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Neuroscience

Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Vesícula sináptica (SV) ciclismo é o mecanismo de núcleo de comunicação intercelular em sinapses neuronais. Liberação e absorção de corante de FM são o principal meio de análise quantitativa do SV endo e exocitose. Aqui, nós comparamos todos os métodos de estimulação para conduzir FM1-43 ciclismo da sinapse de modelo de junção neuromuscular (JNM) de Drosophila .

Abstract

FM de corantes são usados para estudar o ciclo da vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfifílicos têm uma cabeça hidrofílica e cauda hidrofóbica, tornando-os solúveis em água, com a capacidade reversível, entrar e sair bilayers do lipid da membrana. Estes corantes styryl são relativamente não-fluorescente em meio aquoso, mas causa a inserção no folheto externo da membrana plasmática um > 40 X aumento da fluorescência. Nas sinapses neuronais, FM corantes são internalizados durante a endocitose SV, traficada dentro e entre pools de SV e liberada com exocitose SV, fornecendo uma ferramenta poderosa para visualizar pré-sináptica estágios da neurotransmissão. Um modelo genético primário de glutamatérgico sinapse desenvolvimento e função é a Drosophila junção neuromuscular (JNM), onde FM tingir de imagem tem sido amplamente utilizada para quantificar a dinâmica do SV em uma ampla gama de condições mutantes. O terminal sináptico Nicotínico é facilmente acessível, com uma bela matriz de boutons sinápticas grandes ideais para aplicativos de imagem. Aqui, podemos comparar e contrastar as três maneiras de estimular a drosófila MNJ dirigir atividade dependente FM1-43 tintura absorção/liberação: aplicativo 1) banho de alta [K+] para despolarizar tecidos neuromusculares, 2) nervo motor do eletrodo de sucção estimulação para despolarizar o nervo pré-sináptica terminal e 3) alvo transgénico expressão de variantes de channelrhodopsin para controle de luz-estimulada, espacial de despolarização. Cada um desses métodos tem vantagens e desvantagens para o estudo dos efeitos de mutação genética sobre o ciclo SV na drosófila MNJ. Discutiremos essas vantagens e desvantagens para ajudar a seleção da abordagem de estimulação, juntamente com as metodologias específicas para cada estratégia. Além de imagens fluorescentes, corantes de FM podem ser photoconverted aos sinais de elétron-densa visualizado usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para estudar mecanismos de ciclo SV a nível ultraestrutural. Nós fornecemos as comparações de confocal e microscopia eletrônica de imagens de diferentes métodos de estimulação de Drosophila JNM, para ajudar a guiar a seleção dos futuras paradigmas experimentais.

Introduction

O maravilhosamente caracterizado Drosophila larval junção neuromuscular (JNM) glutamatérgico sinapse modelo tem sido usado para estudar a formação de sinapses e função com um vasto espectro de perturbações genéticas1. O terminal do neurônio motor é composto por várias ramificações do axônio, cada um com muitos boutons sinápticas alargadas. Essas varicosidades espaçosa (até 5 µm de diâmetro) contêm todas a neurotransmissão, incluindo máquinas glutamatérgico uniforme de vesículas sinápticas (SVs; ~ 40 nm de diâmetro) na reserva citosólica e prontamente liberável piscinas2. Essas vesículas ancorar na membrana pré-sináptica de plasma fusão local ativo zonas (AZs), onde a exocitose Medeia a liberação do neurotransmissor glutamato para trans-comunicação sináptica. Posteriormente, as SVs são recuperadas da membrana plasmática através do beijo e executar reciclagem ou endocitose mediada por Clatrina (CME) por ciclos repetidos de exo/endocitose. A Drosophila Nicotínico é facilmente acessível e adequado para isolar e caracterizar os mutantes de ciclo SV. Usando telas de genéticas para a frente, mutações romance conduziram à identificação de novos genes críticos para o ciclo SV3. Além disso, abordagens de genéticas reversos começando com genes já conhecidos conduziram para a elucidação de novos mecanismos de ciclo SV através a cuidadosa descrição do mutante ciclismo fenótipos4. A Drosophila Nicotínico é quase ideal como uma preparação experimental sináptica para dissecar os mecanismos de endocitose e exocitose SV via métodos de opticamente vesículas de pista de ciclismo durante a neurotransmissão.

Uma gama de marcadores fluorescentes permitem rastreamento visual das vesículas durante a ciclagem dinâmica, mas o mais versátil é análogos de tintura de FM que é sintetizado pela primeira vez Mao, F., et al. 5. estruturalmente, FM corantes contêm uma cabeça hidrofílica e uma cauda lipofílica conectado através de um anel aromático, com uma região central, conferindo Propriedades espectrais. Estes styryl corantes particionar reversível em membranas, não 'perder um combate' entre membrana folhetos e nunca são tão livre no citosol e são muito mais fluorescente em membranas de água5. Inserção reversível em uma bicamada lipídica provoca um 40-fold aumento na fluorescência6. Em sinapses neuronais, clássico FM tintura etiquetando as experiências consistem em banhar a preparação sináptica com o corante durante despolarizantes estimulação para carregar corante através de endocitose SV. Tintura externa é então lavada e o ciclo SV é preso em uma solução de ringer livre de cálcio a imagem carregada sinapses7. Uma segunda ronda de estimulação em um banho sem corantes provoca a liberação de FM por exocitose, um processo que pode ser seguido por medição a diminuição de intensidade de fluorescência. Populações de SV de uma única vesícula para piscinas contendo centenas de vesículas podem ser monitorada quantitativamente6,7. Corantes de FM têm sido utilizados para dissecar dependente da atividade de mobilização das piscinas SV funcionalmente distintas e para comparar beijo e executar vs CME ciclismo8,9. O método foi modificado para separadamente do ensaio evocado, espontânea e miniatura sináptica ciclo de atividades (com equipamento altamente sensível para detectar alterações de fluorescência muito pequenas e reduzir fotobranqueamento)10. Ensaios podem ser estendidos ao nível ultraestrutural por photoconverting o sinal de FM fluorescente em um rótulo de elétron-densa para transmissão microscopia eletrônica11,12,13,14 .

Historicamente, banho preparações sináptica em uma alta concentração de potássio (doravante referida como "alta [K+]") tem sido o método de escolha para despolarizar a estimulação para induzir SV ciclismo; que vão desde o sapo colinérgico Nicotínico5, a culta neurônios hippocampal cérebro de roedor15, para a Drosophila glutamatérgico MNJ modelo16,17. Esta abordagem de [K+] alta é simples, exige nenhum equipamento especializado e, portanto, é acessível para a maioria dos laboratórios, mas tem limitações para aplicação e interpretação dos dados. Um método muito mais fisiologicamente apropriado é usar sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo4,5,12. Essa abordagem conduz a propagação do potencial de ação para estimulação direta do nervo pré-sináptica terminal, e os resultados podem ser directamente comparados a ensaios eletrofisiológicos de neurotransmissão função13,14, 15, mas requer equipamento especializado e é tecnicamente muito mais desafiador. Com o advento da optogenetics, o uso da estimulação neuronal channelrhodopsin tem vantagens adicionais, incluindo controle spatiotemporal apertado de expressão de canal usando o binário Gal4/UAS sistema20. Esta abordagem é tecnicamente muito mais fácil do que a estimulação de sucção eletrodo e requer nada mais do que uma fonte de luz LED muito barata. Aqui, nós empregamos imagem de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibrometo de piridínio) tanto a comparar e contrastar esses três métodos diferentes de estimulação para a Drosophila MNJ: alta simples [K+ ], desafiando channelrhodopsin elétricos e novas abordagens.

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Protocol

1. larval cola dissecação

  1. Misture bem 10 partes de elastómero de silicone base com 1 parte de elastômero de silicone, agente do kit de elastômero (Tabela de materiais) de cura.
  2. Revestir as lamelas de vidro de 22 x 22 mm com o elastômero e cura em um prato quente em 75 ˚ c durante várias horas (até já não pegajoso ao toque).
  3. Coloque uma lamela de vidro revestido de elastômero único na câmara de dissecação de vidro plexi sob medida (Figura 1, inferior) em preparação para a dissecação larval.
  4. Prepare as pipetas de cola de vidro de borosilicato capilar usando um extrator de microeletrodos padrão para obter o ângulo desejado e tamanho de ponta.
  5. Suavemente, quebrar a ponta da micropipeta e a outra extremidade, anexar 2 pés de tubo de plástico flexível (1/32" diâmetro interior, ID; 3/32" diâmetro, OD externo; 1/32" parede; Tabela de materiais) com boca de encaixe (ponta da pipeta P2).
  6. Encha um pequeno recipiente (tampão de tubo de Eppendorf de 0,6 mL) com um pequeno volume (~ 20 µ l) de cola (Tabela de materiais), em preparação para a dissecação larval.
  7. Encha a câmara com solução salina (em mM): NaCl 128, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacarose e pH ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) 7.2.
  8. Adicionar rabanete de anti-cavalo peroxidase (HRP) anticorpo conjugado com Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; diluir 01:10 de um estoque de 1 mg/mL) para rotular o MNJ pré-sináptica terminal durante a dissecação21,22.
  9. Usando um pincel fino (tamanho 2), retire um errante terceiro instar o frasco de comida e coloque sobre o vidro de tampa revestida de elastômero.
  10. Encha a ponta de micropipeta de vidro com um pequeno volume de cola usando pressão de ar negativa gerada pela boca com acessório (passo 1.5).
  11. Posição larva dorsal para cima com fórceps e cola a cabeça para a lamela de elastómero revestida com uma pequena gota de cola usando pressão de ar pela boca.
  12. Repita este procedimento com a extremidade posterior da larva, certificando-se de que o animal é esticado esticado entre os dois acessórios de colagem.
  13. Usando a tesoura (lâminas 3 mm; Tabela de materiais), fazer um corte horizontal (~ 1 mm) na parte posterior e um corte vertical ao longo da linha mediana dorsal.
  14. Usando a pinça fina (n º 5, Tabela de materiais), gentilmente remover a traqueia dorsal, intestino, gordura corporal e outros órgãos internos cobrindo a musculatura.
  15. Repita o procedimento de colagem para as quatro abas de parede corporal, certificando-se de esticar suavemente a parede do corpo, tanto horizontal como verticalmente.
  16. Levante o cabo ventral do nervo (VNC) usando fórceps, corte com cuidado os nervos motores com a tesoura e então remover completamente o VNC.
  17. Substitua o soro fisiológico dissecação Ca2 +-livre de soro fisiológico (mesmo que o soro de dissecação acima sem o CaCl2) parar SV ciclismo.

2. opção 1: Carregamento de tintura FM alta [K+]

  1. De uma solução stock de FM1-43 (4mm), adicione 1 µ l a 1 mL de solução de KCl (alta [K+] em solução salina de dissecação) para uma concentração final de 4 µM de 90 mM.
  2. Utilizando uma pipeta, substituir o Ca2 +-soro livre na câmara de imagens com a solução de corante [K+] FM alta para incentivar a adopção de tintura SV endocitose.
  3. Imediatamente iniciar um timer digital para a duração pré-determinada da alta [K+] despolarizantes período de estimulação (ex., 5 min; A Figura 2).
  4. Para confirmar uma preparação larval saudável, observe as fortes contrações da musculatura para a duração do período de despolarização de alta [K+].
  5. Quando terminar o período de temporizador, rapidamente remover a solução de corante [K+] FM alta e substitua por Ca2 +-livre solução salina para parar SV ciclismo.
  6. Lavar em rápida sucessão com o Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de corante [K+] FM alta é completamente removida.
  7. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.

3. imagem latente: Microscopia Confocal

  1. Use um microscópio confocal vertical com um 40 X objetivo de imersão de água de imagem MNJ tintura da fluorescência (outros microscópios podem ser usados).
  2. Imagem 4 MNJ dos segmentos abdominais (outros NMJs podem ser fotografadas) 2-4 do músculo e coletar imagens usando o software apropriado (Tabela de materiais).
  3. Com aqui vai 633 nm laser para excitar HRP:647 (com filtro passa-long > 635 nm) e um laser de argônio 488 nm para excitar FM1-43 (com bandpass filtro 530-600 nm).
  4. Operacionalmente, determine ganho ideal e o deslocamento para ambos os canais.
    Nota: Essas configurações permanecerá constantes durante todo o resto do experimento.
  5. Pegue uma pilha-Z confocal através o MNJ selecionado inteiro da parte superior de HRP-marcado para baixo do terminal sináptico.
  6. Tome nota cuidadosa o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o excesso para a exata mesma MNJ depois FM tingir a descarga.

4. alta [K+] estimulação: FM tintura descarga

  1. Substitua Ca2 +-livre solução salina com a alta [K+] soro fisiológico (sem tintura FM1-43) a despolarização da unidade, liberação de exocitose e tintura SV.
  2. Imediatamente, iniciar um timer digital para o período pré-determinado de [K+] alta estimulação (ex., 2 min; A Figura 2).
  3. Quando terminar o período de temporizador, imediatamente remover o soro [K+] alto e substitua por Ca2 +-livre solução salina para parar SV ciclismo.
  4. Lavar em rápida sucessão com Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a alta solução salina [K+] é completamente removida.
  5. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
  6. É certo que a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

5. opção 2: Estimulação elétrica FM corante carregamento

  1. Prepare uma pipeta de sucção usando o extrator de microeletrodos (Tabela de materiais) para obter o atarraxamento requerido e dica de tamanho.
  2. Fogo-polonês a ponta de microeletrodos com um micro-forge até um único nervo motor pode ser aspirado com um ajuste apertado.
  3. Deslize a pipeta de sucção para o eléctrodo em um micromanipulador e anexar para o tubo longo e flexível de plástico e uma seringa.
  4. Definir parâmetros de estimulador (EG., 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2) ou 1 min (Figura 3)).
  5. Substituir o Ca2 +-livre solução salina na preparação larval com acima FM1-43 solução salina (4 µM; 1 mM CaCl2) na plataforma eletrofisiologia.
  6. A preparação no palco microscópio e levantar o palco até que a larva e pipeta de sucção estão em foco (objetiva de imersão de água X 40).
  7. Aspira-se um ciclo de corte de nervos motores que inervam o selecionado hemisegment com pressão de ar negativa gerado pela seringa para o eletrodo de sucção.
  8. Teste a função do eletrodo de sucção com uma descarga curta de estimulação enquanto monitora visualmente para a contração muscular no hemisegment selecionado.
  9. Estimule o nervo motor usando parâmetros selecionados (passo 5.4) para conduzir a endocitose SV e absorção de corante FM1-43 (Figura 2).
  10. Lavar em rápida sucessão com Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de corante FM1-43 é completamente removida.
  11. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para imediata de imagem usando o protocolo da imagem latente confocal de cima.
  12. Tome cuidadosa nota o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso para a exata mesma MNJ após descarregamento de tintura de FM.

6. eletroestimulação: FM tintura descarga

  1. Substituir o Ca2 +-livre de solução salina com soro fisiológico normal (sem tintura FM1-43) e coloque a preparação na fase de equipamento de eletrofisiologia.
  2. Definir os parâmetros de estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2) ou 20 s (Figura 3)).
  3. Sugar o nervo motor mesmo para o eletrodo mesmo como acima e em seguida estimular para ativar a exocitose SV e liberação do corante FM1-43.
  4. Lavar em rápida sucessão com Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir o corante externo é completamente removido.
  5. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
  6. Certifique-se para a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

7. opção 3: Channelrhodopsin estimulação FM corante carregamento

  1. Levante as larvas ChR2-expressando sobre os alimentos que contêm o ChR2 retinal todo-trans co-fator (dissolvido em etanol; concentração final de 100 µM).
  2. Coloque a preparação larval na câmara do plexiglás num palco de dissecação microscópio equipado com uma porta da câmara.
  3. Anexar um LED azul (470 nm; Tabela de materiais) para um estimulador programável usando um cabo coaxial e coloque o LED na porta da câmara.
  4. Focar o feixe de luz de LED azul para a função larval dissecado usando a função de zoom microscópio.
  5. Substituir o Ca2 +-soro livre sobre a preparação larval com acima FM1-43 salina (4 µM; 1 mM CaCl2) na fase de optogenetic.
  6. Defina os parâmetros do LED utilizando o estimulador (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 5 min (Figura 2)).
  7. Começar a estimulação de luz e controlar com um timer para o período pré-determinado de estimulação a optogenetic (por exemplo, 5 min; A Figura 2).
  8. Quando o temporizador para, rapidamente remover a solução de tintura de FM e substitua por Ca2 +-livre solução salina para parar o SV ciclismo.
  9. Lavar em rápida sucessão com o Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir a solução de tintura de FM é completamente removida.
  10. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal usando protocolo de imagem de cima.
  11. Tome cuidadosa nota o MNJ fotografada (segmento, lado e músculo) para garantir o acesso para a exata mesma MNJ após descarregamento de tintura de FM.

8. Channelrhodopsin estimulação: tintura de FM descarga

  1. Substituir o Ca2 +-livre solução salina com soro fisiológico normal (sem tintura FM1-43) na fase de microscópio de dissecação com porta câmera LED centrou-se a larva.
  2. Defina os parâmetros de estimulador para descarga (por exemplo, 15 V, frequência de 20 Hz, duração de 20 ms e tempo de 2 min (Figura 2)).
  3. Começar a estimulação de luz e controlar com um timer para o período pré-determinado de estimulação optogenetic (e.g., 2 min; A Figura 2).
  4. Quando terminar o período de temporizador, rapidamente remover a solução de tintura de FM e substitua por Ca2 +-livre solução salina para parar o SV ciclismo.
  5. Lavar em rápida sucessão com Ca2 +-livre de soro fisiológico (5 x por 1 min) para garantir o corante externo é completamente removido.
  6. Manter a preparação larval no fresco Ca2 +-livre solução salina para a imagem latente de imediato com o microscópio confocal.
  7. Certifique-se para a fluorescência do corante FM1-43 no MNJ mesmo observado acima usando as mesmas configurações confocal de imagem.

9. fluorescência quantificação

  1. Carregar a imagem no Image J (NIH aberto fonte) e criar uma projeção de intensidade máxima, clicando em imagem | Pilhas | Projeto Z.
  2. Usando o anti-HRP:647 canal, vá em Image | Ajustar | Limiar e deslize a barra de ferramentas superior, até que só o MNJ é realçado.
  3. Usando a ferramenta varinha, clique sobre o MNJ. Se o MNJ é descontínua, mantenha o botão Shift e selecione todas as partes.
  4. Altere a imagem para o canal de tintura FM1-43 e ir para analisar | Medida para obter a medição de fluorescência.
  5. Repita as etapas de 9.1-9.4 para a imagem "descarregada" do MNJ mesmo (segmento identificado, lado e músculo).
  6. Para obter a porcentagem de tinta que foi descarregada, tome a relação entre as intensidades de fluorescência carregado/descarregado.
    Nota: Este procedimento pode ser modificado para analisar a fluorescência em uma base de bouton-por-bouton, utilizando também as ferramentas de seleção "oval" ou "freehand". Fluorescência de fundo pode ser subtraída por amostragem, a fluorescência de músculo. Agentes também podem ser adicionados para reduzir este pano de fundo.

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Representative Results

A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho para a tintura de FM de atividade dependente da imagem latente do protocolo. O experimento começa sempre com a mesma dissecação cola larval, independentemente do método de estimulação usado posteriormente. Figura 1a é um diagrama esquemático de uma larva dissecado, mostrando o cordão nervoso ventral (VNC), irradiando nervos e repetidas hemisegmental muscular padrão. O VNC é removido e a preparação banhado em uma solução de 4 µM de FM1-43 (Figura 1b, rosa). Então, a preparação é estimulada na presença de corante de FM usando uma das três opções possíveis para carregar o corante através de endocitose SV atividade-dependente (Figura 1cI-III). Próximo, tintura de FM ciclismo é preso usando Ca2 +-livre solução salina e um terminal MNJ específico que tenha sido carregado com tintura de FM é fotografada usando um microscópio confocal ("imagem carregada"; Figura 1D). Nesse caso, o músculo que MNJ 4 é selecionada com a colocação de esquemático mostrando do nervo, MNJ ramificação terminal e FM carregado boutons sinápticas. A preparação sináptica é estimulada pela segunda vez usando o mesmo método selecionado acima, mas na ausência de tintura de FM para conduzir exocitose SV e lançamento FM1-43 (Figura 1e). O mesmo identificado Nicotínico (muscular Nicotínico 4 neste exemplo) é então re-imaginada usando o rótulo sináptico HRP:647 e sinal de vesículas residual FM1-43 ("imagem descarregada"; Figura 1f). O experimentador determina a força e a duração da carga e descarga de fases para otimizar as medições para um ensaio específico ou condição mutante. Intensidade da fluorescência é quantificada após a carga e descarga (Figura 1D, 1f) obter as medições de endocitose tintura sináptica, exocitose e a porcentagem de carregado tintura FM lançada. Análises podem ser feitas para o MNJ inteira ou boutons único.

Tintura de FM ciclismo pode ser estimulado de três maneiras: despolarização de salina 1) alta [K+] de toda a preparação, 2) sucção eletrodos de estimulação do nervo motor, ou 3) luz conduzida ativação do alvo channelrhodopsin (ChR2; A Figura 2). Para uma comparação direta de lado a lado de todos os três métodos, estimulados com cada abordagem por 5 min na presença de FM1-43 (carregamento) e então por 2 min na ausência de FM1-43 (descarga) e cuja imagem NMJs HRP-rotulados usando configurações idênticas confocal ( Figura 2). O método de solução salina despolarização [K+] alto segue o protocolo FM1-43 amplamente utilizado para a Drosophila larval MNJ23, exceto nós usamos cola em vez de pinos para a dissecação larval. A cola evita a interferência com os objectivos do microscópio e permite a determinação mais precisa da tensão da parede do corpo, mas exige uma curva de aprendizagem moderada. Todos os três métodos produzem sinais fluorescentes fortes e consistentes ao longo do caramanchão de bouton sináptica Nicotínico e dentro boutons sinápticas individuais (inserções). A alta [K+] salina despolarização faz com que todos NMJs ser FM-carregado em toda a larva como que depolarizes cada neurônio no animal (Figura 2A, médio). O método de estimulação elétrica do nervo eletrodo sucção conduz somente em um único hemisegment das larvas para os quais o que inervam correspondente nervo motor tem sido estimulado (Figura 2B, médio). Unstimulated segmentos no mesmo animal são distinguíveis usando o rótulo HRP, mas não contêm nenhuma tintura fluorescente observável a carregar e servem como excelentes controles internos. O optogenetic ChR2 método produz despolarização alvo dependente do driver Gal4 transgénico empregado (Figura 2). Aqui, o motorista era um transportador vesicular de glutamato (vglut) Gal4, então todos os neurônios glutamatérgico são despolarizados com estimulação de luz azul, incluindo todos os neurônios motores glutamatérgico. Como resultado, todos os NMJs são carregados com tintura FM1-43, neste exemplo (Figura 2, médio). Drivers celular específico pode ser usado para rotular NMJs específicos e deixar os outros unlabeled para um controle interno.

Descarga de tintura de FM foi alcançado através do mesmo método que foi usado para carregar o corante. O primeiro método, a preparação larval foi simplesmente banhada em alta solução salina [K+] na ausência de FM1-43 para despolarizar células, exocitose de unidade SV e descarregar os terminais sinápticos (Figura 2A, direita). Nós normalmente seleciona um período mais curto de descarga (2 min), então a descarga é parcial e terminais permanecem visíveis no canal FM. Descarga de estimulação elétrica de eletrodos de sucção é consideravelmente mais difícil, porque envolve retornando para o mesmo hemisegment, identificando o mesmo nervo e re-estimulando o nervo na ausência de FM1-43 para conduzir a descarga de tintura (Figura 2B , certo). Note que o descarregamento de tintura novamente foi parcial. O descarregamento de ChR2 implica um segundo período de iluminação de LED azul da preparação larval na ausência de FM1-43 para ativar os canais, despolarizar os neurônios motores e estimulam a liberação de tintura de exocitose SV (Figura 2, direita). Com esta escala de tempo de descarga (2 min), cada um destes despolarização métodos descarregado somente uma porcentagem da tintura FM1-43 carregada, com a alta [K+] mais fortes e ChR2 mais fraco na condução de liberação de corante (Figura 2). Nós medimos a LED intensidade luminosa usada (140 µW/mm2), que estava na gama publicado (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 màxima é ativado pela iluminação de ~ 1 mW de fontes de luz de 50-200 mW, com ChR2 eficácia também depende da concentração de ATR alimentada a larva27,28. Assim, a força de estimulação ChR2 pode ser manipulada. Além disso, a relação pode não fiquem com outras forças de estimulação, prazos ou genótipos. Se o experimentador está trabalhando com um mutante que diminuiu a endocitose SV ou anormalmente rápido exocitose, os parâmetros de estimulação podem precisar ser alterada para manter um sinal observável após a descarga. O rótulo de anti-HRP permite identificar o MNJ mesmo na ausência completa do sinal de FM, mas isto não é o ideal para a quantificação. Em princípio, a estimulação de descarga também pode ser de um tipo diferente da estimulação de carregamento.

Recentemente, estudamos a perda dos efeitos sobre o ciclo SV usando estimulação elétrica4Notum deacylase sináptica secretado. Aqui, podemos estender esta análise para comparar 1) alta [K+] despolarização e sucção 2) eletrodo nervo motor estimulação métodos (Figura 3). Achamos que ambos os métodos dão um resultado semelhante, apresentando reduzida FM1-43 corante carregamento em um mutante nulo Notum ; no entanto, o grau do fenótipo é distinto entre os dois métodos. Após a despolarização com soro fisiológico [K+] alta por cinco minutos, há uma grande diminuição na intensidade de fluorescência carregado entre controle genético (w1118) com níveis elevados e Notum mutantes nulos (NotumKO ) com níveis baixos (Figura 3A, topo). Nas medições quantificadas, intensidade de fluorescência FM normalizada dentro de terminais MNJ HRP-delineado é significativamente reduzida na ausência de Notum (w1118 1.0 ± 0.05 vs NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0,0001; Figura 3B). Após a estimulação elétrica a 20 Hz por 1 min, encontramos uma diminuição insignificante carregado FM1-43 intensidade entre controles e Notum nulos quando quantificar toda fluorescência Nicotínico (w1118 1.0 ± 0.05 vs NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figura 3A, B). Quando se mede a incorporação do corante em uma base de bouton-por-bouton, encontramos uma diminuição significativa no corante carregado com ambos os métodos. Nas medições quantificadas após estimulação com alta [K+] soro fisiológico, intensidade de fluorescência normalizada FM por bouton é diminuiu significativamente (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0,0001; A Figura 3). Após a estimulação elétrica, intensidade de fluorescência normalizados por bouton é também diminuiu significativamente, embora em menor grau (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; A Figura 3).

As diferenças de resultados entre os dois paradigmas de estimulação podem ser devido a uma série de fatores. Primeiro, a força de estimulação é presumida ser maior com alta [K+] comparada a estimulação elétrica do nervo motor. Gravações de eletrofisiologia não podem ser feitas na presença de alta solução salina [K+], mas o neuromusculature larval é claramente ser robustamente estimulada, como contrações musculares são forte e contínua ao longo do período de banho de 5 min. No entanto, não sabemos a força ou a frequência da estimulação. Em contraste, a estimulação elétrica é muito mais controlada com o usuário escolhendo a força exata da tensão e frequência de estimulação. Em segundo lugar, a duração da estimulação foi mais com alta [K+] comparada a estimulação elétrica nervosa (Figura 3). Optamos por 1 min de 20 Hz a estimulação elétrica após ensaios repetidos. Após 1 min de carregamento de tintura, havia um sinal forte e de confiança do FM1-43, Então escolhemos esse paradigma para nosso estudo4, embora a 5 min da estimulação deu um sinal fluorescente ainda mais forte (Figura 2). Assim, o comprimento do paradigma da estimulação provavelmente contribui para a variabilidade de magnitude em carregamento FM1-43 entre alta [K+] e estimulação elétrica (Figura 3B, C). Embora o método de alta [K+] mostrou um fenótipo mais robusto para mutantes Notum , nós ainda usamos o método elétrico devido ao maior controle4. Há muitos parâmetros para controlar tais como força, frequência e duração da estimulação, e essas configurações devem ser decididas com base na mutante e a pergunta. Por exemplo, a escolha do método de estimulação pode depender de piscina interrogada o SV7 e o mecanismo de atividade-dependente investigado10.

Depois de carregar no terminal do MNJ FM1-43, um pode empregar fluorescência corante photoconversion para produzir o sinal de elétron-densa para microscopia eletrônica (Figura 4). Neste método, a preparação de tintura-carregado é exposta a intensa luz fluorescente na presença de diaminobenzidina (DAB), com as espécies reactivas de oxigénio da tintura FM oxidando o DAB para criar um precipitado escuro (Figura 4A)11. Por favor, consulte o artigo de JoVE na photoconversion de corantes styryl para obter detalhes completos12. A vantagem deste método é que a SVs são claramente revelados nível ultraestrutural, embora o ciclo SV claro é preso com imagem estática microscópio de elétron. Na ausência de estimulação, boutons sinápticas na drosófila MNJ são densamente carregadas com vesículas (~ 40 nm de diâmetro; Figura 4B), com a rara ocorrência de organelas alargadas (>100 nm de diâmetro) presume-se que ciclismo endossomos. Alta solução salina [K+] despolarizantes estimulação fortemente muda este perfil, com um esgotamento parcial da população de SV e a acumulação rápida de numerosas organelas alargadas (>100 nm de diâmetro) que derivam em massa endocitose de membrana plasmática (Figura 4, à esquerda). Apesar de compartimentos semelhantes existem em controles unstimulated, a alta densidade destas organelas após alta [K+] salina despolarização gera a preocupação de que esta pode ser uma resposta não-fisiológica. Sucção do eletrodo de estimulação elétrica do nervo motor é relativamente mais eficiente no empobrecimento da população de SV e não produz mais das vesículas CDDP alargada (Figura 4, à esquerda). Isto sugere que a endocitose granel impulsionada pela alta despolarização [K+] ajuda a manter a população de SV durante mais intensa demanda.

FM1-43 photoconversion pode ser realizado usando alta [K+] salina despolarização ou sucção eletrodo de estimulação elétrica do nervo motor, para comparar a ultraestrutura sináptica em relação a um descanso bouton (Figura 4). Com alta [K+] despolarizantes estimulação, SVs individuais e vesículas alargadas (>100 nm de diâmetro) pode ser rotulado com o elétron-densa DAB precipitado seguir orientado a luz photoconversion (Figura 4, direita). Por razões desconhecidas, a membrana da vesícula alargada é tipicamente menos densamente etiquetada do que a membrana SV menor. Além disso, SVs aparecem frequentemente enchidos com o precipitado DAB, ao invés de apenas a membrana, mas isto faz-lhes muito mais fácil de distinguir as vesículas sem rótulo. Com estímulo de sucção do elétrodo do nervo motor, a população de SV ciclismo também pode ser marcada em relação à SVs sem rótulo (Figura 4, direita). Com estimulação elétrica, ampliado vesículas (>100 nm de diâmetro) não são um formado em boutons e, de forma consistente, as membranas do presumível endossomos não são rotulados por FM1-43 photoconversion. Como acima, SVs ciclismo geralmente são preenchidos com o DAB precipitado de forma um pouco de tudo ou nada e, portanto, mais facilmente distinguível da SVs que não se formaram durante a estimulação (Figura 4, direita). Temos ainda não tentado photoconversion ChR2 estimulação a seguir. Com cursos de tempo diferente da estimulação, FM1-43 tintura photoconversion permite que se determine onde SVs são formadas, como SVs são traficadas e o sincronismo de movimento entre diferentes piscinas espaciais dentro o bouton sináptica. A comparação de alta [K+] e a estimulação do nervo permite a dissecção da granel e mecanismos de endocitose SV único.

Figure 1
Figura 1: Fluxograma de corante FM1-43 carregando o protocolo para a Drosophila MNJ. a dissecação larval cola produz uma preparação neuromusculature achatado, com o cordão nervoso ventral (VNC) projetar nervos segmentares da linha média ventral (Vm) para o hemisegmentally repetido corpo parede muscular matrizes (passo um). O VNC é corte livre, e a dissecação larval inteira é então incubada na solução FM1-43 rosa (4 µM) em preparação para a estimulação (etapa b). FM1-43 é então carregado com um paradigma de estimulação selecionado (passo 3); com as opções de alta [K+] despolarização da larva inteira (cI), sucção eletrodo estimulação de um único nervo motor (cII), ou orientado a luz de ativação de channelrhodopsin altamente segmentado (cIII). FM1-43 incorporação é preso usando Ca2 +-livre solução salina e o MNJ tintura-carregado fotografaram (etapa d). Um segundo estímulo então é feito sem FM1-43 no banho para conduzir a tintura exocitose de vesículas sinápticas (etapa e). O MNJ mesmo é então re-imaginada para ensaiar o terminal sináptico descarregado (passo f). Intensidade fluorescente é medida a partir NMJs carregados e descarregados para quantificar a endocitose SV e SV exocitose níveis. O painel inferior mostra os parâmetros de construção e dimensões para a câmara de acrílico transparente usado para estes estudos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: FM tingir comparação de carga e descarga de todos os métodos de estimulação. Comparação entre FM1-43 tingir o carregamento e descarregamento no errante terceiro ínstar MNJ com despolarização 1) alta [K+] de toda a preparação larval (topo), 2) sucção estimulação elétrica de eletrodos do nervo motor (médio) e 3) orientado a luz ativação de channelrhodopsin o alvo (ChR2) somente em neurônios motores (parte inferior). (A) larval MNJ rotulado com o anti-HRP:647 marcador de membrana pré-sináptica (azul, à esquerda), carregado com FM1-43 via elevada despolarização [K+] por 5 min (médio) e em seguida descarregado através de elevada despolarização [K+] 2 min. (B) Comparação com estimulação elétrica nervosa de eletrodo de sucção com os mesmos períodos de estímulos para ambos tintura FM1-43, carga e descarga. (C) alvo vglut-Gal4>H134R-UAS-ChR2 expressão em neurônios motores ativado com azul (470 nm) luz durante os mesmos períodos de estímulos de corante FM1-43, carga e descarga. Asteriscos referem-se as inserções exibindo boutons de ampliação mais elevadas. Barra de escala é de 10 µm, com boutons sináptica inserção alargada 3.5 X de painéis principais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Notum mutantes nulos mostram reduzida FM corante carregamento em boutons sinápticas. FM1-43 carregado nos terminais sinápticos, o errante terceiro estádio MNJ comparando o controle genético (w1118) para Notum mutantes nulos (NotumKO). (A) Nicotínico boutons rotulados com elevada despolarização [K+] de toda preparação larval (topo) ou sucção eletrodo estimulação de um nervo motor (inferior) em w1118 (à esquerda) e NotumKO (à direita). (B) Quantified carregado FM1-43 fluorescência por JNM como um gráfico de dispersão comparando a elevada despolarização [K+] e estimulação de sucção eletrodo em controles w1118 vs mutantes NotumKO . (C) Quantified carregado de fluorescência em uma base de bouton-por-bouton como um enredo de caixa-e-whisker comparando elevada despolarização [K+] e estimulação de sucção eletrodo em controles w1118 vs NotumKO . Bicaudal t-testes Student foram realizados para cada comparação com p-valores exibidos nos gráficos. As barras mostram média ± SEM feita com prisma (versão 7.0 para Windows). Os dados de estimulação elétrica foi adaptados com permissão de Kopke et al., 144 desenvolvimento (19): 3499-510, 2017. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: ultraestrutura sináptica com FM corante photoconversion para marcar vesículas. FM1-43 fluorescente pode ser photoconverted a um precipitado de elétron-densa oxidado diaminobenzidina (DAB) para visualização através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM). (A), A diagrama esquemático do método de rotular o MNJ Drosophila seguindo a tintura de atividade-dependente FM1-43 carregar. photoconversion (B) representante TEM imagem de uma sua sináptica bouton em repouso (unstimulated). Observação densa população de tamanho uniforme SVs. (C) sináptica boutons que tem sido estimulada com alta [K+] salina despolarização por 5 min, sem photoconversion (à esquerda) ou com FM1-43 photoconversion (à direita). Observe a presença de estruturas de CDDP granel, rotulado e unlabeled. (D) boutons sináptica que tem sido estimulados eletricamente com um nervo sucção eletrodo a 20 Hz por 5 min com nenhum photoconversion (à esquerda) ou com FM1-43 photoconversion (à direita). Observe que as vesículas tintura-carregado aparecem muito mais escuras do que vesículas descarregadas adjacentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Estímulo despolarizante salino de alta [K+] é de longe a mais simples das três opções para tintura de FM de atividade-dependente ciclismo, mas provavelmente o menos fisiológicas29. Este método simples depolarizes cada célula acessível em todo animal e assim não permite estudos direcionados. Pode ser possível aplicar localmente alta [K+] soro fisiológico com uma micropipeta, mas isto ainda vai despolarizar células pré/pós-sináptica e provável glia sinapse-associado1. Outra grande preocupação é que alta [K+] despolarização drives rápida formação de endossomos em massa que só raramente são vistos em unstimulated boutons. No entanto, granel endossomo formação é um mecanismo ativo bloqueado por mutações29, indicando um processo fisiológico real. Assim, FM1-43 imagens com alta despolarização [K+] podem ser usada para estudar seletivamente endocitose granel em sinapses. Sucção do eletrodo de estimulação elétrica do nervo motor é um método muito mais controlado. Tem a vantagem de que apenas um pacote único axônio é estimulado, e só a termini pré-sináptica diretamente é despolarizada (claro, a fibra muscular então é despolarizada por ação do transmissor). Por conseguinte, fornece um grande controle interno de NMJs no mesmo animal que não são estimulados. Este método permite controlar rigorosamente os parâmetros de estimulação, ao contrário do método de estimulação [K+] alto, permitindo uma comparação direta com gravações de eletrofisiologia4. No entanto, esta técnica requer equipamento especializado e um nível bastante elevado de habilidade técnica e, portanto, é menos acessível. Orientado a luz ativação do alvo channelrhodopsin (ChR2) tem a vantagem de direcionamento de neurônios selecione30. Este método não requer nenhuma familiaridade com métodos de eletrofisiologia e pode ser feito com equipamento muito barato em qualquer laboratório, mas essa abordagem requer familiaridade básica com genética da drosófila .

A escolha dos parâmetros de estimulação é criticamente importante para o teste de dinâmica de ciclo SV consultada dentro de um intervalo de condições genéticas com fenótipos altamente variável1. Para todos os métodos, o externo [Ca2 +] usado é um parâmetro de chave, controlando a força motriz da SV ciclismo. Com o método de estimulação alto [K+], uma escolha importante é [K+] usado, que determina o grau de força de despolarização. Medições de Drosophila hemolinfa indicam um [K+] de 5 mM e 90 mM é, normalmente, a concentração mais frequentemente selecionada para atividade estimulação3,7,15,17 , 31. no entanto, uma faixa de [K+] de 30-90 mM foi empregada para variar a estimulação força5,16,32. Outra decisão crítica parâmetro é o comprimento da estimulação alta [K+] para ambos FM1-43, carga e descarga. O período de carga determina se a população inteira de SV ciclismo é efetivamente carregada, ou apenas um subconjunto de vesículas ativo7. O período de descarga da mesma forma dita a porcentagem de SVs passando por exocitose no período de estimulação, que pode revelar ou obscurecer os fenótipos mutantes dependentes a taxa muda em SV ciclismo frequência2. Com estimulação do nervo motor elétrico eletrodo sucção, escolhas de parâmetro também incluem estimulação tensão, frequência, duração e pulso de intervalo. Temporalmente padronizado atividade é um determinante de SV ciclismo dinâmica7, e padrões diferentes de estimulação podem seletivamente mobilizar piscinas distintas de SV. Com alvo orientado a luz ChR2 ativação, as opções incluem todos os itens acima (com variáveis de intensidade da luz) e opções adicionais de transgénicas discutiram na próxima seção. Com estes parâmetro, escolhas vem controle mais experimental, mas também o aumento da complexidade técnico.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) é um canal de luz-condomínio fechado membrana permeável para mono e cátions divalentes33. Se ChR2 estimulação é seleccionada, há muitas escolhas a ser feitas, incluindo o motorista Gal4, UAS-ChR2 construção e variáveis da fonte de luz para a ativação do canal. Gal4 motoristas variam de onipresente até altamente específicos. Por exemplo, onipresente UH1-Gal4 (daughterless) expressaria ChR2 em cada célula, Considerando que CcapR-Gal4 (Janelia) drives ChR2 no músculo MNJ 6/7, mas não, o Nicotínico muscular 431,34. Esta seletividade pode ser usada como um poderoso controlo interno. Da mesma forma, existem muitas variantes de UAS-ChR2, incluindo ChR2-H134R (usado aqui; os resíduo mutante causas aumento photocurrents)35, VChR1, chefe e muitos mais36. Cada uma destas variantes de canal tem propriedades distintas de luz gating, condutância, seletividade de íons, cinética e dessensibilização. Observe que algumas construções contêm uma etiqueta fluorescente que poderia interferir com a imagem de FM. Por exemplo, a UEA-ChR2-H134R usado aqui é marcado com mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), mas não produz emissões detectadas com o FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) filtros de imagem. Parâmetro técnico escolhas incluem a fonte de luz, o comprimento de onda e intensidade para a ativação do canal. Uma opção usada aqui é um LED azul-emitting barato, com estimulação visualmente confirmado pela análise do contrações musculares. Nós também foram bem sucedidos em Ativando ChR2 usando epifluorescência, embora um laser confocal de varredura não era suficiente. Epifluorescência poderia ser usada na estimulação orientada (segmentos específicos em vez do animal inteiro), mas os parâmetros de estimulação são difíceis de controlar, Considerando que o LED conectado até um estimulador simples facilmente altera a duração e a frequência da luz pulsos. Focar o diodo emissor de luz através da porta de câmera do microscópio de dissecação permite mais controlada, intensa estimulação luminosa.

Cabe o experimentador para decidir se deve ou não deixar o cabo ventral do nervo/cérebro intacto durante o paradigma de estimulação. Optamos por remover o todo sistema nervoso central de comparação de três métodos usados aqui, mas às vezes a fiação de upstream é deixada intacto15. Uma complicação é que a atividade neural endógena ocorre sempre que o sistema nervoso é deixado todo. O grau desta atividade é altamente variável de animal para animal, depende em grande medida a expertise de dissecação do experimentador. Esta atividade variável pode contribuir para a quantidade de corante FM1-43 que é carregado e descarregado, que, portanto, não é unicamente devido à estimulação exógena empregada15. Uma complicação técnica relacionada é que larvas dissecadas intactas contraem a musculatura em movimento fictícia, e este deslocamento interfere grandemente com imagem latente MNJ. Este movimento é aliviado se for removido do sistema nervoso central e também através da aplicação de Ca2 +-livre solução salina durante4de imagem. Estas abordagens utilizadas aqui são suficientes para permitir excelentes FM1-43 tintura de imagem em preparação o MNJ. No entanto, alguns experimentadores optar por adicionar drogas para inibir a contração do músculo (por exemplo, ryanodine, philanthotoxin-433), ou usar o potencial de ação bloqueadores (por exemplo, a tetrodotoxina)37,38. Uma variedade de drogas pode ser usada para manipular seletivamente o ciclo SV, para realçar determinadas etapas, ou acentuar fenótipos mutantes para examinar mecanismos de neurotransmissão. Por exemplo, alguns experimentadores têm empregado Veratridine (ativa a voltagem-dependente de canais at+ 39) para aumentar o SV carregando no pool de reserva, ciclosporina A (inibe a atividade de calcineurina40) para realçar a endocitose SV, e Forskolin (ativa a adenilato ciclase41, que melhora a transmissão sináptica42) para aumentar o exo/endo ciclismo piscina7,,43,44. Tais manipulações farmacológicas podem fornecer insights adicionais. Por último, FM1-43 fundo pode ocorrer em graus variados, com base na qualidade de dissecação, protocolo de estimulação e a eficácia de lavagem. Alguns adicionam um derivado sulfobutylated da β-ciclodextrina Advasep-745, ou o fluoróforo aquosa sulforhodamina46, para saciar a fluorescência inespecífica e melhorar a relação sinal-de-fundo.

Existem inúmeras técnicas que podem acompanhar FM fluorescente de imagem para maior compreensão do ciclo SV (por exemplo, eletrofisiologia, synaptopHluorin, microscopia eletrônica). Um exemplo mostrado aqui é photoconversion de fluorescência de FM que é usado para investigar o SV ciclo detalhadamente ultraestrutural. SVs são organizados em várias piscinas que são espacialmente e funcionalmente distintos2. A piscina prontamente liberável (RRP) contém vesículas imediatamente divulgadas mediante estimulação aguda. Uma maior concentração de reciclagem mantém versão SV em condições de atividade moderada. Um pool de reserva interna (RP) só é recrutado com estimulação forte (aparentemente perto não-fisiológica)2. As piscinas SV são ativados dependem do tipo de estimulação usada47, e relatórios do MNJ drosófila usando FM photoconversion revelaram insights-chave em Propriedades espaciais e funcionais destes diferentes SV piscinas48. FM photoconversion pode ser usado para estudar piscinas SV ativadas sob estimulação de diferentes paradigmas e perguntas de consulta, tais como a interação de tráfico muito tempo debatida entre endossomos e SVs49. Se o experimentador está interessado na imagem latente de FM em combinação com outras alterações de atividade-dependente na sinapse, há um analog declaradamente fixável do corante FM1-43 (FM1-43FX). Esta sonda deve permitem corrigir a drosófila MNJ após tintura dependente da atividade de carregamento e depois acompanhar com anticorpo rotulagem para testar correlações entre o nível de atividade bouton (fluorescência do corante FM) e expressão de atividade-dependente de um proteína de interesse. No futuro, ele será extremamente gratificante para explorar métodos adicionais que poderiam permitir a combinação de corante FM de imagem com outras abordagens de imagem na sinapse modelo Drosophila MNJ bonita.

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Disclosures

Os autores declaram não interesses concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos Membros Broadie laboratório para contribuições para este artigo. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01s MH096832 e MH084989 para K.B. e NIH predoctoral fellowship F31 MH111144 para D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

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Tintura de FM ciclismo a sinapse: comparando a despolarização de potássio alto, elétrica e Channelrhodopsin estimulação
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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