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Neuroscience

FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Les vésicules synaptiques (SV) le vélo est le mécanisme central de la communication intercellulaire au niveau des synapses neuronales. Libération et l’absorption de teinture de FM sont les principaux moyens de dosage quantitatif SV endo - et l’exocytose. Nous comparons ici, toutes les méthodes de stimulation pour conduire FM1-43 cyclisme synaptique jonction neuromusculaire (NMJ) modèle drosophile .

Abstract

FM colorants sont utilisés pour étudier le cycle de la vésicule synaptique (SV). Ces sondes amphipathic ont une tête hydrophile et une queue hydrophobe, ce qui les rend solubles dans l’eau avec la capacité de façon réversible, entrer et sortir des bicouches lipidiques membranaires. Ces colorants styryl sont relativement non fluorescent en milieu aqueux, mais l’insertion dans le feuillet externe de la membrane plasmique provoque un > 40 X augmentation de fluorescence. Dans les synapses neuronales, FM colorants sont intériorisées au cours de l’endocytose SV, victimes de la traite au sein et entre les bassins de la SV et libérée par exocytose SV, fournissant un outil puissant pour visualiser les étapes présynaptiques de la neurotransmission. Un modèle génétique primaire de développement synapse glutamatergique et la fonction est la drosophile jonction neuromusculaire (NMJ), où FM teindre imagerie a été largement utilisée pour quantifier la dynamique de la SV dans un large éventail de conditions mutants. Le terminal synaptique NMJ est facilement accessible, avec une belle palette de grands boutons synaptiques idéales pour les applications d’imagerie. Ici, nous comparer et contraster les trois façons de stimuler la drosophile NMJ pour piloter l’activité dépendante FM1-43 colorant capture/release : demande 1) bain de haut [K+] à dépolariser tissus neuromusculaires, 2) aspiration des nerfs moteurs électrode stimulation à dépolariser le nerveuses présynaptiques terminal et 3) cible expression transgénique des variantes de channelrhodopsin pour le contrôle spatial, stimulée par la lumière de la dépolarisation. Chacune de ces méthodes a des avantages et des inconvénients pour l’étude des effets de la mutation génétique sur le cycle de la SV à la drosophile NMJ. Nous allons discuter de ces avantages et les inconvénients pour aider la sélection de l’approche de la stimulation, ainsi que les méthodologies spécifiques à chacune de ces stratégies. En plus de l’imagerie de fluorescence, FM colorants peuvent être photoconverted aux signaux dense aux électrons visualisés à l’aide de microscopie électronique à transmission (TEM) pour étudier les mécanismes cycle SV au niveau ultrastructural. Nous fournissons les comparaisons de confocale et microscopie imagerie de différentes méthodes de stimulation NMJ Drosophila , pour aider à guider la sélection des futurs paradigmes expérimentaux.

Introduction

Le modèle de synapse et de glutamatergique caractérise magnifiquement Drosophila larvaire de la jonction neuromusculaire (NMJ) a été utilisé pour étudier la formation des synapses et la fonction avec un vaste éventail de perturbations génétiques1. Le terminal de neurones moteurs se compose de plusieurs branches axon, chacun avec plusieurs boutons synaptiques élargies. Ces varicosités de grande capacitées (jusqu'à 5 µm de diamètre) contiennent toute la machinerie de la neurotransmission, y compris les vésicules synaptiques glutamatergique uniforme (SVs ; ~ 40 nm de diamètre) dans la réserve cytosolique et piscines facilement libérable par2. Ces vésicules ancrer aux membrane présynaptique de plasma fusion site zones actives (AZs), où l’exocytose intervient dans la libération de neurotransmetteur glutamate pour trans-communication synaptique. Par la suite, le SVs sont extraites de la membrane plasmique par kiss-and-run de recyclage ou d’endocytose clathrine (CME) pour les cycles répétés d’exo/endocytose. La drosophile NMJ est facilement accessible et bien adapté pour les isoler et caractériser des mutants de cycle SV. À l’aide d’écrans génétiques avant, nouvelles mutations ont conduit à l’identification de nouveaux gènes critiques pour le SV cycle3. En outre, les approches génétiques inverses à partir de gènes déjà connus ont conduit à l’élucidation des mécanismes de cycle SV nouvelles par le biais de la description minutieuse du mutant cyclisme phénotypes4. La drosophile NMJ est presque idéales comme préparation pour disséquer les mécanismes de l’endocytose et l’exocytose SV grâce à des méthodes à optiquement piste vésicule cyclisme au cours de la neurotransmission synaptique expérimentale.

Une gamme de marqueurs fluorescents permettent suivi visuel des vésicules au cours de cyclisme dynamique, mais les plus polyvalents sont des analogues de colorant de FM qui est synthétisé pour la première fois par Mao, F., et al. 5. structurellement, FM colorants contiennent une tête hydrophile et une queue lipophile connectés grâce à un cycle aromatique, avec une région centrale conférant des propriétés spectrales. Ces styryl colorants partitionner de manière réversible dans les membranes, ne pas « bascule » entre les feuillets de la membrane et ne sont donc jamais libre dans le cytosol et sont beaucoup plus fluorescentes dans les membranes à l’eau5. Réversible insertion dans une bicouche lipidique provoque une augmentation de 40 fois en fluorescence6. Au niveau des synapses neuronales, classic FM colorant étiquetage des expériences consistent en la préparation synaptique avec le colorant au cours de la stimulation de dépolarisation pour charger le colorant par endocytose SV de baignade. Teinture extérieure est alors emporté et le cycle de la SV est arrêté dans une solution de ringer sans calcium afin d’imager les synapses chargé7. Une deuxième série de stimulation dans un bain sans colorant déclenche FM libération par exocytose, un processus qui peut être suivi en mesurant la diminution d’intensité de fluorescence. Les populations de SV d’une vésicule simple aux piscines contenant des centaines de vésicules peuvent être quantitativement surveillé6,7. Colorants de FM ont été utilisés pour disséquer la mobilisation activité dépendante des pools SV fonctionnellement distincts et de comparer les kiss-and-run vs CME cyclisme8,9. La méthode a été modifiée pour dosage séparément évoquée, spontanée et miniature cycle synaptique activités (avec équipement très sensible pour détecter des changements très faible fluorescence et réduire photobleaching)10. Dosages peuvent être étendues au niveau ultrastructural de photoconverting le signal FM fluorescent à une étiquette opaques pour transmission electron microscopy11,12,13,14 .

Historiquement, les préparations synaptique se baigner dans une forte concentration de potassium (ci-après dénommé « high [K+] ») est la méthode de choix pour dépolariser la stimulation pour provoquer le SV cyclisme ; allant de la grenouille cholinergique NMJ5, à cultivé des neurones de l’hippocampe cerveau rongeurs15, à la drosophile glutamatergique NMJ modèle16,17. Cette approche [K+] élevée est simple, ne besoin d’aucun équipement spécialisé et est donc accessible à la plupart des laboratoires, mais a des limites pour les application et interprétation des données. Une méthode beaucoup plus physiologiquement appropriée consiste à utiliser l’électrode d’aspiration la stimulation électrique du nerf4,5,12. Cette approche conduit la propagation du potentiel d’action pour la stimulation directe du nerf présynaptique terminal, et les résultats peuvent être comparés directement à des tests électrophysiologiques de neurotransmission fonction13,14, 15, mais besoin d’équipement spécialisé et est techniquement beaucoup plus difficile. Avec l’avènement d’optogenetics, l’utilisation de la stimulation neuronale channelrhodopsin a des avantages supplémentaires, y compris un contrôle strict spatio-temporelle de l’expression des canaux en utilisant le binaire de système de Gal4/UAS20. Cette approche est techniquement beaucoup plus facile que la stimulation de l’électrode d’aspiration et n’exige rien de plus qu’une source de lumière LED très bon marchée. Ici, nous utilisons l’imagerie de FM1-43 (dibromure de pyridiniumN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)) pour les comparer et contraster ces trois méthodes différentes de stimulation à la drosophile NMJ : haute simple [K+ ], contestant les channelrhodopsin électriques et nouvelles approches.

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Protocol

1. larves colle Dissection

  1. Bien mélanger 10 parties en élastomère de silicone base avec 1 partie en élastomère de silicone polymérisation agent du kit élastomère (Table des matières).
  2. Enrober les lamelles de verre de 22 x 22 mm avec l’élastomère et le remède sur une plaque chauffante à 75 ° c pendant plusieurs heures (jusqu'à ce que n’est plus collant au toucher).
  3. Placez une lamelle de verre élastomère unique dans la chambre de dissection de verre plexi sur mesure (Figure 1, en bas) en préparation pour la dissection larvaire.
  4. Préparer les pipettes de colle de capillaire de verre borosilicaté moyen d’un extracteur de microélectrodes standard pour obtenir le cône désiré et Astuce taille.
  5. Doucement briser au large de la pointe de la micropipette et à l’autre extrémité, attachez les 2 pieds de tube en plastique souple (1/32" diamètre intérieur, ID, 3/32" diamètre extérieur, OD, 1/32" mur ; Table des matières) avec bouche raccord (P2 de pipette).
  6. Remplissez un petit récipient (capuchon du tube Eppendorf 0,6 mL) avec un petit volume (~ 20 µL) de colle (Table des matières) en préparation pour la dissection larvaire.
  7. Remplir la chambre avec du sérum physiologique (en mM) : 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, saccharose 70 et acide 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) pH 7,2.
  8. Ajouter anti-raifort (HRP) anticorps conjugués à Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647 ; diluée 01:10 provenant d’un stock de 1 mg/mL) pour l’étiquetage de la NMJ terminaison présynaptique au cours de la dissection21,22.
  9. À l’aide d’un pinceau fin (taille 2), enlever un troisième stade errant dans le flacon de nourriture et placez-la sur le couvercle en verre revêtement élastomère.
  10. Remplir la pointe d’une micropipette de verre avec une petite quantité de colle à l’aide de la pression d’air négative générée par la bouche avec pièce jointe (étape 1.5).
  11. Position larve dorsale vers le haut avec la pince et colle la tête à la lamelle de revêtement élastomère avec une petite goutte de colle à l’aide de la pression d’air positive par la bouche.
  12. Répétez cette procédure avec l’extrémité postérieure de la larve, en s’assurant que l’animal soit tendu tendu entre les deux fixations de colle.
  13. À l’aide de ciseaux (lames 3 mm ; Table des matières), faites une coupe horizontale (~ 1 mm) au postérieur et une coupe verticale tout au long de la ligne médiane dorsale.
  14. À l’aide de pinces fines (n ° 5, Table des matières), délicatement enlever dorsale trachée, intestin, corps gras et autres organes internes couvrant la musculature.
  15. Répétez la procédure de collage pour les quatre volets de paroi du corps, en veillant à étirer doucement la paroi du corps aussi bien horizontalement que verticalement.
  16. Soulever le cordon nerveux ventral (VNC) à l’aide de pinces, coupez soigneusement les nerfs moteurs avec les ciseaux et puis supprimer complètement la VNC.
  17. Remplacer la solution saline de dissection avec Ca2 +-gratuit saline (identique à la saline de dissection ci-dessus sans le CaCl2) pour arrêter la SV cyclisme.

2. option 1 : Chargement de colorant FM haute [K+]

  1. D’une solution mère FM1-43 (4 mM), ajouter 1 µL à 1 mL de 90 mM de solution de KCl (haute [K+] dans une solution saline de dissection) pour une concentration finale de 4 µM.
  2. À l’aide d’une pipette, remplacer le Ca2 +-saline gratuite dans la chambre d’imagerie avec la solution de colorant [K+] FM haute pour stimuler l’absorption de teinture SV endocytose.
  3. Commencer immédiatement une minuterie numérique pour la durée prédéterminée des hauts [K+] période de stimulation de dépolarisation (e.g., 5 min ; La figure 2).
  4. Pour confirmer une saine préparation larvaire, notez les fortes contractions de la musculature pour la durée de la grande période de dépolarisation [K+].
  5. Après la fin de la période de minuterie, rapidement enlever la solution de colorant [K+] FM haute et remplacer par Ca2 +-saline libre d’arrêter SV cyclisme.
  6. Laver en succession rapide avec le Ca2 +-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant [K+] FM haute est totalement supprimée.
  7. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.

3. imagerie : Microscopie confocale

  1. Utiliser un microscope confocal vertical avec un 40 X objectif à immersion d’eau à fluorescence de colorant NMJ image (autres microscopes peuvent être utilisés).
  2. Image des muscles 4 NMJ des segments abdominaux 2-4 (autres NMJ peut être photographiée) et de recueillir des images à l’aide des logiciels appropriés (Table des matières).
  3. Utiliser un laser HeNe 633 nm à exciter HRP:647 (avec filtre pass-long > 635 nm) et un laser à Argon 488 nm pour exciter FM1-43 (avec bandpass filter 530-600 nm).
  4. Sur le plan opérationnel déterminer gain optimal et l’offset pour les deux canaux.
    Remarque : Ces paramètres demeurera constants tout au long du reste de l’expérience.
  5. Prenez une pile Z confocale à travers l’ensemble NMJ sélectionné du haut HRP-marqué en bas du terminal synaptique.
  6. Prendre bonne note de la NMJ imagé (segment, latéral et muscle) pour garantir l’excès à l’exacte NMJ même après FM teindre de déchargement.

4. haute [K+] Stimulation : FM colorant déchargement

  1. Remplacer Ca2 +-saline gratuite avec la haute [K+] solution saline (sans colorant FM1-43) à la dépolarisation de la voiture, sortie de l’exocytose et colorant SV.
  2. Commencer immédiatement une minuterie numérique pour la durée prédéterminée de la grande période de stimulation [K+] (p. ex.., 2 min ; La figure 2).
  3. Après la fin de la période de minuterie, immédiatement supprimer la grande saline [K+] et remplacez par Ca2 +-saline libre d’arrêter SV cyclisme.
  4. Laver en succession rapide avec Ca2 +-gratuit saline (5 x 1 min) pour assurer la grande saline [K+] est totalement supprimée.
  5. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
  6. S’assurer de l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

5. option 2 : Stimulation électrique FM colorant chargement

  1. Préparer une pipette d’aspiration à l’aide de l’extracteur de la microélectrode (Table des matières) pour obtenir le cône requis et Astuce taille.
  2. Feu-vernis à l’extrémité de la microélectrode avec une micro-forge jusqu'à ce qu’un seul nerf moteur peut être sucé vers le haut avec un ajustement serré.
  3. Faites glisser la pipette d’aspiration sur le porte-électrode sur un micromanipulateur et fixer le tube de plastique flexible long et une seringue.
  4. Définir les paramètres de stimulateur (e.g., 15 V, fréquence 20 Hz, durée 20 ms et l’heure de 5 min (Figure 2) ou 1 min (Figure 3)).
  5. Remplacer le Ca2 +-saline gratuite sur la préparation de larve avec au-dessus de saline FM1-43 (4 µM ; 1 mM CaCl2) sur le banc de l’électrophysiologie.
  6. Mettre la préparation sur la platine du microscope et relever l’étape jusqu'à ce que la larve et la pipette d’aspiration sont en discussion (objectif 40-immersion dans l’eau).
  7. Aspirer une boucle de coupe nerveuses motrices innervant le hemisegment sélectionné avec la pression d’air négative générée par la seringue dans l’électrode d’aspiration.
  8. Testez la fonction électrode d’aspiration avec une courte rafale de la stimulation tout en contrôlant visuellement la contraction musculaire dans le hemisegment sélectionné.
  9. Stimuler le nerf moteur en utilisant les paramètres sélectionnés (étape 5.4) pour conduire l’endocytose de la SV et l’absorption de teinture FM1-43 (Figure 2).
  10. Laver en succession rapide avec Ca2 +-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant FM1-43 est totalement supprimée.
  11. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline gratuite pour l’imagerie immédiate en utilisant le protocole d’imagerie confocal par dessus.
  12. Prenez soin de noter le NMJ imagé (segment, côté et muscle) pour garantir l’accès à l’exacte NMJ même après le déchargement de colorant de FM.

6. électrostimulation : FM colorant déchargement

  1. Remplacer le Ca2 +-sans une solution saline avec une solution saline normale (sans colorant FM1-43) et placer la préparation revient sur la scène de rig électrophysiologie.
  2. Définir les paramètres de stimulateur de déchargement (p. ex., 15 V, fréquence 20Hz, durée 20 ms et temps de 2 min (Figure 2) ou 20 s (Figure 3)).
  3. Aspirer le nerf moteur même dans la même électrode comme indiqué ci-dessus et ensuite stimuler pour activer l’exocytose SV et FM1-43 communiqué de colorant.
  4. Laver en succession rapide avec Ca2 +-libre de sérum physiologique (5 x 1 min) afin d’assurer la teinture extérieure est totalement supprimée.
  5. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
  6. Veiller à l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

7. option 3 : Channelrhodopsin Stimulation FM colorant chargement

  1. Soulever le ChR2 exprimant des larves sur les denrées alimentaires contenant le rétinal en tout-trans ChR2 cofacteur (dissous dans l’éthanol ; concentration finale de 100 µM).
  2. Placez la préparation larvaire dans la chambre de plexiglass sur une dissection des microscopes équipés d’un port de l’appareil photo.
  3. Attacher une LED bleu (470 nm ; Table des matières) à un stimulateur programmable en utilisant un câble coaxial et placer le LED dans le port de la caméra.
  4. Concentrer le faisceau lumineux LED bleu sur la fonction larvaire disséqué en utilisant la fonction de zoom du microscope.
  5. Remplacer le Ca2 +-saline gratuite sur la préparation de larve avec au-dessus de saline FM1-43 (4 µM ; 1 mM CaCl2) sur la scène optogenetic.
  6. Définissez les paramètres de LED à l’aide de l’appareil (par exemple, 15 V, fréquence 20Hz, de durée 20 ms et de temps de 5 min (Figure 2)).
  7. Commencer la stimulation légère et suivre avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogenetic (p. ex., 5 min ; La figure 2).
  8. Lorsque la minuterie s’arrête, rapidement enlever la solution de colorant de FM et remplacer par Ca2 +-saline libre d’arrêter la SV cyclisme.
  9. Laver en succession rapide avec le Ca2 +-gratuit saline (5 x 1 min) pour s’assurer que la solution de colorant FM est totalement supprimée.
  10. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale utilisant le protocole d’imagerie d’en haut.
  11. Prenez soin de noter le NMJ imagé (segment, côté et muscle) pour garantir l’accès à l’exacte NMJ même après le déchargement de colorant de FM.

8. Channelrhodopsin Stimulation : colorant FM déchargement

  1. Remplacer Ca2 +-saline libre avec une solution saline normale (sans colorant FM1-43) sur la platine du microscope dissection avec port appareil photo LED axé sur la larve.
  2. Définir les paramètres de stimulateur de déchargement (p. ex., 15 V, fréquence 20Hz, de durée 20 ms et de temps de 2 min (Figure 2)).
  3. Commencer la stimulation légère et suivre avec une minuterie pour la durée prédéterminée de la période de stimulation optogenetic (p. ex., 2 min ; La figure 2).
  4. Après la fin de la période de minuterie, rapidement enlever la solution de colorant de FM et remplacer par Ca2 +-saline libre d’arrêter la SV cyclisme.
  5. Laver en succession rapide avec Ca2 +-libre de sérum physiologique (5 x 1 min) afin d’assurer la teinture extérieure est totalement supprimée.
  6. Maintenir la préparation larve fraîches Ca2 +-saline libre d’imagerie immédiat sur la microscopie confocale.
  7. Veiller à l’image de la fluorescence de colorant FM1-43 à la NMJ même mentionné ci-dessus en utilisant les mêmes paramètres confocale.

9. Quantification de la fluorescence

  1. Charger l’image dans l’Image J (OpenSource NIH) et de créer une projection de l’intensité maximale en cliquant sur Image | Piles | Projet de Z.
  2. À l’aide de l’anti-HRP:647 canal, allez dans Image | Ajuster | Seuil et faire glisser la barre d’outils supérieure jusqu'à ce que juste la NMJ est mis en surbrillance.
  3. À l’aide de l’outil baguette magique, cliquez sur le NMJ. Si le NMJ est discontinue, maintenez la touche Shift, puis sélectionnez toutes les pièces.
  4. Changer l’image sur le canal de colorant FM1-43 et allez dans Analyze | Mesure d’obtenir la mesure de la fluorescence.
  5. Répétez les étapes 9.1-9,4 pour l’image « déchargé » de la même NMJ (segment identifié, latéral et muscle).
  6. Pour obtenir le pourcentage de colorant qui a été déchargé, prenez le rapport entre les intensités de fluorescence de déchargement/chargement.
    Remarque : Cette procédure peut être modifiée pour analyser la fluorescence sur une base de bouton-par-bouton en utilisant soit les outils de sélection « oval » ou « à la volée ». Fluorescence de fond peut être soustraite par l’échantillonnage de la fluorescence de muscle. Agents peuvent également être ajoutés afin de réduire cette toile de fond.

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Representative Results

La figure 1 illustre le flux de travail pour la teinture de FM activité-dépendant du protocole d’imagerie. L’expérience commence toujours par la dissection de larves colle même, peu importe la méthode de stimulation utilisée par la suite. Figure 1 a est une représentation schématique d’une larve disséquée, montrant le cordon nerveux ventral (VNC), irradiant les nerfs et modèle muscle hemisegmental répétées. VNC est supprimé et la préparation baigné dans une solution de 4 µM de FM1-43 (Figure 1 b, rose). La préparation est ensuite stimulée en présence de colorant FM en utilisant une des trois options possibles pour charger le colorant par endocytose SV activité dépendante (Figure 1cI-III). Ensuite, colorant FM cyclisme est arrêté à l’aide de Ca2 +-saline libre et un terminal NMJ spécifique qui a été chargé avec de la teinture de FM est photographié à l’aide d’un microscope confocal (« image chargée » ; Figure 1d). Dans ce cas, le muscle que 4 NMJ est sélectionné avec le placement de schématique montrant des nerfs, NMJ ramification terminale et FM chargé des boutons synaptiques. La préparation synaptique est stimulée pour la deuxième fois en utilisant la même méthode sélectionnée ci-dessus, mais en l’absence de colorant FM pour chasser l’exocytose SV et FM1-43 communiqué (Figure 1e). Le même identifié NMJ (muscle NMJ 4 dans cet exemple) est ensuite remise en image à l’aide de la HRP:647 étiquette synaptique et le signal de vésicule résiduelle FM1-43 (« image déchargé » ; Figure 1f). L’expérimentateur détermine l’intensité et la durée du chargement et déchargement des phases afin d’optimiser les mesures pour un dosage précis ou la condition mutante. Intensité de fluorescence est quantifiée après le chargement et le déchargement (Figure 1D, 1f), afin d’obtenir les mesures d’endocytose colorant synaptique, exocytose et le pourcentage de chargée colorant FM libéré. Des analyses peuvent être faits pour l’ensemble NMJ ou boutons simples.

Colorant de FM cyclisme peut être stimulée de trois façons : dépolarisation saline 1) haute [K+] de toute la préparation, 2) aspiration électrode de stimulation du nerf moteur, ou 3) légère activation conduite des channelrhodopsin ciblé (ChR2 ; La figure 2). Pour une comparaison directe de side-by-side de ces trois méthodes, nous stimulée avec chaque approche pendant 5 min en présence de FM1-43 (chargement) puis pendant 2 min en l’absence de FM1-43 (déchargement) et imagés NMJ HRP-étiquetés à l’aide des paramètres identiques confocale ( Figure 2). La méthode de dépolarisation saline [K+] haute respecte le protocole de FM1-43-employé couramment pour la drosophile larvaire NMJ23, sauf nous utilisons colle au lieu de broches pour la dissection larvaire. La colle évite les interférences avec les objectifs de microscope et permet une détermination plus précise de la tension de la paroi du corps, mais nécessite une courbe d’apprentissage modérée. Les trois méthodes produisent des signaux fluorescents fortes et cohérentes tout au long de l’axe du bouton synaptique NMJ et au sein de différents boutons synaptiques (EISN). La méthode de dépolarisation saline [K+] élevée provoque NMJ tous être FM-chargé tout au long de la larve comme il dépolarise chaque neurone chez l’animal (Figure 2 a, milieu). La méthode de stimulation électrique du nerf électrode d’aspiration ne conduit que dans un seul hemisegment des larves dont la correspondante qui innervent nerveuse motrice a été stimulée (Figure 2 b, milieu). Des segments non stimulées chez le même animal peuvent être distinguées à l’aide de l’étiquette HRP mais ne contenant aucun colorant fluorescent observable chargement et servent d’excellents contrôles internes. L’optogenetic méthode ChR2 produit ciblée dépolarisation dépendante sur le pilote de Gal4 transgénique utilisé (Figure 2). Ici, le conducteur était un transporteur vésiculaire glutamate (vglut) Gal4, donc tous les neurones glutamatergiques sont dépolarisés avec photostimulation bleue, y compris tous les motoneurones glutamatergique. En conséquence, NMJ tous est chargés avec colorant FM1-43 dans cet exemple (Figure 2, milieu). Pilotes spécifiques des cellules peuvent être utilisés pour étiqueter NMJ spécifiques et laisser les autres non pour un contrôle interne.

Déchargement de colorant de FM a été réalisée via la même méthode qui était utilisée pour charger le colorant. Dans la première méthode, la préparation de larve était simplement baignée dans une solution saline de la [K+] élevée, en l’absence de FM1-43 à dépolariser les cellules, l’exocytose lecteur SV et décharger les terminaux synaptiques (Figure 2 a, droite). Nous choisissons généralement une période plus courte de déchargement (2 min), donc le déchargement est partielle et terminaux reste visibles dans le canal FM. Déchargement de stimulation électrique électrode d’aspiration est considérablement plus difficile, car il s’agit de revenir à la même hemisegment, identifiant le même nerf et re-stimuler ce nerf en l’absence de FM1-43 à conduire le déchargement colorant (Figure 2 b , à droite). Notez que le déchargement de colorant a de nouveau été partiel. Le déchargement ChR2 entraîne une seconde période d’illumination de LED bleu de la préparation de larve en l’absence de FM1-43 pour activer les canaux, à dépolariser les neurones moteurs et à stimuler la libération de SV exocytose colorant (Figure 2, à droite). Avec cette échelle de temps de déchargement (2 min), chacune d'entre elles une dépolarisation méthodes ne déchargement qu’un pourcentage du colorant FM1-43 chargé, avec la haute [K+] plus forts et ChR2 plus faibles dans la conduite de sortie de colorant (Figure 2). Nous avons mesuré la LED intensité lumineuse utilisée (140 µW/mm2), qui se trouvait dans la gamme publiées (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 est au maximum activé par illumination mW ~ 1 de sources lumineuses de 50 à 200 mW, avec une efficacité ChR2 aussi dépendante de la concentration de RTA nourrie à larve27,28. Ainsi, la force de stimulation ChR2 peut être manipulée. En outre, la relation ne doit pas rester vraie avec d’autres forces de stimulation, des délais ou des génotypes. Si l’expérimentateur travaille avec un mutant qui a diminué l’endocytose SV ou exceptionnellement rapide exocytose, les paramètres de stimulation doivent peut-être être modifiées pour maintenir un signal observable après le déchargement. L’étiquette anti-HRP permet d’identifier le NMJ même en l’absence complète du signal FM, mais ce n’est pas idéal pour la quantification. En principe, la stimulation déchargement pourrait également être d’un type différent de la stimulation de chargement.

Récemment, nous avons étudié la perte des effets sur le cycle de la SV à l’aide d’une stimulation électrique4Notum désacylase synaptique sécrétées. Ici, nous étendons cette analyse comparer 1) élevé [K+] dépolarisation et aspiration 2) électrode nerf moteur stimulation méthodes (Figure 3). Nous trouvons que les deux méthodes donnent un résultat similaire, affichage réduit FM1-43 colorant de chargement dans un mutant nul Notum ; Toutefois, le degré du phénotype est distinct entre les deux méthodes. Après la dépolarisation élevés [K+] sérum physiologique pendant cinq minutes, il y a une forte baisse dans l’intensité de la fluorescence chargé entre contrôle de bagage génétique (w1118) avec des niveaux élevés et Notum mutants nuls (NotumKO ) avec des niveaux faibles (Figure 3 a, haut). Dans les mesures chiffrées, intensité de la fluorescence FM normalisée dans les bornes indiquées HRP NMJ est considérablement réduite en l’absence de Notum (w1118 1.0 ± 0,05 NotumKO 0,57 ± 0,07 ; n≥13, p < 0,0001 ; Figure 3 b). Après stimulation électrique à 20 Hz pendant 1 min, nous constatons une diminution non significative chargé FM1-43 intensité entre les contrôles et Notum valeurs null lors de la quantification toute fluorescence NMJ (w1118 1.0 ± 0,05 vs NotumKO 0.86 ± 0,06 ; n = 8, p = 0,10 ; Figure 3 a, B). Incorporation de teinture sur une base de bouton-par-bouton de mesure, nous constatons une diminution significative de colorant chargé à la fois des méthodes. Quantifiés mesures après stimulation avec du sérum physiologique [K+] élevé, intensité de la fluorescence FM normalisée par bouton est significativement diminuée (w1118 1.0 ± 0,02 NotumKO 0,52 ± 0,02 ; n≥241, p< 0,0001 ; La figure 3). Après stimulation électrique, intensité de la fluorescence normalisée par bouton est également significativement diminuée, quoiqu’à un degré moindre (w1118 1.0 ± 0,02 NotumKO 0,83 ± 0,02 ; n≥127, p< 0,0001 ; La figure 3).

Les différences de résultat entre les deux paradigmes de stimulation pourraient être due à plusieurs facteurs. Tout d’abord, la force de stimulation est censée être supérieur avec haute [K+] par rapport à la stimulation électrique des nerfs moteurs. Enregistrements d’électrophysiologie ne peuvent se faire en présence de la grande saline [K+], mais le larve neuromusculature est clairement vigoureusement stimulé, comme les contractions musculaires sont forts et continue tout au long de la période de baignade de 5 min. Toutefois, nous ne savons pas la force ou la fréquence de la stimulation. En revanche, la stimulation électrique est beaucoup plus contrôlée par l’utilisateur de choisir la force de tension exacte et la fréquence de stimulation. En second lieu, la durée de la stimulation a été élevée [K+] par rapport à la stimulation nerveuse électrique (Figure 3). Nous avons choisi 1 min de la stimulation électrique de 20Hz après essais répétés. Après 1 min de chargement de colorant, il y avait un signal fort et fiable de FM1-43, donc nous avons choisi ce paradigme pour notre étude4, bien que 5 min de stimulation a donné un signal fluorescent encore plus fort (Figure 2). Ainsi, la longueur du paradigme stimulation contribue probablement à la variabilité de l’ampleur en chargement FM1-43 entre haute [K+] et la stimulation électrique (Figure 3 b, C). Bien que la méthode de [K+] haute a montré un phénotype plus robuste pour des mutants Notum , nous a toujours utilisé la méthode électrique en raison de la plus grande de contrôle4. Il y a beaucoup de paramètres à contrôler comme force, fréquence et durée de la stimulation, et ces paramètres doivent être tranchées en fonction sur le mutant et la question. Par exemple, le choix de méthode de stimulation peut dépendre de la SV piscine interrogé7 et le mécanisme de l’activité dépendante examiné10.

Après chargement dans la borne NMJ FM1-43, on peut employer photoconversion colorant fluorescence pour produire le signal opaques pour la microscopie électronique (Figure 4). Dans cette méthode, la préparation de teinture-chargé est exposée à une lumière fluorescente intense en présence de la diaminobenzidine (DAB), avec les espèces réactives de l’oxygène de la teinture de FM oxydant le DAB pour créer un précipité noir (Figure 4 a)11. Consultez l’article de JoVE sur photoconversion de styryl colorants pour obtenir des informations détaillées,12. L’avantage de cette méthode est que le SVs sont clairement révélé au niveau ultrastructural, bien que le cycle de la SV est évidemment arrêté avec l’imagerie statique microscope électronique. En l’absence de stimulation, des boutons synaptiques à la drosophile NMJ sont densément chargés avec des vésicules (~ 40 nm de diamètre ; Figure 4 b), avec la rare survenue d’organites élargies (>100 nm de diamètre) censés être cyclisme endosomes. Grande saline [K+] dépolarisant stimulation fortement modifie ce profil, avec une déplétion partielle de la population de la SV et l’accumulation rapide de nombreux organites élargies (>100 nm de diamètre) semble dériver de vrac endocytose de la membrane plasmique (Figure 4, à gauche). Bien que les mêmes milieux existe chez les témoins non stimulées, la forte densité de ces organites après forte dépolarisation saline [K+] soulève l’inquiétude que cela pourrait être une réponse non physiologiques. D’aspiration électrode de stimulation électrique du nerf moteur est relativement plus efficace en appauvrissant la population SV et ne produit pas plus des vésicules endosomale élargie (Figure 4, à gauche). Ceci suggère que l’endocytose en vrac par forte dépolarisation [K+] aide à maintenir la population de SV durant plus intense de la demande.

FM1-43 photoconversion peut être accomplie en utilisant forte dépolarisation saline [K+] ou aspiration électrode de stimulation électrique du nerf moteur, pour comparer l’ultrastructure synaptique par rapport à un bouton au repos (Figure 4). Avec haute [K+] dépolarisant de stimulation, les SVs individuels et vésicules élargies (>100 nm de diamètre) peut être marqué avec la dense aux électrons DAB précipitée suivant axée sur la lumière photoconversion (Figure 4, droit). Pour des raisons inconnues, la membrane de la vésicule élargie est généralement moins densément marquée que la petite membrane SV. En outre, SVs sont souvent rempli avec le précipité DAB, plutôt que de simplement la membrane, mais cela les rend beaucoup plus facile de distinguer les vésicules non étiquetés. Avec la stimulation du nerf moteur d’aspiration électrode, la population de SV cyclisme peut également être marquée par rapport aux non étiquetées SVs (Figure 4, droit). Avec la stimulation électrique, élargi les vésicules (>100 nm de diamètre) ne forment pas détectable en boutons et, régulièrement, les membranes de la présumée endosomes ne sont pas étiquetés par FM1-43 photoconversion. Comme ci-dessus, SVs cyclisme sont généralement remplis de la DAB précipitée d’une façon un peu tout ou rien et donc plus faciles à distinguer de SVs qui n’ont pas été formés au cours de la stimulation (Figure 4, droit). Nous n’avons pas encore tenté de photoconversion après stimulation ChR2. Avec des cours à différents temps de stimulation, FM1-43 photoconversion de colorant permet de déterminer où sont formé les SVs, comment SVs sont victimes de la traite et la synchronisation du mouvement entre différents bassins spatiales dans le bouton synaptique. La comparaison des high [K+] et la stimulation nerveuse permet la dissection du vrac et des mécanismes d’endocytose SV unique.

Figure 1
Figure 1 : Organigramme de colorant FM1-43 protocole lors de la drosophile NMJ de chargement. La dissection de larves colle produit une préparation neuromusculature aplatie, avec le cordon nerveux ventral (VNC) projetant des nerfs segmentaires de la ligne médiane ventrale (Vm) à la hemisegmentally répété paroi du corps musculaire des tableaux (étape un). VNC est coupé libre, et la dissection larvaire entière est ensuite incubée dans la solution de FM1-43 rose (4 µM) en préparation pour la stimulation (étape b). FM1-43 est ensuite chargé avec un paradigme de stimulation sélectionné (étape 3) ; avec les options de haute [K+] une dépolarisation de la larve entière (cI), aspiration électrode stimulation d’un seul nerf moteur (cII) ou activation axée sur la lumière de channelrhodopsin très ciblée (cIII). Incorporation de FM1-43 est arrêtée à l’aide de Ca2 +-saline libre et le colorant chargés NMJ imagés (étape d). Une deuxième stimulation est ensuite faite sans FM1-43 dans le bain pour conduire l’exocytose des vésicules synaptiques colorant (étape e). Le même NMJ est ensuite remise en image pour doser le terminal synaptique déchargé (étape f). Intensité de fluorescence est mesurée à partir de NMJ chargé et déchargé à quantifier l’endocytose de la SV et SV exocytose niveaux. Le panneau inférieur montre les paramètres de construction et les dimensions de la chambre d’acrylique transparente utilisé pour ces études. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : FM teindre Comparaison de chargement et de déchargement de toutes les méthodes de stimulation. Comparaison de FM1-43 teindre le chargement et déchargement dans le troisième stade NMJ errant avec dépolarisation 1) haute [K+] de toute la préparation larvaire (en haut), 2) d’aspiration de la stimulation électrique du nerf moteur (au milieu) électrode et 3) pilotée par lumière activation de la channelrhodopsin ciblée (ChR2) uniquement dans les neurones moteurs (en bas). (A) les larves NMJ étiqueté avec l’anti-HRP:647 marqueur de la membrane présynaptique (bleu, à gauche), chargé avec FM1-43 via forte dépolarisation [K+] pendant 5 min (au milieu) et puis déchargé par l’intermédiaire de forte dépolarisation [K+] pendant 2 min. (B) Comparaison avec la stimulation nerveuse électrique électrode d’aspiration avec les mêmes périodes de stimulus pour les deux colorant FM1-43 de chargement et de déchargement. (C) ciblé vglut-Gal4>SAMU-ChR2-H134R expression dans les neurones moteurs activée avec le fil bleu (470 nm) légère pour les mêmes périodes de stimuli de colorant FM1-43 de chargement et de déchargement. Astérisques voir EISN afficher les boutons d’un grossissement plus élevés. La barre d’échelle est de 10 µm, avec boutons synaptiques médaillon agrandi 3.5 X à partir de panneaux principaux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Notum mutants nuls montrent réduit FM colorant chargement en boutons synaptiques. FM1-43 chargé dans des terminaux synaptiques de l’errance, troisième stade larvaire NMJ comparant le contrôle génétique (w1118) à Notum mutants nuls (NotumKO). (A), NMJ boutons marqués avec haute [K+] dépolarisation de toute préparation larvaire (haut) ou électrode d’aspiration stimulation d’un nerf moteur (en bas) en w1118 (à gauche) et NotumKO (à droite). (B) chiffrées chargement FM1-43 fluorescence par NMJ comme un nuage de points comparant les forte dépolarisation [K+] et l’électrode d’aspiration stimulation chez les témoins w1118 vs NotumKO mutants. (C) chiffrées chargement de fluorescence sur une base de bouton-par-bouton comme une boîte-et moustaches comparant haute [K+] dépolarisation et électrode d’aspiration stimulation chez les témoins w1118 vs NotumKO . À deux t-tests de l’étudiant ont été effectués pour chaque comparaison avec p-valeurs affichées sur les graphiques. Les barres montrent moyenne ± SEM fait avec prisme (Version 7.0 pour Windows). Les données de stimulation électrique a été adaptées avec la permission de Kopke et al., 144 développement (19) : 3499-510, 2017. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : ultrastructure synaptique avec FM colorant photoconversion pour marquer les vésicules. Fluorescent FM1-43 peut être photoconverted à un précipité dense aux électrons oxydé diaminobenzidine (DAB) pour la visualisation par microscopie électronique à transmission (TEM). (A) A schéma de principe de la méthode photoconversion d’étiqueter la drosophile NMJ après teinture de FM1-43 activité dépendante chargement. (B) représentant TEM image d’un bouton synaptique de type sauvage au repos (non stimulés). Notez la densité de population de taille uniforme SVs. (C) synaptique boutons qui ont été stimulées avec forte dépolarisation de saline [K+] pendant 5 min, sans photoconversion (à gauche) ou avec FM1-43 photoconversion (à droite). Notez la présence de structures d’endosomale en vrac, étiquetés et non. (D) les boutons synaptiques qui ont été stimulés électriquement avec un nerf d’aspiration électrode à 20 Hz pendant 5 min avec aucun photoconversion (à gauche) ou avec FM1-43 photoconversion (à droite). Notez que les vésicules chargées colorant apparaissent beaucoup plus sombres que les vésicules déchargés adjacents. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Haute [K+] la stimulation dépolarisante saline est de loin le plus facile des trois options pour la teinture de FM activité-dépendant du cyclisme, mais probablement la moins physiologique29. Cette méthode simple dépolarise chaque cellule accessible chez l’animal entier et donc ne permet pas aux études dirigées. Il peut être possible d’appliquer localement élevés [K+] une solution saline avec une micropipette, mais cela sera toujours dépolariser les cellules pré/postsynaptique et probablement associés à synapse glia1. Une autre préoccupation majeure est que haute [K+] dépolarisation disques rapide formation d’endosomes en vrac qui sont rarement vus dans les boutons non stimulés. Cependant, en vrac endosome formation est un mécanisme actif bloqué par des mutations29, ce qui indique un processus physiologique réel. Ainsi, l’imagerie FM1-43 avec forte dépolarisation [K+] peut servir à étudier sélectivement l’endocytose en vrac aux synapses. D’aspiration électrode de stimulation électrique du nerf moteur est une méthode beaucoup plus contrôlée. Il a l’avantage que seulement un faisceau seul axone est stimulé, et seulement la termini présynaptique est dépolarisé directement (bien sûr, la fibre musculaire est dépolarisée puis par l’action de l’émetteur). Il offre donc une grande maîtrise interne de NMJ chez le même animal qui ne sont pas stimulés. Cette méthode permet de contrôler étroitement les paramètres de stimulation, contrairement à la méthode de stimulation élevée [K+], ce qui permet une comparaison directe avec l’électrophysiologie enregistrements4. Cependant, cette technique nécessite un équipement spécialisé et un niveau assez élevé de compétence technique et est donc moins accessible. Axée sur la lumière de l’activation de channelrhodopsin ciblé (ChR2) a l’avantage de cibler certains neurones30. Cette méthode ne nécessite aucune familiarité avec les méthodes d’électrophysiologie et peut être faite avec un équipement très bon marché dans n’importe quel laboratoire, mais cette approche nécessite une connaissance de base avec la génétique de la drosophile .

Le choix des paramètres de stimulation est crucial pour les essais dynamiques de cycle SV interrogé dans une fourchette de conditions génétiques avec des phénotypes très variable1. Pour toutes les méthodes, l’extérieur [Ca2 +] utilisé est un paramètre clé contrôlant la force motrice du SV cyclisme. Avec la méthode de stimulation élevée [K+], un choix important est [K+] utilisé, qui détermine le degré de résistance de la dépolarisation. Les mesures de l’hémolymphe de Drosophila indiquent un [K+] de 5 mM et 90 mM est généralement la concentration plus souvent choisie pour la stimulation de l’activité3,7,15,17 , 31. Toutefois, une [K+] allant de 30 à 90 mM a été utilisée pour faire varier la stimulation force5,16,32. Une autre décision de paramètre critique est la durée de la stimulation haute [K+] pour les FM1-43 de chargement et de déchargement. La période de chargement détermine si l’ensemble de la population SV cyclisme est effectivement chargé, ou uniquement un sous-ensemble des vésicules active7. La période pour le déchargement de même dicte le pourcentage de SVs subissant l’exocytose dans la période de stimulation, qui peut révéler ou obscurcir les phénotypes mutants dépendent des taux de change dans le SV cyclisme fréquence2. Avec la stimulation des nerfs moteurs électriques électrode d’aspiration, choix de paramètre comprennent aussi tension de stimulation, fréquence, durée et impulsions intervalle. Temporellement modelé activité est un élément déterminant du SV cyclisme dynamique7, et modes de stimulation différents peuvent mobiliser sélectivement les pools distincts de SV. Avec activation ChR2 axée sur la lumière ciblée, les choix comprennent tous les éléments susmentionnés (avec des variables de l’intensité lumineuse) et des options supplémentaires de transgéniques discutées dans la section suivante. Avec ces paramètres, le choix vient contrôle plus expérimentale, mais également une complexité technique accrue.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) est une chaîne de lumière-gated membrane perméable à mono - et des cations divalents33. Si la stimulation ChR2 est sélectionnée, il y a beaucoup de choix à faire, y compris le pilote Gal4, les SAMU-ChR2 construis et les variables de source lumineuse pour l’activation du canal. GAL4 pilotes vont d’ubiquitaires hautement spécifiques. Par exemple, omniprésent UH1-Gal4 (daughterless) exprimerait ChR2 dans chaque cellule, tandis que CcapR-Gal4 (Janelia) disques ChR2 dans le muscle NMJ 6/7 mais pas le muscle 4 NMJ31,34. Cette sélectivité peut être utilisée comme un puissant contrôle interne. Il y a également de nombreuses variantes de SAMU-ChR2, y compris le ChR2-H134R (utilisé ici ; les résidus muté causes accrue photocourants)35, VChR1, chef et beaucoup plus36. Chacune de ces variantes de canal possède des propriétés distinctes de la lumière, Gate, conductance, sélectivité ionique, cinétique et la désensibilisation. Notez que certaines constructions contiennent une balise fluorescente qui pourrait interférer avec l’imagerie de la FM. Par exemple, le SAMU-ChR2-H134R utilisé ici est le tag mCherry (ex : 587 nm, em : 610 nm), mais ne produit ne pas d’émissions décelable avec le FM1-43 (ex : 479 nm, em : 598 nm) filtres d’imagerie. Paramètre technique choix incluent la source lumineuse, la longueur d’onde et l’intensité pour l’activation du canal. Une option utilisée ici est un bon marché bleu-intérieur LED, avec une stimulation visuelle confirmée en testant les contractions musculaires. Nous avons également réussi à activer le ChR2 utilisant épifluorescence, bien qu’un balayage laser confocal ne suffisait pas. Épifluorescence pourrait servir à une stimulation ciblée (segments spécifiques au lieu de l’animal entier), mais les paramètres de stimulation sont difficiles à contrôler, alors que la LED connectée jusqu'à un stimulateur simple facilement modifie la durée et la fréquence de la lumière impulsions. Concentrant la lumière LED via le port de caméra microscope dissection permet plus contrôlée, intense stimulation lumineuse.

Il incombe à l’expérimentateur de décider ou non de laisser le cordon nerveux ventral/cerveau intact pendant le paradigme de la stimulation. Nous avons choisi de supprimer la totalité du système nerveux central pour la comparaison des trois méthodes utilisées ici, mais parfois le câblage en amont est laissé intacte15. Une complication est qu’endogène activité neurale se produit quand le système nerveux est en entier. Le degré de cette activité est très variable d’un animal à animal, dépendant en grande partie sur l’expertise de dissection de l’expérimentateur. Cette activité variable peut contribuer à la quantité de colorant FM1-43 qui est chargé ou déchargé, qui n’est donc pas uniquement due à la stimulation exogène employée15. Une complication technique connexe est que larves disséquées intactes du contrat la musculature en mouvement fictif, et ce déplacement interfère fortement avec l’imagerie de NMJ. Ce mouvement est atténué si le système nerveux central est retiré et aussi grâce à l’application de Ca2 +-saline gratuite pendant4d’imagerie. Ces approches utilisées ici sont suffisantes pour permettre l’excellent colorant FM1-43 d’imagerie dans la préparation de NMJ. Toutefois, certains expérimentateurs choisissent d’ajouter des médicaments pour inhiber la contraction musculaire (par exemple, de la ryanodine, philanthotoxine-433), ou utiliser le potentiel d’action bloquants (p. ex., la tétrodotoxine)37,38. Une gamme de médicaments peut être utilisée pour manipuler sélectivement le cycle de la SV, afin de mettre en évidence certaines étapes, ou accentuer des phénotypes mutants afin d’examiner les mécanismes de la neurotransmission. Par exemple, certains expérimentateurs ont employé vératridine (active voltage-dépendants Na+ canaux39) pour augmenter la SV de chargement dans le pool de réserve, la cyclosporine A (inhibe l’activité de la calcineurine40) afin d’améliorer l’endocytose de la SV, et La forskoline (active l’adénylate cyclase41, ce qui améliore la transmission synaptique42) pour augmenter l’exo/endo cyclisme piscine7,43,44. Ces manipulations pharmacologiques peuvent fournir des idées supplémentaires. Enfin, FM1-43 fond peut se produire à des degrés divers, basées sur la qualité de la dissection, protocole de stimulation et d’efficacité de lavage. Certains ajoutent un dérivé sulfobutylated de la β-cyclodextrine Advasep-7,45, ou le fluorophore aqueuse sulforhodamine46, pour étancher la fluorescence non spécifique et améliorer le rapport signal-à-fond.

Il existe de nombreuses techniques qui peuvent accompagner les FM fluorescent d’imagerie à une meilleure compréhension du cycle SV (p. ex., électrophysiologie, synaptopHluorin, microscopie électronique). Un exemple illustré ici est photoconversion de fluorescence de FM qui est utilisée pour étudier la SV cycle ultrastructuraux en détail. SVs sont organisé en plusieurs piscines qui sont spatialement et fonctionnellement distinctes2. La piscine facilement libérable (RRP) contient des vésicules immédiatement libérés lors de la stimulation aiguë. Un plus grand bassin de recyclage conserve libération SV dans des conditions d’activité modérée. Une piscine de la réserve interne (RP) est seulement recrutée avec stimulation forte (apparemment près non physiologiques)2. Les piscines de la SV qui sont activées dépendent du type de stimulation utilisée47, et les rapports de la drosophile NMJ utilisant photoconversion FM ont révélé clé aperçu des propriétés fonctionnelles et spatiales de ces différents SV piscines48. FM photoconversion peut être utilisée pour étudier les piscines SV activés sous stimulation différents paradigmes et questions de requête tels que l’interaction trafic longtemps débattue entre les endosomes et SVs49. Si l’expérimentateur s’intéresse à l’imagerie FM en combinaison avec d’autres changements dépendant de l’activité synaptique, il y a un analogue aurait été réparable du colorant FM1-43 (FM1-43FX). Cette sonde doit permettent de fixer la drosophile NMJ après teinture activité dépendante de chargement et puis un suivi avec l’anticorps étiquetage pour tester les corrélations entre le niveau d’activité de bouton (fluorescence de colorant FM) et expression de l’activité dépendante d’un protéine d’intérêt. À l’avenir, il sera extrêmement gratifiant pour explorer des méthodes supplémentaires qui pourraient permettre la combinaison de colorant FM d’imagerie avec d’autres approches d’imagerie à la synapse de modèle drosophile NMJ belle.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.

Acknowledgments

Nous remercions les membres Broadie Lab pour contribution à cet article. Ce travail a été soutenu par les NIH R01s MH096832 et MH084989 à K.B. et NIH pré-doctoral fellowship F31 MH111144 à D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

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Numéro 135 drosophile Neuroscience jonction neuromusculaire FM1-43 électrophysiologie photoconversion microscopie électronique à transmission
FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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