Summary
シナプス小胞 (SV) 神経シナプスでの細胞間コミュニケーションの中核機構は、サイクリングします。FM 色素取り込みと放出は、定量的 SV 遠藤と分泌の試金の主な手段です。ここでは、我々 は FM1 43ショウジョウバエの神経筋接合部 (NMJ) モデルのシナプスでサイクリングを駆動するためのすべての刺激方法を比較します。
Abstract
FM 染料は、シナプス小胞 (SV) サイクルの研究に使用されます。これらの両親媒性プローブには、親水性の頭部と疎水性尾、水溶性膜脂質二重層を可逆的に出入りする能力を持つことがあります。これらのスチリル色素が比較的非水溶液中で蛍光性が細胞膜の外側のリーフレットに挿入、> 40 X 蛍光の増加します。神経シナプスにおける FM 染料は SV エンドサイトーシス、神経伝達のシナプス前の段階を可視化する強力なツールを提供する、内および SV プール間の人身売買とのリリースの SV エキソサイトーシスの中に内面化します。グルタミン酸作動性シナプスの開発と機能の主な遺伝モデルはショウジョウバエ変異条件の広い範囲で SV のダイナ ミックスを定量化する神経筋接合部 (NMJ) は、FM がイメージングを色素が広く使用されています。NMJ シナプス ターミナルは大きなシナプス ボタン イメージング アプリケーションに最適の美しい配列と、簡単にアクセスできます。ここで、我々 は比較対照ショウジョウバエ活動依存した FM1 43 色素取り込み/リリースを駆動する NMJ を刺激する 3 つの方法: 高 [K+] 神経筋組織を脱分極作用、2) 吸引電極運動神経の 1) お風呂のアプリケーションシナプス前の神経ターミナルと 3 を脱分極刺激) は、チャネルロドプシン亜種脱分極の光刺激、空間の制御のための遺伝子組換え発現を対象しました。これらの各メソッドは、利点と欠点 SV サイクルの遺伝の突然変異の効果に関する研究のショウジョウバエNMJ。これらの長所と短所それぞれの戦略に固有の方法論とともに、刺激アプローチの選択を支援するために説明します。蛍光イメージングに加え FM 染料は超微細構造レベルで SV 循環メカニズムを研究する透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いて可視化する電子密度の高い信号に photoconverted をすることができます。我々 は、共焦点の比較を提供および電子顕微鏡イメージングショウジョウバエNMJ 刺激、支援するためのさまざまな方法から将来の実験的パラダイムの選択。
Introduction
ショウジョウバエ幼虫の神経筋接合部 (NMJ) グルタミン酸作動性シナプスの美しく特徴モデルは、シナプス形成と遺伝的摂動1の広大なスペクトルを持つ関数の研究に使用されています。モーターニューロン ターミナルは複数の軸索分岐を多く拡大されたシナプス ボタンのそれぞれから成っています。これらの容量の大きい下肢 (最大 5 μ m) を含む制服グルタミン酸作動性シナプス小胞を含む神経伝達機械のすべて (SVs; 〜 40 nm の直径の) ゾル性細胞質の準備で容易に脱着可能なプール2。これらの小胞はシナプス前膜融合サイト アクティブ ・ ゾーン (AZs)、エキソサイトーシスがトランスのグルタミン酸神経伝達物質を仲介でドック-シナプス通信。その後、SVs は繰り返し exo/エンドサイトーシス サイクルのキス-実行のリサイクルやクラスリン依存性エンドサイトーシス (CME) を介して細胞膜から取得されます。ショウジョウバエNMJ は簡単にアクセス可能で、分離して SV サイクル変異体の特性の両方に適しています。前方遺伝スクリーンを使用した新規変異は SV サイクル3の重要な新しい遺伝子の同定につながっています。また、既に知られている遺伝子で始まる逆遺伝学的アプローチは、変異体の表現型4をサイクリングの注意説明を通じて新しい SV 循環メカニズムの解明につながっています。ショウジョウバエNMJ はほぼ光学トラック小胞神経伝達中にサイクリングするメソッドを介して SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスのメカニズムを解剖するための実験的シナプス準備として最適です。
蛍光マーカーの範囲ことが力学をサイクリング中に小胞の視覚追跡ですが最も汎用性の高い FM 色素類縁体を f.、真央らによって初めて合成されました。5. 構造上、FM 染料を含む水性頭とつながっている芳香環、中部のスペクトル特性を付与と脂溶性尾。これらのスチリル色素膜で可逆的にパーティションはない 'フリップフ ロップ' 膜リーフレットの間、ですから、無料、細胞質で、水5よりもはるかに多く蛍光膜です。脂質二分子膜へのリバーシブルの挿入は、蛍光640 増加を引き起こします。神経シナプスで古典的な FM 色素標識実験 SV エンドサイトーシスを介して色素をロードする刺激を脱分極中に染付シナプス準備を入浴で構成されます。外部の色素は離れて洗浄し、SV サイクルは読み込まれたシナプス7をイメージさせるカルシウム無料リンゲル液で逮捕されました。色素フリー バースの刺激の第 2 ラウンドは、エキソサイトーシス、蛍光強度の減少を測定することによって続くことができるプロセスを介して FM リリースをトリガーします。小胞の数百を含むプールを単一の小胞から SV 集団は、定量的に監視対象6,7をすることができます。FM 染料は、機能的に異なる SV プールの活動依存的動員を解剖して CME サイクリング8,9対キス-実行を比較するために使用されています。メソッドは、アッセイ別の誘発、自発的なミニチュアのシナプス サイクル活動 (非常に小さい蛍光変化を検出し、退色を低減する高感度の機器) を10に変更されています。試金によって拡張できます微細構造のレベルに photoconverting 蛍光 FM 信号伝達電子顕微鏡11,12,13,14 の電子密度の高いラベルに.
歴史的には、高濃度カリウム (以下「高 [K+]」という) の入浴シナプス準備サイクリング; SV を誘発する刺激を脱分極の選択の方法をされているカエル コリン作動性 NMJ5からまでは、げっ歯類脳海馬ニューロン15、ショウジョウバエグルタミン酸 NMJ モデル16,17に培養。この高 [K+] アプローチは簡単です、特殊な装置を必要としないとほとんどのラボにアクセスできます制限がありますアプリケーションのデータの解釈。神経4,5,12吸引電極電気刺激を使用する大いにもっと生理学的に適切な方法です。このアプローチはシナプス前神経直接刺激の活動電位伝搬をターミナル、ドライブおよび伝達関数13,14、電気生理学的アッセイに結果を直接比較すること 15、しかし特殊な装置を必要として技術的にはるかに困難です。チャネルロドプシン神経刺激の使用は、光遺伝学の出現により、バイナリ Gal4/UAS システム20を使用して、チャンネル式のタイトな時空間制御を含むその他の利点することができます。この方法は技術的に吸引電極刺激よりもはるかに簡単です、何も非常に安い LED 光源以上が必要です。ここでは、我々 は FM1 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) ピリジニウム臭化) をして両方比較してショウジョウバエNMJ でこれらの 3 つの異なる刺激の方法の画像を採用して: 単純な高 [K+]、電気と新しいチャネルロドプシンのアプローチに挑戦します。
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Protocol
1. 幼虫の接着剤剥離
- 10 部 1 部硬化エラストマー キット (材料表) から剤シリコーン ・ エラストマーをベース シリコーン ・ エラストマーを徹底的に混ぜます。
- (もはやべたべたする) まで数時間 22 x 22 mm ガラス coverslips エラストマーと 75 ° C のホット プレートに治療をコートします。
- 幼虫の解剖のための準備にカスタムメイドのプレキシ ガラス解剖室 (図 1の一番下) に単一のエラストマー コーティング ガラス基盤を配置します。
- 標準的な電極の引き手を使用して目的のテーパーを取得して先端サイズ ホウケイ酸ガラス毛管から接着剤ピペットを準備します。
- 優しくマイクロ ピペット チップ、そしてもう一方の端に、柔軟なプラスチック製のチューブ (1/32"内部の直径、ID 3/32" 外径、OD; 1/32"の壁の 2 フィートを添付材料の表)口 (P2 ピペット チップ) をフィッティングします。
- 幼虫の解剖に備えて接着 (材料表) の体積 (~ 20 μ L) が小さく、小さい容器 (0.6 mL エッペン チューブ キャップ) を入力します。
- (MM) に生理食塩水でチャンバー: 128 NaCl、2 KCl, 4 MgCl2、1 の CaCl2、70 ショ糖および 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 酸 (HEPES) pH 7.2。
- Alexa Fluor 647 に共役反わさびペルオキシダーゼ (HRP) 抗体を追加 (反-HRP:647; 希釈 1:10 1 mg/mL 在庫から) 略記をラベリングのため郭清21,22におけるシナプス前ターミナル。
- 細かい絵筆 (サイズ 2) を使用して、食品バイアルから放浪 3 齢を取り外し、エラストマー被覆カバーガラスの上に置きます。
- 添付ファイル (手順 1.5) で口によって生成された負圧利用による接着剤の少量をガラス マイクロ ピペット チップを埋めます。
- 位置幼虫背側を鉗子と糊小さなエラストマー コーティング coverslip の頭を口の中で肯定的な空気圧を使用して接着剤のドロップを使用。
- 2 つの接着剤の添付ファイルのピンと張った動物が拡大されることを確かめて、幼虫の後端でこの手順を繰り返します。
- はさみを使用して (刃 3 mm;材料表)、後部と背側の正中線に沿って垂直カットで水平カット (~ 1 mm) を作る。
- 微細鉗子 (#5、材料表) を使用して優しく背気管、腸、脂肪体、その他の内臓の筋肉をカバーを取り外します。
- 水平方向および垂直方向にゆっくり体壁を伸ばすようにして 4 つの体壁フラップ接着の手順を繰り返します。
- 鉗子による腹側神経索 (VNC) を持ち上げて慎重に運動神経をはさみでカット VNC を完全に削除します。
- 解剖生理食塩水に置き換えて Ca2 +-無料 (CaCl2上記解剖生理食塩水と同じ) に生理食塩水の SV を停止するサイクリングします。
2. オプション 1: 高 [K+] FM 色素読み込み
- FM1 43 在庫ソリューション (4 mM) から 90 mM KCl ソリューション (高 [K+] 解剖生理食塩水で) 4 μ M の最終的な集中のための 1 mL に 1 μ L を追加します。
- 交換、ピペットを使用して Ca2 +のイメージング室 SV エンドサイトーシス染料の通風管を刺激するために高い [K+] FM 色素溶液における無料生理食塩水。
- すぐに脱分極刺激周期高 [K+] の前もって決定された持続期間のためのデジタル タイマー (e.g。、5 分。図 2)。
- 健康な幼虫の準備を確認するには、高度 [K+] 脱分極期の持続期間のための筋肉の強い収縮に注意してください。
- タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K+] FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
- Ca2 +と立て続けに洗って-高 [K+] FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
3. イメージング: 共焦点顕微鏡
- 水浸対物レンズ (その他の顕微鏡を使用することができます) 画像 NMJ 色素蛍光 X 40 で直立した共焦点顕微鏡を使用します。
- イメージ筋腹部セグメント 2-4 (他の NMJs をイメージすることができます) の 4 NMJ と適切なソフトウェア (資材表) を使用して画像を収集します。
- (ロングパス ・ フィルター > 635 nm) と HRP:647 と (バンドパス フィルター 530-600 nm) で FM1 43 を励起するのにアルゴン 488 nm レーザーを励起するのに HeNe 633 nm レーザーを使用します。
- 運用上最適な利得と両方のチャネルのオフセットを決定します。
注: これらの設定は、実験の残りの部分全体で一定になります。 - シナプス ターミナルの下に HRP マーク上から全体の選択した NMJ を共焦点 Z スタックを取る。
- FM 染料のアンロード後に正確な同じ NMJ 過剰ように NMJ イメージ (セグメント、側筋) の注意を取る。
4. 高 [K+] 刺激: FM 色素をアンロード
- Ca2 +を交換-無料生食ドライブ脱分極に FM1 43 色素) を除いた高 [K+] 食塩を SV のエキソサイトーシスと染料のリリース。
- すぐ高 [K+] 刺激周期の前もって決定された持続期間のためにデジタル タイマー (e.g、2 分;。図 2)。
- タイマー期間が終了すると、すぐに高い [K+] 生理食塩水を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
- Ca2 +と立て続けに洗って-無料生理食塩水 (1 分の 5 倍) の高 [K+] 生理食塩水が完全に削除されていることを確認します。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
- 必ず同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光をイメージしてください。
5. オプション 2: 電気刺激 FM 色素読み込み
- 電極の引き手 (資材表) を使用して必要なテーパーを取得して先端サイズ吸引ピペットを準備します。
- 火-ポーランド語マイクロ フォージで電極先端まで単一の運動神経は、タイトなフィットを吸い上げることができます。
- マイクロマニピュレーターの電極ホルダーに吸引ピペットをスライドさせ、長く柔軟なプラスチック製のチューブと注射器を付けます。
- 刺激パラメーターを設定 (例えば.、15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2) または 1 分 (図 3))。
- Ca2 +を交換-無料生理食塩水生理リグに FM1 43 食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl2) 上記と幼虫の準備に。
- 顕微鏡ステージの準備を入れて幼虫および吸引ピペットがフォーカス (40 X 水浸対物レンズ) になるまでステージを上げます。
- 負圧吸引電極に注射器によって生成されると選択した hemisegment を支配するカットの運動神経のループを吸います。
- 選択した hemisegment の筋肉の収縮を視覚的に監視しながら刺激を短時間で吸引電極機能をテストします。
- 選択したパラメーター (ステップ 5.4) SV エンドサイトーシスをドライブして FM1 43 染料の通風管 (図 2) を使用して運動神経を刺激します。
- Ca2 +と立て続けに洗って-FM1 43 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-上から共焦点イメージング プロトコルを使用して即時画像無料生理食塩水。
- NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。
6. 電気刺激: FM 色素をアンロード
- Ca2 +を交換-無料の FM1 43 色素) を除いた正規の生理食塩水を生理食塩水と電気生理学リグ ステージに戻り準備を配置。
- 荷を下すことのための刺激パラメーターを設定 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間 20 ms、時 2 分 (図 2) または 20 s (図 3))。
- 上記のように、同じ電極に同じ運動神経を吸うし、SV エキソサイトーシスと FM1 43 色素リリースをアクティブにし、刺激します。
- Ca2 +と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
- 同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。
7. オプション 3: チャネルロドプシン刺激 FM 色素読み込み
- ChR2 を表現する幼虫 (100 μ M 最終濃度で溶解し、エタノール; ChR2 共同因子すべて trans 網膜を含む食品を上げます。
- カメラ ポート装備されて解剖顕微鏡ステージにプレキシ ガラス室で幼虫の準備を配置します。
- 青色 LED を添付 (470 nm;材料の表)プログラム可能な刺激に同軸ケーブルを使用して、カメラのポートに LED を配置します。
- 顕微鏡ズーム機能を使用して切り裂かれた幼虫関数の上に青い LED 光線の焦点を合わせます。
- Ca2 +を交換-無料生理食塩水での準備作業は、幼虫の FM1 43 生理食塩水 (4 μ M; 1 mM CaCl2) 上記光ステージ上に。
- 刺激装置 (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、時間 5 分 (図 2)) を使用して LED のパラメーターを設定します。
- 光刺激を開始し、(例えば、5 分の光遺伝学的刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡図 2)。
- タイマーが止まったら、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
- Ca2 +と立て続けに洗って-FM 色素溶液を完全に削除できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-共焦点顕微鏡上から撮像プロトコルを使用して即時イメージングのため無料生理食塩水。
- NMJ イメージ (セグメント、側と筋肉) FM 色素をアンロードした後正確な同じ NMJ へのアクセスを確保するための注意を取る。
8. チャネルロドプシン刺激: アンロード FM 色素
- Ca2 +を交換-カメラのポート LED を解剖顕微鏡ステージ上 FM1 43 色素) を除いた通常生理食塩水で無料生理食塩水は、幼虫に焦点を当てた。
- アンロード (例えば15 V、20 Hz の周波数、持続時間を 20 ms、2 分 (図 2) の時間) の刺激パラメーターを設定します。
- 光刺激を開始し、光刺激周期の前もって決定された持続期間のためのタイマーと追跡 (例えば、 2 分;図 2)。
- タイマー期間が終了すると、すぐに FM 色素溶液を削除し、置き換えます Ca2 +-SV を停止する無料生理食塩水サイクリングします。
- Ca2 +と立て続けに洗って-外部の色素を完全に除去できるように無料の生理食塩水 (1 分の 5 倍)。
- 新鮮な Ca2 +で幼虫の準備を維持-即時共焦点顕微鏡イメージングのため無料生理食塩水。
- 同じ共焦点設定を使用して上記同じ略記で FM1 43 色素蛍光を画像を確認します。
9. 蛍光定量
- 画像 J (NIH オープン ソース) で画像を読み込み、画像をクリックして最大強度投影を作成 |スタック |Z プロジェクト。
- 反を使用して-HRP:647 チャネル、イメージを行く |調整 |しきい値とスライド上部のツールバー NMJ だけがハイライトされるまで。
- 選択ツールを使用して、略記をクリックします。略記が不連続で、Shift ボタンを押したまま、すべての部品を選択します。
- FM1 43 色素チャンネルに画像を変更し、分析に行く |蛍光測定値を取得するための対策。
- 「無負荷」イメージの同じ略記 (識別セグメント、側筋) から、9.1 9.4 手順を繰り返します。
- 読み込まれた染料の割合を得るためには、アンロードとロードの蛍光強度の比を取る。
注: この手順は、「フリーハンド」、「楕円形」または選択ツールを使用してブートンあたりブートンに蛍光を分析する変更できます。背景の蛍光性は筋肉蛍光をサンプリングすることによって減算することができます。このような背景を減らすために、エージェントを追加もできます。
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Representative Results
図 1は、活動依存した FM 染料のプロトコルをイメージングのための作業フローを示します。実験は、その後使用される刺激方法に関係なく、同じ幼虫接着剤郭常に始まります。図 1 aは、神経と繰り返し hemisegmental 筋パターンを放射腹側神経索 (VNC) を示す切り裂かれた幼虫の模式図です。VNC は削除され準備を浴びて FM1 43 (図 1 b、ピンク) の 4 μ M ソリューション。準備は、活動依存した SV エンドサイトーシス (図 1cI-III) を介して色素をロードする 3 つのオプションのいずれかを使用して FM 色素の存在下で刺激されます。次に、FM 色素サイクリングには Ca2 +を使用して、逮捕されて-無料生理食塩水と FM 色素ロードされている特定 NMJ ターミナル イメージ共焦点顕微鏡 (「読み込まれたイメージ」。図 1 d)。この場合、神経、NMJ 端子分岐および FM の回路図を示す配置で選択される 4 NMJ 筋シナプス ボタンが読み込まれます。シナプスの準備は SV エキソサイトーシスと FM1 43 リリース (図 1e) を駆動する FM 色素の欠如は、上記を選択同じ方法を使用して 2 番目の時間のために刺激されます。同じ識別 NMJ (この例では 4 NMJ 筋肉) 再 HRP:647 シナプス ラベルと残留 FM1 43 小胞信号 (「画像をアンロード」; を使用してイメージ化し、図 1 階)。実験者は、強度および特定のアッセイまたは変異条件の測定を最適化するフェーズを積みおろしの期間を決定します。ロードとアンロード (図 1 d、1 f) 後の蛍光強度を定量化、シナプス色素エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの割合の測定値を得るにリリース FM 色素をロードします。全体 NMJ または単一ボタンの解析を行うことができます。
FM 色素 3 つの方法で刺激することができるサイクリング: 全体の準備運動神経の 2) 吸引電極刺激やターゲットを絞ったチャネルロドプシン (ChR2; の駆動活性化 3) 光の脱分極を生理食塩水 1) 高 [K+]図 2)。3 つの方法を直接サイド ・ バイ ・ サイド比較は、FM1 43 (ロード) の存在下で 5 分間放置、FM1 43 (荷) の不在で 2 分それぞれの方法で刺激し、HRP 標識の NMJs と同じ共焦点設定 (を使用してイメージを作成図 2)。高 [K+] 生理食塩水脱分極方法幼虫の郭清のピンの代わりに接着剤を用いて除いてショウジョウバエ幼虫 NMJ23の広く使われている FM1 43 プロトコルに従います。接着剤顕微鏡対物レンズとの干渉を回避体壁張力のより精密な決定をできるように、適度な学習曲線を必要は。すべての 3 つの方法は、強力かつ一貫した蛍光信号 NMJ シナプスブートン アーバー全体および個々 のシナプス ボタン (インセット) 内を生成します。高 [K+] 生理食塩水脱分極メソッドによって、動物 (図 2 a中間) のすべてのニューロンを脱分極と幼虫の中で FM ロードするすべての NMJs です。神経吸引電極の電気刺激法を対応する支配する運動神経がずっと刺激 (図 2 b、真ん中) 幼虫の 1 つ hemisegment にだけ運転します。同じ動物で些細セグメント HRP ラベルを使用して区別することは読み込み、観察可能な蛍光色素が含まれていない、優れた内部統制としています。光 ChR2 メソッドは、トランスジェニック Gal4 ドライバー採用 (図 2) に依存する対象となる脱分極を生成します。ここでは、ドライバーは、小胞グルタミン酸トランスポーター (vglut) Gal4、ので、すべてのグルタミン酸作動性ニューロンはグルタミン酸作動性ニューロンのすべてを含む青色の光刺激脱分極をでした。その結果、この例では (図 2中間) FM1 43 染付すべて NMJs が読み込まれます。セル固有のドライバーは、特定の NMJs にラベルを付けると、他の内部統制のラベルなしのまま使用できます。
染料を読み込むために使用された同じメソッドを介して達成された FM 色素をアンロードします。最初の方法で幼虫の準備だけを浴びていたドライブ SV 分泌細胞を脱分極し、シナプス終末 (図 2 a右) をアンロード FM1 43 の不在で高 [K+] 生理食塩水。我々 は通常短いアンロード期間 (2 分) を選択、だからアンロードは部分的であり端末が FM チャンネルで表示されたまま。同じ hemisegment に戻って、同じ神経を識別し、再色素アンロード (図 2 b をドライブに FM1 43 の不在で、神経を刺激することが伴うために、かなり難しく、吸引電極電気刺激で荷を下すことは、右)。染料のアンロード部分が再度ことに注意してください。ChR2 アンロード FM1-43 チャンネルをアクティブにし、運動ニューロンを脱分極 SV エキソサイトーシス色素リリース (図 2、右) を刺激するがない場合は幼虫の準備のブルーの LED 照明の第 2 期が伴います。アンロード (2 分) のこのタイム スケールと偏光解消度これらの各メソッドのアンロード高 [K+] でロードの FM1 43 染料の割合だけ最強と ChR2 色素リリース (図 2) を運転中で最も弱い。LED 光の強度を使用 (140 μ/mm2)、公開されている範囲 (20-1000 μ/mm2)24,25,26にあったを測定しました。ChR2 は、ChR2 効果幼虫27,28に供給 ATR 濃度にも依存で、50-200 mW の光源から 〜 1 mW 照射による最大限に活性化します。したがって、ChR2 刺激強度を操作できます。さらに、関係ない刺激強度やスケールのための遺伝子型と真で残ることがあります。実験者が SV エンドサイトーシスを減少している変異体を操作、通常分泌を高速刺激パラメーターをアンロードした後観測信号を維持するために変更する必要があります。抗ハプテン ラベル FM 信号の完全な不在でも NMJ を識別することができますが、これは定量化に最適ではありません。原則として、アンロード刺激負荷刺激から別の種類のもあります。
最近電気刺激4を使用して SV サイクルで分泌されたシナプス deacylase Notum 効果の損失を調べた。ここでは、1) 高 [K+] 分極防止作用および 2) 吸引電極運動神経刺激法 (図 3) を比較するこの分析を拡張する.我々 は見つけること両方のメソッドは、同様の結果を与える、表示削減 FM1 43 染料のローディングNotum null 変異株;しかし、表現型の程度は異なる 2 つの方法の間です。高 [K+] 生理食塩水 5 分で脱分極後Notum null 変異体 (NotumKO および高レベルで遺伝的背景制御 (w1118) 間ロードの蛍光強度の減少幅の大きいがあります。 ) が低い (図 3 a上)。定量化された測定で HRP 説明 NMJ 端末内で正規化された FM の蛍光強度が Notum ( NotumKO 0.57 ± 0.07 対w1118 1.0 ± 0.05; p n≥13 の不在で削減します。< 0.0001;図 3 b)。とき全体 NMJ 蛍光 (w1118 1.0 ± 0.05 NotumKO 対 1 分 20 Hz の電気刺激は後、は、我々 はロードの FM1 43 強度コントロールとNotum null との間の些細な減少を見つける 0.86 ± 0.06;n = 8, p = 0.10;図 3 aB)。ブートンあたりブートンに色素結合を測定するとき、我々 は染料の両方の方法でロードの大幅な減少を見つけます。高 [K+] 生理食塩水で刺激した後定量測定でブートンあたり正規化された FM の蛍光強度が大幅に低下 (対島Notum 0.52 ± 0.02w1118 1.0 ± 0.02; n≥241、 p< 0.0001;図 3)。電気刺激後ブートンあたり正規化蛍光強度も大幅低下、とはいえ低度 (対島Notum 0.83 ± 0.02w1118 1.0 ± 0.02; pn≥127 < 0.0001;図 3)。
2 つの刺激パラダイムの結果違い可能性がありますいくつかの要因。まず、刺激強度が大きくなると推定される高 [K+] モーター神経の電気刺激と比較して。高 [K+] 食塩存在下における電気生理学の録音を行うことができないが、幼虫の neuromusculature は明らかにしっかり刺激されて、筋肉の収縮が強く、5 分入浴期間中継続的に。しかし、強さや刺激の周波数をわかりません。対照的に、電気刺激はより正確な電圧強度と刺激の周波数を選択するユーザーによって制御されます。第二に、刺激期間が長かった高 [K+] 神経電気刺激 (図 3) と比較して。1 分繰り返し試験後 20 Hz の電気刺激を選びました。色素負荷 1 分後が刺激の 5 分はさらに強力な蛍光信号 (図 2) を与えた私たちは私たちの研究の4、そのパラダイムを選んだので強力かつ信頼性の高い FM1 43 の信号があった。したがって、刺激パラダイムの長さ可能性が高い高 [K+] および電気刺激 (図 3 bC) の間で FM1 43 ロードの大きさ変動に貢献しています。高 [K+] メソッドNotum変異体のより堅牢な表現型を示したが,、まだ大きい制御4のため電気的手法を使用しました。強度、頻度の刺激の持続時間などを制御する多くのパラメーターがあり、それらの設定の変異と質問する必要がありますに基づいて決定します。たとえば、刺激法の選択によって決まるかもしれない SV 尋問プール7活動依存したメカニズム調査10。
FM1-43 NMJ ターミナルを読み込んで後、電子顕微鏡観察 (図 4) の電子密度の高い信号を生成する蛍光色素の光電採用できます。この方法では色素ロード準備は暗い沈殿物 (図 4 a)11を作成する軽打を酸化 FM 色素から活性酸素種ジアミノベンジジン (軽打) の存在下で強烈な蛍光灯に公開されます。完全な詳細12のスチリル色素の光電のゼウスの記事をご覧ください。この方法の利点は微細構造のレベルでは、Sv は明らかに明確に、SV サイクルはもちろん静的な電子顕微鏡イメージングと逮捕されました。刺激のない場合は、ショウジョウバエNMJ でシナプス ボタンが密集搭載小胞 (〜 40 nm 径の図 4 b)、拡大された細胞小器官のまれな出来事とサイクリング エンドソームと推定される (>100 nm の直径)。刺激を強く変性高 [K+] 生理食塩水が SV 人口の部分的な枯渇、多く拡大された細胞小器官の急速な蓄積と、このプロファイルを変更 (>100 nm の直径) は一括から得ると考えられるエンドサイトーシスの膜 (図 4、左)。刺激されないコントロールに似たような区画が存在します、高 [K+] 生理食塩水脱分極後これらのオルガネラの高密度はこれが非生理的反応である懸念を提起します。吸引電極運動神経の電気刺激は、枯渇する SV 人口が比較的効率的です、拡大エンドソーム小胞 (図 4、左) の詳細を生成しません。高 [K+] 脱分極による一括エンドサイトーシスがより強い需要時に SV の人口を維持するのに役立つことが示唆されました。
FM1 43 光電は、安静時のブートン (図 4) を基準にしてシナプスの微細構造を比較する高 [K+] 生理食塩水脱分極または吸引電極運動神経の電気刺激を使用して実現できます。高 [K+] 脱分極刺激、個々 の SVs と拡大小胞 (>100 nm の直径) は、電子密度の高い軽打沈殿物次光駆動光変換 (図 4右) でラベル付けできます。未知の理由のため拡大小胞膜は通常小さい SV 膜よりもより密ラベル付きです。また、膜だけが、これはそれらをより見やすくラベル小胞を区別なくも SVs はしばしば軽打の沈殿物でいっぱい表示されます。吸引電極運動神経の刺激とは、ラベルのない SVs (図 4右) を基準にしてサイクリングの SV 人口をマークできます。電気刺激で小胞を拡大 (>100 nm の直径) 探索可能ボタンと、一貫して、推定の膜形成されていないエンドソームは FM1 43 光電によって分類されません。として、上記サイクリング SVs 通常で満ちている軽打ややまとまった形で析出物と刺激 (図 4右) の間に形成されていない SVs 区別したがってより簡単に。光電 ChR2 刺激をまだ実行していない我々 は。刺激の別の時間のコース、FM1 43 色素の光電 SVs が形成されて、どの Sv、人身売買、およびシナプスのブートン内で異なる空間プール間の運動のタイミングを決定することができます。高 [K+] と神経刺激の比較は、一括、単一の SV エンドサイトーシス機構の解剖をことができます。
図 1: FM1 43 染料のローディングショウジョウバエNMJ でプロトコルのフローチャート。幼虫接着解離生成平坦化された neuromusculature の準備、腹側神経索 (VNC) と腹側正中 (Vm) から、hemisegmentally に神経を投影する体壁を繰り返し筋肉の配列 (ステップ、)。VNC は無料、カット、全体の幼生解離をインキュベーションする刺激 (ステップ b) に備えてピンク FM1 43 ソリューション (4 μ M) で。FM1 43 が選択した刺激パラダイム (ステップ 3) で読み込まれます全体の幼虫 (cI) の高 [K+] 脱分極のオプション、単一運動神経 (cII) の電極刺激や絞ったチャネルロドプシン (cIII) の光による活性化を吸引します。FM1 43 定款は、Ca2 +を使用して逮捕される-無料生理食塩水と染料ロード NMJ イメージ (手順 d.)。2 番目の刺激染料のシナプス小胞のエキソサイトーシス (ステップ メール) を運転するバスで FM1 43 なく行われます。同じ NMJ はアンロードされたシナプス ターミナル (ステップ f) を試金するため再イメージ化します。蛍光強度は、ロードおよびアンロード NMJs SV エンドサイトーシス、エキソサイトーシスの SV レベルを定量化するから測定されます。下のパネルは、構築パラメーターとこれらの研究に使用される透明アクリル チャンバーの寸法を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FM 色素刺激のすべてのメソッドの読み込みとアンロードの比較。染料のローディングと全体幼虫準備 (トップ), 1) 高 [K+] 脱分極と放浪 3 齢 NMJ のアンロード 2) 吸引電極電気刺激運動神経 (中央) の FM1 43 の比較、3) 光駆動運動ニューロン (下) のみにターゲットを絞ったチャネルロドプシン (ChR2) の活性化。アンチ ラベル (A) 幼虫 NMJ-HRP:647 シナプス前膜マーカー (青、左)、5 分 (中央) 高 [K+] 脱分極を介して FM1 43 でロードされ、脱分極 [K+] 高 2 分 (B) を介してアンロード両方 FM1 43 染料の読み込みとアンロードのため同じ刺激期間吸引電極電気神経刺激との比較。(C) vglutをターゲット-Gal4>ブルーでアクティブ化された運動ニューロンの UAS ChR2 H134R 式 (470 nm) FM1 43 色素をロードおよびアンロードの同じ刺激期間の光。アスタリスクは、くぼみより高い倍率のボタンを表示するを参照してください。スケール バーは、10 μ m、はめ込みシナプス研究拡大の主要なパネルから 3.5 X。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Notum null 変異体は、減らされた FM 染料のシナプス ボタンのローディングを表示します。FM1 43 放浪のシナプス終末に読み込まれるがNotum null 変異体 (Notum島) に NMJ 遺伝的コントロール (w1118) との比較を第三令します。(A) NMJ 研究全体幼虫準備 (top) の高 [K+] 脱分極やw1118 (左) とNotumKO (右) 1 つの運動神経 (下) の吸引電極刺激が付いた。(B) 限定高 [K+] 脱分極とKO Notum変異体対w1118コントロールで吸引電極刺激を比較する散布図として NMJ あたり FM1 43 蛍光を読み込まれます。(C) 限定ロード高 [K+] 脱分極と島Notum 対w1118コントロールで吸引電極刺激比較ボックス ウィスカのプロットとしてブートンあたりブートンに蛍光.スチューデントの両側 t 検定は p - 値をグラフに表示各比較のため行った。バーは、平均 ± SEM プリズム (Windows のバージョン 7.0) で作られたを表示します。電気刺激データは Kopkeらからの許可に適応されている。、開発 (19) 144:3499-510、2017。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 小胞をマークする FM 色素の光電とシナプスの微細構造。蛍光 FM1 43 酸化ジアミノベンジジン (軽打) の電子密度の高い沈殿物の透過型電子顕微鏡 (TEM) 経由で可視化する photoconverted をすることができます。(A) A 光電ラベルを次の活動に依存した FM1 43 染料のローディング. ショウジョウバエNMJ 方法の模式図野生型のシナプスブートン安静 (些細) の (B) 代表的な TEM 画像。大きさの均一 SVs。 (C) シナプス研究高光電 (左) なしの 5 分間 [K+] 生理食塩水脱分極、FM1 43 光電 (右) に刺激されているの密な人口に注意してください。一括エンドソーム構造、ラベルし、ラベルの存在に注意してください。神経電気刺激されている (D) シナプス研究は FM1 43 光電 (右)、(左) ない光電と 20 Hz で 5 分間の電極を吸引します。染料読み込まれた小胞の多く暗く隣接するアンロードされた小胞よりも注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
高 [K+] 生理食塩水脱分極刺激は、サイクリング、活動依存した FM 色素が可能性が高い少なくとも生理的29の 3 つのオプション、はるかに簡単です。この簡単な方法は、全体の動物のすべてのアクセス可能なセルを脱分極し、監督の研究を許可しませんので。ローカル高 [K+] 生食、マイクロ ピペットに適用することがありますが、これはまだ前/後シナプス細胞とシナプス関連グリアの可能性が高い1を脱分極します。別の主要な関心事は、その高 [K+] 脱分極ドライブの急速な形成物質研究で稀だけ見られている一括エンドソームです。ただし、一括エンドソームの形成は、突然変異によって29、本当の生理過程を示すブロック アクティブなメカニズムです。したがって、FM1 43 高 [K+] 偏光イメージングは、選択的にシナプスに一括エンドサイトーシスを研究に使用できます。吸引電極運動神経の電気刺激より制御された方法です。単一軸索のバンドルのみを刺激すると、そのシナプス前テルミニのみが脱分極である直接利点があります (もちろん、筋線維は伝達物質の作用により、脱分極)。したがって、刺激がない同じ動物の NMJs の偉大な内部制御を提供します。このメソッドでは、高 [K+] 刺激法、電気生理学録音4との直接比較を有効にするとは異なり、刺激条件を厳密に制御することができます。しかし、このテクニック専用の装置と技術のかなり高いレベルが必要です、つまり、アクセスしにくい。ターゲットを絞ったチャネルロドプシン (ChR2) の光駆動型活性化ターゲット選択ニューロン30の利点があります。このメソッドは電気生理学の方法に精通しているを必要とせず、任意のラボで非常に安い機器で行うことができますが、このアプローチはショウジョウバエの遺伝学の基本的な知識を必要とします。
刺激パラメーターの高い変数表現型1遺伝的条件の範囲内で照会 SV 周期ダイナミクスをテストするために非常に重要です。すべてのメソッドの使用 [Ca2 +] 外部は SV の原動力を制御する重要なパラメーター サイクリングします。重要な選択は、高 [K+] 刺激法 [K+] 脱分極の強さの程度を決定するを使用する。5 mm [K+] で示し、90 mM は通常活動刺激3,7,15,17の選択ほとんどの場合濃度ショウジョウバエ体液の測定,31します。 ただし、30 〜 90 ミリメートルから [K+] の範囲は、異なる刺激強度5,16,32に雇われています。もう一つの重要なパラメーターの決定は、読み込みとアンロード両方 FM1 43 高 [K+] 刺激の長さです。読み込みの期間は全体サイクリング SV 人口は効果的に読み込まれたかどうか、アクティブな小胞7のサブセットのみを決定します。同様に刺激周期で開口放出を受けることができますどちらかを明らかにするかあいまいな表現型変異率に依存して SVs の割合が変化するサイクリング周波数の2SV の指示をアンロードするための期間。吸引電極電気モーター神経刺激パラメーターの選択肢は刺激電圧、頻度、持続期間および脈拍の間隔も含まれます。一時的パターン活動ダイナミクス7、サイクリング SV の主要な決定要因とは異なる刺激パターンが異なる SV プールを動員することが選択的に.対象となる光駆動 ChR2 の活性化と、選択肢には (光強度変数) と上記のすべてが含まれて、追加トランスジェニック オプションについて、次のセクション。これらのパラメーターの選択肢はより実験の制御だけでなく、技術的な複雑さの増加。
チャネルロドプシン 2 (ChR2) は、モノと二価のカチオン類33を透過光ゲート膜チャネルです。ChR2 刺激が選択されている場合、Gal4 ドライバー、UAS ChR2 構造チャネル活性化のための光源の変数などに多くの選択肢があります。Gal4 ドライバー範囲からユビキタス非常に特定です。たとえば、ユビキタス UH1 Gal4 (daughterless) CcapR Gal4 (Janelia) は、筋肉で ChR2 をドライブに対しあらゆる細胞に ChR2 を表現 6/7 NMJ が筋 4 NMJ31,34ではないです。この選択は、強力な内部統制として使用できます。ChR2 H134R (ここで使用されて; 残基変異の原因の増加当てる)35VChR1、最高経営責任者、多くより36を含む多くの UA ChR2 亜種同様にあります。各チャネルのこれらの亜種は光ゲート、コンダクタンス、イオン選択性、反応速度論、脱感作の異なるプロパティがあります。いくつかの構成要素に FM イメージングを妨げる蛍光タグが含まれて注意してください。MCherry が付いた、UAS-ChR2-H134R ここで使用されるたとえば、(ex: 587 nm、em: 610 nm)、FM1 43 検出可能排出ガスを生成しない (ex: 479 の nm、em: 598 nm) イメージング フィルター。技術的なパラメーターの選択肢には、光源、波長およびチャネルの活性化のため強度が含まれます。ここで使用されるオプションは、試金の筋収縮によって確認された視覚的に刺激と青色発光の格安の LED です。ChR2 を活性化に成功したまた、落射蛍光を使用して走査型共焦点レーザーはありませんでしたが。落射蛍光はターゲット刺激 (全体の動物の代わりに特定のセグメント) に使用できるが、刺激パラメーターは、単純な刺激まで簡単に接続されている LED 期間と光の周波数を変化させるに対し、制御が困難パルス。集中解剖顕微鏡カメラのポートを介して LED ライトより制御された、強烈な光刺激をことができます。
実験者腹側神経コード/脳を刺激パラダイムの中にそのまま使用するかどうかを決定する次第です。ここでは、3 つの方法の比較のための全体の中枢神経系を削除する私たちを選んだが、ある上流の配線がそのまま15ほったらかし。合併症は、神経系全体の左はいつでもに内因性神経活動が行われることです。この活動の程度は動物、実験者の解剖の専門知識に大きな程度に依存する動物から高い変数です。この変数のアクティビティは、ないもっぱら雇われる外因性の刺激15する予定ですしたがってが読み込まれ、アンロード、FM1 43 染料の量に貢献できます。関連の技術的な合併症は、そのまま切り裂かれた幼虫契約架空運動で筋肉この変位は大きく NMJ イメージングを妨げることです。中枢神経系が削除された場合、また Ca2 +のアプリケーションを通じて、この運動は軽減-4イメージング中に無料生理食塩水。ここで使用されるこれらのアプローチは、優れた FM1 43 色素 NMJ に備えてイメージングを有効にするのに十分です。ただし、いくつかの実験者は活動電位ブロッカー (例えばテトロドトキシン)37,38を使ったり (例えばリアノジン、philanthotoxin-433)、筋肉の収縮を抑制する薬剤を追加する選択します。薬の範囲は、選択的に特定の手順を強調表示したり、神経伝達機構を検討する突然変異体の表現型を強調するために、SV サイクルの操作に使用できます。たとえば、いくつかの実験者は SV SV エンドサイトーシスを強化するシクロスポリン A (40カルシニューリン活性を阻害する) 予備プールでロードを増加する Veratridine (電位依存性 Na+チャネル39をアクティブにします) を採用し、フォルスコリン (アデニル酸シクラーゼ41、42シナプス伝達を高めるがアクティブになります) エキソ/遠藤サイクリング プール7,43,44を増加します。このような薬理学的操作は、追加の洞察力を提供できます。最後に、FM1 43 背景、解離、洗浄効果、刺激のプロトコルの品質に基づいて様々 な程度に発生します。Β-シクロデキストリン Advasep 745、または、水性蛍光 sulforhodamine46, 非特異蛍光を抑制し、シグナル/バック グラウンド比の向上の sulfobutylated 誘導体をいくつか追加します。
SV サイクル (例えば、電気生理学、synaptopHluorin、電子顕微鏡) のさらなる理解する FM 蛍光イメージングを伴うことができる多数の方法があります。ここでは SV を調査に使用される FM 蛍光光電例サイクル微細構造の詳細。SVs は、空間的、機能的に明瞭な2は、いくつかのプールに分かれています。容易に脱着可能なプール (希望小売価格) には、小胞急性刺激時にすぐにリリースが含まれています。大きいリサイクル プールは、中程度の活動の条件の下で SV リリースを保持します。内部留保プール (RP) のみ (一見近く生理学) 強い刺激2で募集しています。アクティブになっている SV プールが刺激使用47, の種類に依存し、FM 光電を用いたショウジョウバエNMJ からの報告は、これら異なる SV プール48の空間と機能特性に重要な洞察を明らかにしています。FM 光電を使用して、アクティブに異なる刺激をパラダイムとエンドソームと SVs49の長い議論人身売買相互作用などのクエリの質問の下で SV プールを研究できます。実験者は、シナプスで他の活動依存的変化との組み合わせで FM イメージングに興味がある、FM1 43 色素 (FM1-43FX) の報道によると修正可能なアナログがあります。このプローブは活動依存した染料のローディング後、ショウジョウバエNMJ を修正する 1 つの許可、ブートン活動レベル (FM 色素蛍光) との活動に依存した表現との間の相関関係をテストするのには抗体の分類でフォロー アップを興味の蛋白質。将来は、それが非常にやりがいのあること FM 染料の組み合わせを有効にすることができるその他のメソッドを探索する美しいショウジョウバエNMJ モデルのシナプスで他のイメージング手法と画像します。
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Disclosures
著者は競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
この記事への貢献のための Broadie の研究室のメンバーに感謝いたします。この作品は NIH の R01s MH096832 と MH084989 へ有限会社ケイビー、によって支持されたと D.L.K. に NIH を経て交わり F31 MH111144
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
| Microscope Cover Glass 22x22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
| Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
| Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
| Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
| Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
| P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
| 0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
| Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
| Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
| Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
| Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
| HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
| HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
| Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
| Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
| 7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
| FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
| Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
| LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
| Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
| HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
| Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
| Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
| 20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
| Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
| Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
| Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
| 40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
| All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
| Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
| LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
| T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
| LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
| Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |
References
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