugblätter und so sind nie frei in das Zytosol, und sind weit mehr fluoreszierend in Membranen als Wasser5. Reversible Einfügung in ein Lipid Bilayer bewirkt eine 40-fold Fluoreszenz-6. Bei neuronalen Synapsen bestehen classic FM Farbstoff Kennzeichnung Experimente aus Baden die synaptische Vorbereitung mit dem Farbstoff während depolarisierende Stimulation Farbstoff über SV Endozytose geladen. Externen Farbstoff ist dann weggespült und der SV-Zyklus ist ein Kalzium-freien Ringer-Lösung geladen Synapsen7Image verhaftet. Eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-frei Bad löst FM durch Exozytose, ein Prozess, der verfolgt werden kann, durch die Messung der Fluoreszenz Intensität verringern. SV-Populationen aus einem einzigen vesikels zu Pools mit Hunderten von Vesikeln können quantitativ überwachten6,7sein. FM-Farbstoffe wurden aktivitätsabhängige Mobilisierung von funktionell unterschiedliche SV-Pools zu sezieren, und Kiss-and-Run vs. Radfahren8,9CME vergleichen verwendet. Die Methode wurde geändert, um separat Assay hervorgerufen, spontane und Miniatur synaptischen Zyklus Aktivitäten (mit hochsensiblen Geräten sehr kleine Fluoreszenz Veränderungen erkennen und reduzieren Immunofluoreszenz)10. Assays der Ultrastrukturforschung Ebene durch Photoconverting das Fluoreszenzsignal FM in ein Elektron-Dichte Label für Transmission Electron Microscopy11,12,13,14 erweiterbar auf .

Historisch, Baden synaptischen Vorbereitungen in einer hohen Konzentration von Kalium (nachstehend als "hoch [K+]" genannt) wurde die Methode der Wahl für depolarisierende Stimulation um SV Radfahren induzieren; von der Frosch cholinerge NMJ-5, bis hin zu kultiviert Nagetier Gehirn hippocampal Neuronen15, bis die Drosophila glutamatergen NMJ Modell16,17. Dieser hohe [K+] Ansatz ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist daher für die meisten Labors zugänglich, aber hat Einschränkungen für die Anwendung und Interpretation der Daten. Eine viel mehr physiologisch angemessene Methode ist mit Saug-Elektrode elektrische Stimulation des Nervs4,5,12. Dieser Ansatz treibt Aktionspotential Vermehrung zur direkten Stimulation des Nervus präsynaptischen terminal und Ergebnisse können direkt gegenüber elektrophysiologische Tests der Neurotransmission Funktion13,14, 15, sondern erfordert spezialisierte Ausrüstung und ist technisch wesentlich schwieriger. Mit dem Aufkommen der optogenetik hat die Verwendung von Channelrhodopsin neuronale Stimulation zusätzliche Vorteile, einschließlich enge räumlich-zeitliche Begrenzung der Kanal-Ausdruck mit Hilfe der binären Gal4/UAS-System20. Dieser Ansatz ist technisch einfacher als Saug-Elektrode Stimulation und erfordert nichts weiter als eine sehr billige LED-Lichtquelle. Hier beschäftigen wir Bildgebung FM1 / 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridiniumdichromat Dibromide) zu sowohl vergleichen und diese drei verschiedenen stimulationsmethoden bei Drosophila NMJ: einfach hoch [K+ ], anspruchsvolle Elektro- und neue Channelrhodopsin Ansätze.

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Protocol

1. Larvenstadium Kleber Dissektion

  1. Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials).
  2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten.
  3. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1, unten), in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
  4. Bereiten Sie die Kleber-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillare mit einem standard Mikroelektrode Abzieher zu erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
  5. Sanft brechen Sie die Mikropipette Spitze und am anderen Ende, fügen Sie 2 ft von flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, ID 3/32" Außendurchmesser OD; 1/32" Wand; Tabelle der Materialien) mit Mund passend (P2-PIPETTENSPITZE).
  6. Füllen Sie einen kleinen Behälter (0,6 mL Eppendorf Tube GAP) mit einem kleinen Volumen (~ 20 µL) des Klebers (Table of Materials) in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
  7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl21 CaCl2, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic Säure (HEPES) pH 7,2.
  8. Fügen Sie Anti-Meerrettich Peroxidase (HRP) Antikörper konjugiert, Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; verdünnter 01:10 aus einem Bestand von 1 mg/mL) für die Kennzeichnung der NMJ präsynaptischen Terminal während Dissektion21,22.
  9. Mit einem feinen Pinsel (Größe 2), entfernen Sie eine wandernde dritte Instar aus der Lebensmittel Durchstechflasche und setzen auf das Deckglas Elastomer beschichtet.
  10. Füllen Sie den Glas Mikropipette Tipp mit einem kleinen Volumen des Leims mit Unterdruck erzeugt, durch den Mund mit Anhang (Schritt 1.5).
  11. Stellung Larve dorsalen Seite nach oben mit Zange und Leim, den Kopf auf die Elastomer-Beschichtung Deckglas mit einem kleinen Tropfen Kleber mit positiver Luftdruck durch den Mund.
  12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende des die Larve, die dafür sorgen, dass das Tier gestreckt wird straff zwischen die zwei Kleber-Anlagen.
  13. Mit einer Schere (Messer 3 mm; Tabelle der Materialien), machen Sie einen horizontalen Schnitt (~ 1 mm) am Hinterteil und einem vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
  14. Mit feinen Pinzette (#5, Tabelle der Materialien), sanft entfernen dorsalen Luftröhre, Darm, dicken Körper und andere innere Organe für die Muskulatur.
  15. Wiederholen Sie für die vier Körperwand Klappen, und achten Sie auf sanft die Körperwand sowohl horizontal als auch vertikal dehnen kleben.
  16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit Pinzette, schneiden Sie die motorischen Nerven vorsichtig mit der Schere aus und dann entfernen Sie vollständig zu die VNC.
  17. Ersetzen Sie die Dissektion Kochsalzlösung mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (identisch mit der oben genannten Dissektion Kochsalzlösung ohne CaCl2), SV stoppen Radfahren.

2. Option 1: High [K+] FM Farbstoff be-

  1. Fügen Sie aus einem FM1-43-Stammlösung (4 mM) 1 µL bis 1 mL 90 mm KCl-Lösung (hoch [K+] in Dissektion Kochsalzlösung) für eine Endkonzentration von 4 µM hinzu.
  2. Mit einer Pipette ersetzen die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung in der bildgebenden Kammer mit der hohen [K+] FM Farbstofflösung, SV Endozytose Farbstoff Aufnahme zu stimulieren.
  3. Starten Sie sofort eine digitale Zeitschaltuhr für die vorher festgelegten Dauer des hohen [K+] depolarisierende stimulationsdauer (zB., 5 min; ( Abbildung 2).
  4. Um eine gesunde Larven Vorbereitung bestätigen, beachten Sie die starke Kontraktionen der Muskulatur für die Dauer des hohen [K+] Depolarisation.
  5. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die hohe [K+] FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  6. Waschen in rascher Folge mit dem Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K+] FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  7. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.

(3) Imaging: Konfokale Mikroskopie

  1. Verwenden Sie eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem 40 X Wasser eintauchen soll Bild NMJ Farbstoff Fluoreszenz (andere Mikroskope können verwendet werden).
  2. Bild Muskel 4 NMJ Abdominalsegmente 2-4 (andere NMJs können abgebildet werden) und sammeln Bilder mittels geeigneter Software (Table of Materials).
  3. Benutzen Sie einen HeNe 633 nm Laser HRP:647 (mit lang-Pass-Filter > 635 nm) sowie ein Argon 488 nm Laser FM1-43 (mit Bandpass Filter 530-600 nm) begeistern zu begeistern.
  4. Operativ bestimmen Sie optimale Gain und Offset für beide Kanäle.
    Hinweis: Diese Einstellungen bleibt konstant, während der Rest des Experiments.
  5. Nehmen Sie einen konfokalen Z-Stapel durch die gesamte ausgewählte NMJ von HRP markiert oben nach unten des synaptischen Terminals.
  6. Beachten Sie vorsichtig den NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskeln) um überschüssige, die exakt gleichen NMJ sicherzustellen, nachdem FM färben entladen.

4. High [K+] Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung mit hohen [K+] Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff), Laufwerk Depolarisation, SV Exozytose und Dye-Release.
  2. Sofort eine digitale Zeitschaltuhr für den vorab festgelegten Dauer der hohen [K+] Stimulation (zB., 2 min; ( Abbildung 2).
  3. Nach Ablauf die Timer-Zeit sofort die hohe [K+] Kochsalzlösung zu entfernen und ersetzen Sie durch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  4. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K+] Kochsalzlösung wird vollständig entfernt.
  5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  6. Seien Sie sicher, die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

5. Option 2: Elektrische Stimulation FM Farbstoff be-

  1. Vorbereiten einer saugen Pipette mit der Mikroelektrode Abzieher (Table of Materials) erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
  2. Feuer-polnische Mikroelektrode Tipp mit einer Mikro-Schmiede bis ein einzelner motorischer Nerv mit einem festen Sitz abgesaugt werden kann.
  3. Eine defekte Saug Pipette auf den Elektrodenhalter aufschieben und legen auf den langen, flexiblen Kunststoffschlauch und eine Spritze.
  4. Stimulator Parameter einstellen (zB., 15 V, 20 Hz-Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min (Abbildung 2) oder 1 min (Abbildung 3)).
  5. Ersetzen Sie die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl2; 4 µM) auf dem Prüfstand der Elektrophysiologie.
  6. Setzen Sie die Vorbereitung auf den Mikroskoptisch und erhöhen Sie die Stufe zu, bis die Larve und Saug Pipette im Fokus (Eintauchen in Wasser Objektiv 40 X) sind.
  7. Saugen Sie auf einer Schleife der Schnitt motorischen Nerven innervieren die ausgewählten Hemisegment mit Unterdruck durch die Spritze in die Absaugung Elektrode erzeugt.
  8. Testen Sie die Saug-Elektroden-Funktion mit einem kurzen Stoß der Stimulation während der visuell Überwachung für die Kontraktion der Muskeln in den ausgewählten Hemisegment.
  9. Fördern Sie die motorische Nerven mit ausgewählten Parametern (Schritt 5.4), SV Endozytose fahren und FM1-43 Farbstoff Aufnahme (Abbildung 2).
  10. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die FM1-43 Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  11. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen bildgebenden Protokoll von oben.
  12. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

6. elektrische Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie die Ca2 +-frei Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff) und setzen Sie die Vorbereitung wieder auf die Elektrophysiologie-Rig-Bühne.
  2. Legen Sie die Parameter der Stimulator für die Entladung (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2) bzw. 20 s (Abbildung 3)).
  3. Saugen Sie die gleichen motorische Nerven in die gleichen Elektrode wie oben beschrieben, und dann zu stimulieren Sie, um SV Exozytose und FM1-43 Farbstoff Freigabe zu aktivieren.
  4. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
  5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  6. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

7. Option 3: Channelrhodopsin Stimulation FM Farbstoff be-

  1. ChR2 exprimierenden Larven auf Lebensmittel, die die ChR2 Co-Faktor All-Trans Retinal (gelöst in Ethanol; 100 µM Endkonzentration) zu erhöhen.
  2. Legen Sie die Larven Vorbereitung in der Plexiglas-Kammer auf eine Dissektion Mikroskoptisch mit einem Kamera-Anschluss ausgestattet.
  3. Befestigen Sie eine blaue LED (470 nm; Tabelle der Materialien) ein programmierbarer Stimulator mit einem Koaxialkabel und die LED in den Kamera-Anschluss.
  4. Fokus der blaue LED Lichtstrahl auf die seziert Larven-Funktion mit der Mikroskop-Zoom-Funktion.
  5. Ersetzen Sie die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl2; 4 µM) auf der optogenetische Bühne.
  6. Legen Sie die LED-Parameter mit dem Stimulator (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 Minuten (Abbildung 2)).
  7. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z.B., 5 min; ( Abbildung 2).
  8. Wenn der Timer stoppt, schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  9. Waschen in rascher Folge mit dem Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) um sicherzustellen, das FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  10. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop mit imaging-Protokoll von oben.
  11. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

8. Channelrhodopsin Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne Farbstoff FM1-43) auf die Dissektion Mikroskoptisch mit Kamera-Anschluss LED konzentrierte sich auf die Larve.
  2. Legen Sie den Stimulator Parameter für entladen (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2)).
  3. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z. B. 2 min; ( Abbildung 2).
  4. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  5. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
  6. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  7. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

9. Fluoreszenz Quantifizierung

  1. Laden Sie das Bild in Bild J (NIH-open-Source) und erstellen Sie eine maximale Intensität Projektion durch Klick auf Bild | Stapel | Z-Projekt.
  2. Mit der Anti-HRP:647-Kanal, gehe zu Bild | Anpassen | Schwelle und schieben Sie den oberen Symbolleiste bis nur der NMJ markiert ist.
  3. Klicken Sie mit dem Zauberstab-Werkzeug auf den NMJ. Wenn die NMJ diskontinuierlich ist, halten Sie die Shift-Taste und wählen Sie alle Teile.
  4. Die FM1-43-Farbstoff-Kanal als Hintergrundbild und gehen Sie zu analysieren | Messung die Fluoreszenzmessung zu erhalten.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 9.1-9.4 für das "entladen" Bild aus der gleichen NMJ (identifizierten Segment, Seite und Muskeln).
  6. Den Anteil des Farbstoffes zu erhalten, die entladen wurde, nehmen Sie das Verhältnis der Intensitäten/aufgeladen Fluoreszenz.
    Hinweis: Dieses Verfahren kann geändert werden, um Fluoreszenz auf Bouton-pro-Bouton Basis mit der "Oval" oder "Freihand" Auswahlwerkzeuge zu analysieren. Hintergrundfluoreszenz kann durch Abtasten der Muskel Fluoreszenz subtrahiert werden. Agenten können auch hinzugefügt werden, um diesen Hintergrund zu reduzieren.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und die Vorbereitung gebadet in einer 4 µM-Lösung von FM1-43 (Abbildung 1 b, rosa). Die Zubereitung wird dann im Beisein von FM Farbstoff unter Verwendung eines der drei möglichen Optionen zum Laden des Farbstoffs über aktivitätsabhängige SV Endozytose (Abbildung 1cI-III) stimuliert. Next, FM Farbstoff Radfahren wird verhaftet, mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung und ein bestimmtes NMJ-Terminal, der mit FM Farbstoff geladen wurde ist abgebildet, mit einem konfokalen Mikroskop ("geladene Bild"; Abbildung 1-d). In diesem Fall der Muskel gewählten 4 NMJ mit der schematischen anzeigen Platzierung der Nerven, NMJ terminal Verzweigung und FM geladen synaptischen Boutons. Die synaptische Vorbereitung wird ein zweites Mal mit der gleichen Methode ausgewählt, über, aber in Ermangelung von FM Farbstoff SV Exozytose und FM1-43 Version (Abbildung 1e) angeregt. Das gleiche identifiziert NMJ (Muskel-4 NMJ in diesem Beispiel) ist dann neu aufgespielt mit dem synaptischen Label HRP:647 und restliche FM1-43 Vesikel Signal ("entladen Bild"; ( Abb. 1f). Der Experimentator bestimmt die Stärke und Dauer der Be- und Entladung Phasen um die Maße für einen spezifischen Assay oder mutierten Zustand zu optimieren. Fluoreszenzintensität wird nach dem Be- und Entladen (Abbildung 1d, 1f) quantifiziert, um die Messungen der synaptischen Farbstoff Endozytose und Exozytose der Prozentsatz der geladen FM Farbstoff veröffentlicht. Analysen können für die gesamte NMJ oder einzelne Boutons erfolgen.

FM-Farbstoff Radfahren kann auf drei verschiedene Arten stimuliert werden: (1) hohe [K+] saline Depolarisation der gesamten Vorbereitung, 2) Saug Elektrode Stimulation des motorischen Nervs oder (3) leichte angetriebene Aktivierung des gezielten Channelrhodopsin (ChR2; ( Abbildung 2). Für einen direkten Side-by-Side-Vergleich aller drei Methoden wir mit jeder Ansatz für 5 min in Anwesenheit von FM1-43 (laden) und dann für 2 min in der Abwesenheit von FM1-43 (entladen) stimuliert, und HRP-Label NMJs mit identischen konfokale Einstellungen ( abgebildet Abbildung 2). Die hohe [K+] saline Depolarisation Methode folgt das weit verbreitete FM1-43 Protokoll für die Drosophila Larven NMJ-23, außer wir Kleber statt Pins für die Larven Dissektion verwenden. Der Klebstoff verhindert Interferenzen mit dem Mikroskop Ziele und ermöglicht eine präzisere Bestimmung der Körperwand Spannung, aber erfordert eine moderate Lernkurve. Alle drei Methoden erzeugen starke und konsistente fluoreszierende Signale in der NMJ synaptische Bouton Laube und im einzelnen synaptischen Boutons (Einsätze). Die hohe [K+] saline Depolarisation Methode bewirkt, dass alle NMJs FM in die Larve geladen sein, da es jedes Neuron im Tier (Abb. 2A, Mitte) erschüttert. Die Nerv Saug Elektrode elektrische Stimulation Methode treibt nur in einer einzigen Hemisegment der Larven, wofür die entsprechenden innervieren, die motorischen Nerven gewesen ist (Abbildung 2 b, Mitte) angeregt. Unstimulierte Segmente im selben Tier unterscheiden sich die HRP Zeichennutzung aber enthalten keine beobachtbaren Fluoreszenzfarbstoff beladen und dienen als hervorragende interne Kontrollen. Die optogenetische ChR2 Methode produziert gezielte Depolarisation abhängig von der transgenen Gal4 Fahrer eingesetzt (Abbildung 2). Hier war der Fahrer eines vesikuläre Glutamat-Transporters (Vglut) Gal4, so dass alle glutamatergen Neuronen mit blauen Lichtstimulation, einschließlich aller der glutamatergen Motoneuronen depolarisiert werden. Dadurch werden alle NMJs mit FM1-43 Farbstoff in diesem Beispiel (Abb. 2, Mitte) geladen. Zellspezifische Treiber können spezifische NMJs beschriften und lassen andere stumme für interne Kontrolle verwendet werden.

FM Farbstoff entladen erzielte über die gleiche Methode, die verwendet wurde, um den Farbstoff zu laden. Bei der ersten Methode wurde die Larven Vorbereitung einfach getaucht in hohen [K+] Kochsalzlösung bei fehlender FM1-43 zu depolarisieren Zellen, Laufwerk SV Exozytose, ein- und Ausladen der synaptischen Terminals (Abb. 2A, rechts). Wir wählen in der Regel eine kürzere entladen (2 min), also entladen ist partiell und Klemmen in den UKW-Kanal sichtbar bleiben. Saug Elektrode elektrische Stimulation entladen ist erheblich schwieriger, weil es beinhaltet die Rückkehr in die gleiche Hemisegment, Ermittlung des gleichen Nervs und neu stimulieren die Nerven in der Abwesenheit von FM1-43, Farbstoff entladen (Abb. 2 b zu fahren , nicht wahr). Beachten Sie, dass der Farbstoff entladen wieder teilweise war. Die ChR2 Entladung bringt eine zweite Periode des blauen LED-Beleuchtung der Larven Vorbereitung in Ermangelung der FM1-43 zu aktivieren die Kanäle, die Motoneuronen depolarisieren und SV Exozytose Farbstoff Version (Abbildung 2, rechts) zu stimulieren. Mit dieser Zeitskala entladen (2 min), jede davon depolarization Methoden entladen nur einen Prozentsatz der geladenen FM1-43-Farbstoff, mit dem hohen [K+] stärkste und ChR2 schwächsten in Fahrt Farbstoff Release (Abbildung 2). Wir messen die LED Lichtstärke verwendet (140 µW/mm2), die in der veröffentlichten Strecke (20-1000 µW/mm2)24,25,26war. ChR2 wird maximal ~ 1 mW Beleuchtung von 50-200 mW-Lichtquellen mit ChR2 Wirksamkeit auch abhängig von der ATR-Konzentration zugeführt Larve27,28aktiviert. So kann ChR2 Stimulation Stärke manipuliert werden. Darüber hinaus kann die Beziehung nicht so mit anderen Stimulation stärken, Fristen oder Genotypen bleiben. Wenn der Experimentator arbeitet mit einer Mutante, die SV Endozytose abgenommen hat oder Exozytose ungewöhnlich schnell, die Stimulationsparameter müssen möglicherweise geändert werden, um eine sichtbare Signal nach dem Entladen zu gewährleisten. Das Anti-HRP-Label erlaubt es, den NMJ noch in das völlige Fehlen des FM-Signals zu identifizieren, aber das ist nicht ideal für die Quantifizierung. Im Prinzip könnte die Entlade Stimulation eines anderen Typs von der Beladung Anregung.

Wir studierten vor kurzem den Verlust der sekretierten synaptischen Deacylase Notum Auswirkungen auf die SV-Zyklus mit Elektrostimulation4. Hier erweitern wir diese Analyse (1) hohe [K+] Depolarisation und (2) Absaugung Elektrode motorischen Nerv stimulationsmethoden (Abbildung 3) zu vergleichen. Wir finden, dass beide Methoden geben ein ähnliches Ergebnis, zeigt reduziert FM1-43 Farbstoff in eine Notum null Mutante laden; Allerdings unterscheidet sich der Grad des Phänotyps zwischen den beiden Methoden. Nach der Depolarisation mit hohen [K+] Kochsalzlösung für fünf Minuten gibt es ein starken Rückgang der geladenen Fluoreszenzintensität zwischen genetischen Hintergrund Steuerung (w1118) mit hohen und Notum null Mutanten (NotumKO ) mit niedrigen Niveaus (Abbildung 3A, oben). Quantifizierten Messungen wird normalisierte FM Fluoreszenzintensität in HRP skizzierten NMJ Terminals bei fehlender Notum (w1118 1,0 ± 0,05 vs. NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p deutlich reduziert. < 0,0001; Abb. 3 b). Nach der elektrischen Stimulation bei 20 Hz für 1 min finden wir einen unbedeutenden Rückgang geladen FM1-43 Intensität zwischen Steuerelementen und Notum Nullen bei der Quantifizierung der ganze NMJ Fluoreszenz (w1118 1,0 ± 0,05 vs. NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Abb. 3A, B). Messbetrieb Farbstoff Aufnahme auf Tagesbasis Bouton-pro-Bouton, finden wir eine signifikante Abnahme der Farbstoff beladen mit den beiden Methoden. Quantifizierten Messungen nach Stimulation mit hohen [K+] Kochsalzlösung, normalisierte FM Fluoreszenzintensität pro Bouton erheblich gesenkt (w1118 1,0 ± 0,02 vs. NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0,0001; Abbildung 3). Nach der elektrischen Stimulation, normalisierte Fluoreszenzintensität pro Bouton auch erheblich gesenkt, wenn auch in einem geringeren Grad (w1118 1,0 ± 0,02 vs. NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; Abbildung 3).

Die Ergebnis-Unterschiede zwischen den zwei Paradigmen der Stimulation möglicherweise eine Reihe von Faktoren zurückzuführen. Erstens die Stärke der Stimulation ist vermutlich größer mit hoch [K+] im Vergleich zu elektrischen motor Nervenstimulation. Elektrophysiologie-Aufnahmen nicht in Anwesenheit der hohen [K+] Kochsalzlösung durchgeführt werden, sondern die Larven Neuromusculature ist eindeutig robust stimuliert, wie Muskelkontraktionen stark und kontinuierlich während der gesamten 5 min Baden sind. Allerdings wissen wir nicht die Kraft oder die Häufigkeit der Stimulation. Im Gegensatz dazu wird die elektrische Stimulation viel mehr mit der Benutzer die Wahl der genauen Spannung Stärke und Häufigkeit der Stimulation gesteuert. Zweitens war die Anregung Dauer länger mit hoch [K+] im Vergleich zu elektrischen Nervenstimulation (Abbildung 3). Wir entschieden uns für 1 min von 20 Hz elektrische Stimulation nach wiederholten versuchen. Nach 1 min Farbstoff beladen war ein starker und zuverlässiger FM1-43-Signal, so wir das Paradigma für unsere Studie4, wählten obwohl 5 min der Stimulation eine noch stärkere Fluoreszenzsignal (Abbildung 2 gab). Somit trägt die Länge der Stimulation Paradigma wahrscheinlich die Größenordnung Variabilität im FM1-43 beladen zwischen hohen [K+] und elektrische Stimulation (Abb. 3 b, C). Obwohl die hohe [K+] Methode einen robusteren Phänotyp Notum Mutanten zeigte, haben wir noch die elektrische Methode wegen der größeren Kontrolle4verwendet. Es gibt viele Parameter, wie Stärke, Häufigkeit und Dauer der Stimulation zu kontrollieren, und diese Einstellungen müssen entschieden werden, basierend auf den Mutanten und die Frage. Zum Beispiel die Stimulation Methode Wahl hängt möglicherweise SV Pool verhört7 und die aktivitätsabhängige untersucht,10.

Nach FM1-43 in den NMJ Terminal geladen kann eine Fluoreszenz-Farbstoff-Ladungszustand herstellen das Elektron-Dichte Signal für Elektronenmikroskopie (Abbildung 4) einsetzen. Bei dieser Methode ist die Farbstoff beladen Vorbereitung intensiv fluoreszierenden Licht in Gegenwart von Diaminobenzidine (DAB), mit der reaktiven Sauerstoffspezies aus der FM-Farbstoff oxidierende DAB erstellen eine dunkle Niederschlag (Abb. 4A)11ausgesetzt. Bitte finden Sie im Jupiter-Artikel Ladungszustand Styryl Farbstoffe für komplette Details12. Der Vorteil dieser Methode ist, dass SVs klar auf Ultrastrukturforschung Ebene aufgedeckt werden, obwohl der SV-Zyklus natürlich mit statischen Elektronenmikroskop Bildgebung verhaftet wird. In Ermangelung der Stimulation synaptischen Boutons bei Drosophila NMJ sind dicht mit Vesikeln geladen (~ 40 nm im Durchmesser; Abbildung 4 b), mit dem seltenen Auftreten von erweiterten Organellen (>100 nm Durchmesser) vermutet, Radsport Endosomen. Hoch [K+] Kochsalzlösung depolarisierende Stimulation stark ändert dieses Profil mit einer teilweisen Erschöpfung der SV-Bevölkerung und die rasche Ansammlung von zahlreichen erweiterten Organellen (>100 nm Durchmesser) dachte Masse abgeleitet Endozytose von der Plasmamembran (Abbildung 4, Links). Obwohl ähnliche Fächer in unstimulierte Steuerelemente vorhanden sind, stellt die hohe Dichte an diese Organellen nach hohen [K+] saline Depolarisation die Sorge, dass dies möglicherweise eine nicht physiologische Reaktion. Saug-Elektrode elektrische Stimulation des motorischen Nervs ist relativ effizienter im Abbau der SV-Bevölkerung und nicht mehr der erweiterten Endosomal Vesikel (Abbildung 4, Links) zu produzieren. Dies deutet darauf hin, dass die Masse Endozytose angetrieben durch hohe [K+] Depolarisation hilft die SV Bevölkerung während intensiver Nachfrage zu halten.

FM1-43 Ladungszustand kann erreicht werden, mit hohen [K+] saline Depolarisation oder Saug Elektrode elektrische Stimulation des motorischen Nervs, um synaptische Ultrastruktur relativ zu einem ruhenden Bouton (Abbildung 4) zu vergleichen. Mit hoher [K+] depolarisierende Stimulation, individuelle SVs und erweiterten Vesikel (>100 nm im Durchmesser) kann mit der Elektron-Dichte DAB überstürzten folgende lichtgetriebenen Ladungszustand (Abbildung 4, rechts) gekennzeichnet werden. Aus unbekannten Gründen ist die erweiterten Vesikel-Membran in der Regel weniger dicht als die kleineren SV Membran beschriftet. Darüber hinaus SVs erscheinen oft gefüllt mit der DAB-Niederschlag, anstatt nur die Membran, aber das macht sie viel leichter zu unterscheiden, die unbeschriftete Vesikel. Mit Saug-Elektrode Stimulation des motorischen Nervs kann Radfahren SV Bevölkerung auch relativ unbeschriftete SVs (Abbildung 4, rechts) gekennzeichnet werden. Mit elektrischer Stimulation vergrößert Vesikel (>100 nm Durchmesser) bilden sich keine Infektionserreger in Boutons und konsequent, die Membranen in der vermuteten Endosomen sind nicht von FM1-43 Ladungszustand beschriftet. Als sind oben, Radsport SVs in der Regel gefüllt mit DAB Niederschlag in einer etwas verdeutlichen Mode und daher leichter unterscheidbar von SVs, die nicht während der Stimulation (Abbildung 4, rechts) gebildet haben. Wir haben noch nicht versucht, Ladungszustand nach ChR2 Stimulation. Mit verschiedenen Zeit-Kurse der Stimulation erlaubt FM1-43 Farbstoff Ladungszustand bestimmen wo SVs gebildet werden, wie SVs verschleppt werden, und das Timing der Bewegung zwischen verschiedenen räumlichen Pools innerhalb der synaptische Bouton. Der Vergleich von [K+] und Nervenstimulation erlaubt das Sezieren von Massen- und einzelne SV Endozytose Mechanismen.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm der FM1-43 Farbstoff laden Protokoll bei Drosophila NMJ. Die Larven Kleber Dissektion produziert eine abgeflachte Neuromusculature Vorbereitung, segmentale Nerven von der ventralen Mittellinie (Vm), die Hemisegmentally Projektion wiederholt mit den ventralen Nervenstrang (VNC) Körperwand Muskel-Arrays (Schritt ein). Das VNC ist freigeschnitten und die gesamte Larven Dissektion wird dann in die rosa FM1-43-Lösung (4 µM) in Vorbereitung für die Stimulation (Schritt b) inkubiert. FM1-43 wird dann geladen mit einem ausgewählten Stimulation Paradigma (Schritt 3); mit den Optionen für hohe [K+] Depolarisation der gesamten Larve (cI) Saug-Elektroden Stimulation eines einzelnen motorischen Nervs (cII) oder lichtgetriebenen Aktivierung von zielgerichteten Channelrhodopsin (cIII). FM1-43 Einarbeitung wird verhaftet, mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung und der Farbstoff beladen NMJ abgebildet (Schritt d). Eine zweite Stimulation erfolgt dann ohne FM1-43 in der Badewanne, Farbstoff synaptischen Vesikel Exozytose (Schritt e) zu fahren. Die gleichen NMJ ist dann neu aufgespielt, um das Entladen synaptischen Terminal (Schritt f) assay. Fluoreszenz-Intensität wird vom geladen und Entladen NMJs, SV Endozytose und Exozytose Ebenen SV quantifizieren gemessen. Die Bodenplatte zeigt die Konstruktionsparameter und Dimensionen für die transparente Acryl-Kammer für diese Studien verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: FM färben be- und Entladen Vergleich der alle stimulationsmethoden. Vergleich der FM1-43 Farbstoff beladen und Entladen in den wandernden dritte Instar NMJ mit 1) hoch [K+] Depolarisation der gesamten Larven Vorbereitung (oben), (2) Saug-Elektroden elektrische Stimulation des motorischen Nervs (Mitte) und (3) lichtgetriebenen Aktivierung der gezielte Channelrhodopsin (ChR2) nur in Motoneuronen (unten). (A) die Larven NMJ beschriftet mit der Anti-HRP:647 präsynaptischen Membran Marker (blau, Links), über hohe [K+] Depolarisation für 5 min (Mitte) mit FM1-43 geladen und dann entladen über hohe [K+] Depolarisation für 2 min. (B) Vergleich mit Saug-Elektrode elektrische Nervenstimulation mit denselben reizen Perioden für beide FM1-43 Farbstoff be- und entladen. (C) gezielte Vglut-Gal4>FH-ChR2-H134R Ausdruck in Motoneuronen aktiviert mit blau (470 nm) Licht für die gleichen Zeiträume der Reize von FM1-43 Farbstoff be- und entladen. Sternchen beziehen sich auf Einsätze, die höhere Vergrößerung Boutons anzeigen. Der Maßstab beträgt 10 µm, mit Einschub synaptischen Boutons vergrößert 3.5 X von Hauptbereiche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Notum null Mutanten zeigen reduzierte FM Farbstoff in synaptischen Boutons laden. FM1-43 in synaptischen Terminals auf der Wanderschaft geladen dritte instar NMJ vergleicht die genetische Kontrolle (w1118), Notum null Mutanten (NotumKO). (A) NMJ Boutons mit hohen [K+] Depolarisation der gesamten Larven Vorbereitung (oben) oder Saug Elektrode Stimulation von einem motorischen Nerv (unten) in w1118 (links) und NotumKO (rechts) gekennzeichnet. (B) Quantified geladen FM1-43 Fluoreszenz pro NMJ als Scatterplot vergleicht die hohe [K+] Depolarisation und Saug Elektrode Stimulation in w1118 Kontrollen vs. NotumKO Mutanten. (C) Quantified geladen Fluoreszenz auf Bouton-pro-Bouton Basis als Box-Whisker-Plot Vergleich hohen [K+] Depolarisation und Saug Elektrode Stimulation in w1118 Kontrollen vs. NotumKO . Schülers zweiseitigen t-Tests wurden durchgeführt für jeden Vergleich mit p-Werte in den Diagrammen angezeigt. Balken zeigen den Mittelwert ± SEM mit Prisma (Version 7.0 für Windows) gemacht. Die elektrische Stimulation-Daten wurde angepasst, mit freundlicher Genehmigung von Kopke Et Al., Entwicklung 144 (19): 3499-510, 2017. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Synaptic Ultrastruktur mit FM Farbstoff Ladungszustand anlässlich Vesikel. Fluoreszierende FM1-43 kann Photoconverted zu einer oxidierten Diaminobenzidine (DAB) Elektron-Dichte Niederschlag für Visualisierung über Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM). (A) A schematische Darstellung der Ladungszustand Methode zum Beschriften der Drosophila NMJ nach aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff beladen. (B) repräsentative TEM Bild von einem Wildtyp synaptische Bouton in Ruhe (unstimulierte). Beachten Sie die Dichte Bevölkerung von Uniform-Größe SVs. (C) synaptischen Boutons, die mit hohen [K+] saline Depolarisation für 5 min ohne Ladungszustand (links) oder mit FM1-43 Ladungszustand (rechts) angeregt worden. Beachten Sie das Vorhandensein von Schüttgut Endosomal Strukturen, beschriftet und ungekennzeichnet. (D) synaptischen Boutons, die elektrisch mit einem Nerv stimuliert worden Saug-Elektrode bei 20 Hz für 5 min keine Ladungszustand (links) oder mit FM1-43 Ladungszustand (rechts). Beachten Sie, dass der Farbstoff beladenen Vesikeln viel dunkler als benachbarte entladen Bläschen erscheinen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hoch [K+] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen29. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K+] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrscheinlich Synapse-assoziierten Glia1. Ein weiteres wichtiges Anliegen ist, dass hohe [K+] Depolarisation Laufwerke schnelle Bildung von Schüttgut Endosomen, die nur selten in unstimulierte Boutons gesehen werden. Bulk Endosom Bildung ist jedoch eine aktive Mechanismus blockiert durch Mutationen29, zeigt einen echtes physiologischen Prozess. FM1-43 Bildgebung mit hoher [K+] Depolarisation ist so lässt sich gezielt Bulk Endozytose an Synapsen zu studieren. Saug-Elektrode elektrische Stimulation des motorischen Nervs ist eine viel mehr kontrollierte Methode. Es hat den Vorteil, dass nur ein einziges Axon-Bundle wird angeregt, nur der präsynaptischen Termini ist direkt depolarisiert (natürlich die Muskelfaser ist dann erschüttert durch Sender handeln). Es bietet somit eine große interne Kontrolle des NMJs in das gleiche Tier, das nicht stimuliert werden. Diese Methode erlaubt es, genau die Stimulationsparameter, im Gegensatz zur hohen [K+] Stimulation Methode, ermöglicht direkten Vergleich mit Elektrophysiologie Aufnahmen4steuern. Jedoch wird diese Technik erfordert spezialisierte Ausrüstung und ein relativ hohes Maß an Fachwissen und ist daher weniger zugänglich. Lichtgetriebenen Aktivierung des gezielten Channelrhodopsin (ChR2) hat den Vorteil des Zielens wählen Sie Neuronen30. Diese Methode erfordert keine Vertrautheit mit Methoden der Elektrophysiologie und kann mit sehr günstigen Geräte in jedem Labor durchgeführt werden, aber dieser Ansatz erfordert grundlegende Vertrautheit mit Drosophila Genetik.

Die Wahl der Stimulationsparameter ist von entscheidender Bedeutung für die Prüfung SV Zyklus Dynamik innerhalb eines Bereichs von genetischen Erkrankungen mit hochvariablen Phänotypen1abgefragt. Für alle Methoden, die externe [Ca2 +] verwendet, ist ein wichtiger Parameter steuern die treibende Kraft des SV Radfahren. Mit der hohen [K+]-Stimulation-Methode ist eine wichtige Entscheidung [K+] verwendet, die bestimmt den Grad der Depolarisation Stärke. Messungen von Drosophila Hämolymphe zeigen ein [K+] von 5 mM und 90 mM ist in der Regel die Konzentration am häufigsten ausgewählt für Aktivität Stimulation3,7,15,17 , 31. jedoch noch ein [K+] reichen von 30-90 mM variieren die Stimulation Stärke5,16,32beschäftigt waren. Ein weiterer entscheidet kritischer Parameter die Länge des Impulses hoch [K+] für beide FM1-43 be- und entladen. Der Zeitraum für die Beladung legt fest, ob die gesamte Radsport SV Bevölkerung effektiv geladen ist, oder nur eine Teilmenge der aktiven Vesikel7. Die Frist für die Entladung ähnlich Diktat ändert sich der Prozentsatz der SVs Exozytose in die stimulationsdauer durchläuft die offenbaren oder verdecken mutierte Phänotypen abhängig vom Tarif können im Radsport Frequenz2SV. Mit Saug-Elektrode elektrische motor Nervenstimulation gehören Parameter Auswahl auch Stimulation Spannung, Frequenz, Dauer und Puls Intervall. Zeitlich gemusterten Aktivität ist ein Schlüsselfaktor für SV Radfahren Dynamik7und verschiedenen Mustern können selektiv unterschiedliche SV Pools mobilisieren. Mit gezielten lichtgetriebenen ChR2 Aktivierung, zur Auswahl stehen alle oben genannten (mit Variablen Lichtstärke) und transgenen Zusatzoptionen diskutiert im nächsten Abschnitt. Mit diesen Parameter Auswahl kommt mehr experimentelle Kontrolle, aber auch zunehmende technische Komplexität.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) ist ein Licht-gated Membran Kanal durchlässig für Mono- und zweiwertigen kationen33. Wenn ChR2 Stimulation aktiviert ist, gibt es viele Wahlen einschließlich Gal4 Fahrer, UAS-ChR2 Konstrukt und Lichtquelle Variablen für die Kanal-Aktivierung vorgenommen werden. GAL4 Treiber zwischen allgegenwärtig und hochspezifisch. Z. B. allgegenwärtige UH1-Gal4 (daughterless) möchte zum Ausdruck bringen ChR2 in jeder Zelle, während CcapR-Gal4 (Janelia) im Muskel ChR2 treibt 6/7 NMJ aber nicht den Muskel 4 NMJ31,34. Diese Selektivität kann als eine leistungsfähige interne Kontrolle verwendet werden. Es gibt ebenso viele UAS-ChR2 Varianten, einschließlich ChR2-H134R (gebrauchte hier; die mutierten Rückstände Ursachen erhöhter photoströme)35, VChR1, ChIEF und viele weitere36. Jede dieser Kanal-Varianten hat unterschiedliche Eigenschaften des Lichts gating, Leitwert, Ionen-Selektivität, Kinetik und Desensibilisierung. Beachten Sie, dass einige Konstrukte ein fluoreszierenden Tag enthalten, der FM-Bildgebung stören könnten. Beispielsweise verwendet hier UAS-ChR2-H134R mit mCherry markiert ist (ex: 587 nm, Em: 610 nm), aber keine erkennbaren Emission mit FM1-43 erzeugt (z. B.: 479 nm, Em: 598 nm) imaging-Filter. Technische Parameter folgende Zimmertypen an der Lichtquelle, Wellenlänge und Intensität für die Kanal-Aktivierung. Hier verwendete Option ist eine billige blau emittierende LED mit Stimulation durch Muskelkontraktionen Prüfung visuell bestätigt. Wir waren auch erfolgreich bei der Aktivierung ChR2 mit Epifluoreszenz, obwohl ein Scan konfokale Laser nicht ausreichte. Epifluoreszenz in gezielte Stimulation (spezifische Segmente statt das ganze Tier) verwendet werden könnte, aber Stimulationsparameter sind schwer zu kontrollieren, während die LED angeschlossen bis zu einem einfachen Stimulator leicht die Dauer und die Frequenz des Lichtes verändert Impulse. Konzentriert sich das LED-Licht über die Dissektion Mikroskop Kamera Anschluss ermöglicht mehr kontrollierte, intensive Lichtstimulation.

Es liegt an der Experimentator zu entscheiden, ob das ventrale Nerv Schnur/Gehirn während der Stimulation Paradigma intakt verlassen. Wir entschieden uns für das gesamte zentrale Nervensystem für den Vergleich der drei hier verwendeten Methoden zu entfernen, aber manchmal die vorgelagerten Verdrahtung bleibt intakt15. Eine Komplikation ist, dass endogener neuronaler Aktivität tritt auf, wenn das Nervensystem ganze übrig bleibt. Der Grad dieser Aktivität ist sehr variabel von Tier zu Tier, in hohem Maße abhängig von der Dissektion Expertise der Experimentator. Diese schwankende Aktivität tragen in Höhe von FM1-43-Farbstoff, das beladen und entladen, was daher nicht ausschließlich auf die exogene Stimulation beschäftigt15zurückzuführen ist. Eine verwandte technische Komplikation ist, dass intakte sezierte Larven der Muskulatur in fiktiven Bewegung zusammenziehen, und diese Verschiebung stark NMJ Bildgebung stört. Diese Bewegung wird gelindert, wenn das zentrale Nervensystem entfernt wird, und auch durch die Anwendung von Ca2 +-kostenlose Saline während imaging-4. Diese Ansätze hier sind ausreichend, um ausgezeichnete FM1-43 Farbstoff Bildgebung in der NMJ Vorbereitung zu ermöglichen. Jedoch möchten einige Experimentatoren hinzufügen Medikamente zu hemmen Muskel-Kontraktion (z. B. Ryanodine, Philanthotoxin-433) oder Aktionspotential-Blocker (z. B. Tetrodotoxin)37,38zu verwenden. Eine Reihe von Medikamenten lässt sich gezielt manipulieren den SV-Zyklus, um bestimmte Schritte zu markieren, oder akzentuieren mutierte Phänotypen um Neurotransmission Mechanismen zu untersuchen. Zum Beispiel sind einige Experimentatoren Veratridine (aktiviert Voltage-gated Na+ Kanäle39) eingesetzt, um SV in der Reserve-Pool, Cyclosporin A (hemmt Calcineurin Aktivität40) zur Verbesserung der SV Endozytose, laden zu erhöhen und Forskolin (aktiviert Adenylyl Cyclase41, die synaptische Übertragung42erhöht), die Exo/Endo Radsport Pool7,43,44erhöhen. Solchen pharmakologischen Manipulationen können zusätzliche Erkenntnisse liefern. Zu guter Letzt kann FM1-43 Hintergrund in unterschiedlichem Maße auf Qualität der Dissektion, Wirksamkeit und Stimulation Protokoll waschen auftreten. Einige fügen Sie ein Sulfobutylated Derivat von β-Cyclodextrin-Advasep-7-45oder der wässrigen Fluorophor Sulforhodamine46, unspezifische Fluoreszenz zu stillen und Signal-Hintergrund-Verhältnis zu verbessern.

Es gibt zahlreiche Techniken, die zum weiteren Verständnis des SV-Zyklus (z. B. Elektrophysiologie, SynaptopHluorin, Elektronenmikroskopie) FM Fluoreszenz imaging begleiten können. Ein Beispiel gezeigt, dass hier ist FM Fluoreszenz Ladungszustand, die verwendet wird, zu untersuchen, die SV-Zyklus Ultrastrukturforschung ausführlich. SVs gliedern sich in mehrere Pools, die räumlich und funktionell unterschiedlichen2sind. Der leicht lösbare Pool (RRP) enthält Vesikel unmittelbar nach akuten Stimulation freigesetzt. Ein größerer recycling Pool unterhält SV Version unter den Bedingungen der moderate Aktivität. Ein interne Reserve-Pool (RP) wird nur mit (scheinbar in der Nähe von unphysiologischen) starke Stimulation2eingestellt. Die SV-Pools, die aktiviert werden, hängen vom Typ der Stimulation verwendet,47, und Berichte aus der Drosophila NMJ mit FM Ladungszustand haben wichtige Einblicke in die räumliche und funktionale Eigenschaften von diesen verschiedenen SV Pools48gezeigt. FM Ladungszustand einsetzbar, SV Pools aktiviert unter verschiedenen Paradigmen und Abfrage Fragen wie lange diskutiertes Menschenhandel Interaktion zwischen Endosomen und SVs49zu studieren. Wenn der Experimentator FM Bildgebung in Kombination mit anderen aktivitätsabhängige Änderungen an der Synapse interessiert ist, gibt es eine angeblich fixierbare Analog des Farbstoffs FM1-43 (FM1-43FX). Diese Sonde erlauben es, die Drosophila NMJ nach aktivitätsabhängige Farbstoff laden zu beheben sollte, und dann folgen mit Antikörper zu beschriften, um Zusammenhänge zwischen Bouton Aktivitätsniveau (FM Farbstoff Fluoreszenz) und aktivitätsabhängige Ausdruck testen ein Protein des Interesses. In Zukunft wird es extrem um zusätzliche Methoden zu erforschen, die die Kombination von FM Farbstoff ermöglichen könnte lohnend sein imaging mit anderen bildgebenden Verfahren an der schönen Drosophila NMJ Modell Synapse.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken Broadie Lab Mitgliedern für Beiträge zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01s MH096832 und MH084989, k.b., und NIH predoctoral Fellowship F31 MH111144, D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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References

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Ausgabe 135 Drosophila Neurowissenschaften neuromuskuläre Synapse FM1-43 Elektrophysiologie Ladungszustand Transmissions-Elektronenmikroskopie
FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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