Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FM-Dye cykling på synapsen: jämföra höga kalium depolarisation, elektriska och Channelrhodopsin stimulering

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptiskt vesikelprotein (SV) cykling är core mekanismen för kommunikationen i nervcellernas synapser. FM dye upptag och utsläpp är det primära sättet att kvantitativt testmetoder SV endo- och exocytos. Här, jämför vi alla stimulering metoder för att driva FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) modell synapsen.

Abstract

FM färgämnen används att studera cykelns synaptiskt vesikelprotein (SV). Dessa amfipatiska sonder har en hydrofil huvud och hydrofoba svans, vilket gör dem vattenlösliga med förmågan att reversibelt ange och avsluta membran lipider lipidmonolager. Dessa styryl färgämnen är relativt icke-fluorescerande i vattenhaltigt medium, men införande i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet orsakar en > 40 X ökning av fluorescens. I nervcellernas synapser, är FM färgämnen internaliserad under SV endocytos, trafikerade både inom och mellan SV pooler och utsläppt med SV exocytos, som tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att visualisera presynaptiska stadier av neurotransmission. En primär genetisk modell av glutamatergic synaps utveckling och funktion är den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ), där FM färga imaging har använts i stor utsträckning att kvantifiera SV dynamik i ett brett utbud av muterade villkor. NMJ synaptic terminalen är lättillgänglig, med en vacker samling av stora synaptic knappar som är perfekt för imaging applikationer. Här, vi jämför och kontrast på tre sätt att stimulera den Drosophila NMJ att driva aktivitet-beroende FM1-43 dye upptag/release: 1) bad tillämpningen av hög [K+] att depolariseras neuromuskulära vävnader, 2) sug elektrod motor nerv stimulering till depolariseras presynaptiska nerven terminal, och 3) riktade transgena uttrycket för channelrhodopsin varianter för ljus-stimulerad, spatial kontroll av depolarisation. Dessa metoder har fördelar och nackdelar för att studera genetisk mutation effekter på SV cykeln på den Drosophila NMJ. Vi kommer att diskutera dessa fördelar och nackdelar att bistå vid valet av metoden stimulering, tillsammans med metoderna som är specifika för varje strategi. Utöver fluorescerande imaging, kan FM färgämnen vara photoconverted electron-tät signaler visualiseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att studera SV cykel mekanismer på en ultrastrukturella nivå. Vi erbjuder jämförelser av confocal och elektronmikroskopi imaging från de olika metoderna för Drosophila NMJ stimulering, att vägleda urvalet av framtida experimentella paradigm.

Introduction

Vackert-kännetecknas Drosophila larval neuromuskulära förbindelsen (NMJ) glutamatergic synaps modellen har använts att studera synaps bildning och funktion med ett brett spektrum av genetiska störningar1. Motorneuronen terminalen består av flera axon grenar, alla med många utvidgade synaptic knappar. Dessa rymlig varicosities (upp till 5 µm i diameter) innehåller alla neurotransmission maskiner, inklusive enhetliga glutamatergic synaptiska vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosoliskt reserven och lätt-releasable pool2. Dessa blåsor docka på presynaptiska plasmamembranet fusion webbplats aktiva zoner (AZs), där exocytos förmedlar glutamat neurotransmitterfrigöraren för trans-synaptiska kommunikation. Därefter hämtas SVs från plasmamembranet via kiss-och-kör återvinning eller clathrin-medierad endocytos (CME) för upprepad exo/endocytos cykler. Den Drosophila NMJ är lättillgängligt och väl lämpad för både isolera och karakterisera SV cykel mutanter. Nya mutationer använder framåt genetiska skärmar, och har lett till identifiering av nya gener kritiska för SV cykel3. Omvänd genetiska metoder börjar med redan kända gener har dessutom lett till förtydligandet av nya SV cykel mekanismer genom en noggrann beskrivning av mutant cykling fenotyper4. Den Drosophila NMJ är nästan perfekt som en experimentell synaptic förberedelse för dissekera SV endocytos och exocytos mekanismer via metoder för att optiskt spår vesikler cykling under neurotransmission.

En rad fluorescerande markörer tillåta visuell spårning av blåsor under cykling dynamics, men den mest mångsidiga är FM dye analoger som syntetiseras först av Mao, F., et al. 5. strukturellt, FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofila svans ansluten via en aromatisk ring, med en central region ger spektrala egenskaper. Dessa styryl färgämnen partitionera reversibelt i membran, inte 'flip-flop' mellan membran broschyrer och så är aldrig gratis i cytosolen, och är långt mer fluorescerande i membran än vatten5. Reversibel införande i en lipid lipidens orsakar en 40-fold ökning av fluorescens6. På nervcellernas synapser bestå klassiska FM dye märkning experiment av badningen synaptic preparatet med färgämnet under depolariserande stimulering att ladda dye via SV endocytos. Yttre färgämne sedan tvättas bort och cykelns SV grips i en kalciumfri ringer-lösning till bild laddade synapserna7. En andra omgång stimulering i ett färgämne-fria bad utlöser FM utsläpp via exocytos, en process som kan följas genom mätning av fluorescens intensitet minskningen. SV populationer från en enda vesikler till pooler som innehåller hundratals blåsor kan vara kvantitativt övervakade6,7. FM färgämnen har använts att dissekera aktivitet-beroende mobilisering av funktionellt distinkta SV pooler och jämföra kiss-och-kör vs. CME cykling8,9. Metoden har ändrats till separat analys framkallat, spontan och miniatyr synaptic cykel aktiviteter (med mycket känslig utrustning för att upptäcka mycket små fluorescens förändringar och minska fotoblekning)10. Analyser kan förlängas till ultrastrukturella nivå genom photoconverting den fluorescerande FM-signalen till en elektron-tät etikett för överföring elektronmikroskopi11,12,13,14 .

Historiskt, bad synaptic preparat i en hög koncentration av kalium (hädanefter benämnd ”hög [K+]”) har varit metoden för val av depolariserande stimulering för att inducera SV Cykling; allt från grodan kolinerga NMJ5, till odlade gnagare hjärnan Hippocampus nervceller15, till Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denna hög [K+] metod är enkel, kräver ingen specialutrustning, och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier, men har begränsningar för både tillämpning och tolkning av data. En mycket mer fysiologiskt lämplig metod är att använda sug elektrod elektrisk stimulering av nerven4,5,12. Detta synsätt driver aktionspotentialens spridning för direkt stimulering av presynaptiska nerven terminal, och resultatet kan direkt jämföras med elektrofysiologiska analyser neurotransmission funktion13,14, 15, men kräver specialutrustning och är tekniskt mycket mer utmanande. Med tillkomsten av optogenetik har användandet av channelrhodopsin neuronala stimulering ytterligare fördelar, inklusive snäva spatiotemporal kontroll av kanal uttryck med binära Gal4/UAS system20. Detta tillvägagångssätt är tekniskt mycket lättare än sug elektrod stimulering och kräver inget annat än en mycket billig LED-ljuskälla. Här, vi anställer imaging FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) specificiteten etylenedibromid) att både jämföra och kontrastera dessa tre olika stimulering metoder på den Drosophila NMJ: enkel hög [K+ ], utmanande elektriska och nya channelrhodopsin metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. larval lim dissektion

  1. Grundligt blanda 10 delar av silikonelastomer bas med 1 del av silikonelastomer härdare från elastomer kit (Tabell för material).
  2. Coat 22 x 22 mm glas coverslips med elastomer och botemedel på en värmeplatta på 75 ° c i flera timmar (tills det inte längre klibbig vid beröring).
  3. Placera en enda elastomer-belagd täckglas i skräddarsydda plexi glas dissektion kammaren (figur 1, botten) förberedelse för larval dissektion.
  4. Förbereda de lim pipetterna från borosilikatglas kapillär med hjälp av standard mikroelektrod avdragare att erhålla önskad koniska och spets storlek.
  5. Försiktigt bryta av mikropipett spetsen och till andra änden, bifoga 2 ft av flexibel plaströr (1/32 ”invändig diameter, ID; 3/32” ytterdiameter, OD; 1/32 ”väggen; Tabell över material) med munnen montering (P2 pipettspetsen).
  6. Fyll en liten behållare (0,6 mL Eppendorf rör GJP) med en liten volym (~ 20 µL) av lim (Tabell för material) som förberedelse för larval dissektion.
  7. Fyll i kammaren med saltlösning (i mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sackaros och 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syra (HEPES) pH 7,2.
  8. Lägg till anti pepparrotperoxidas (HRP) antikropp konjugerat till Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, utspädd 1:10 en lagervara 1 mg/mL) för märkning av NMJ presynaptiska terminal under dissektion21,22.
  9. Med hjälp av en fin pensel (storlek 2), ta bort en vandrande tredje instar från injektionsflaskan med mat och placera på täckglaset elastomer-belagd.
  10. Fyll glas mikropipett spetsen med en liten mängd lim med negativa lufttryck som genereras genom munnen med kvarstad (steg 1,5).
  11. Ställning larv ryggsidan upp med pincett och limma huvudet till det elastomer-belagd täckglaset med en liten droppe lim med positiva lufttryck genom munnen.
  12. Upprepa proceduren med den bakre änden av larven, att se till att djuret är sträckt spända mellan två lim bilagor.
  13. Med sax (blad 3 mm; Tabell för material), göra ett horisontellt snitt (~ 1 mm) på bakre och ett vertikalt snitt längs dorsala mittlinjen.
  14. Med fin pincett (nr 5, Tabell för material), försiktigt bort dorsala luftstrupen, gut, fett kroppen och andra inre organ som täcker muskulaturn.
  15. Upprepa förfarandet för limning för fyra viftar med kroppen väggen, se till att försiktigt sträcka kroppen väggen både horisontellt och vertikalt.
  16. Lyfta den ventrala nerv sladd (VNC) med pincett, försiktigt skära motoriska nerver med saxen och sedan helt ta bort VNC.
  17. Ersätta den dissektion saltlösning med Ca2 +-gratis saltlösning (samma som den ovan dissektion saltlösning utan den CaCl2) för att stoppa SV cykling.

2. alternativ 1: Hög [K+] FM Dye lastning

  1. Från en FM1-43 stamlösning (4 mM), tillsätt 1 µL 1 ml 90 mM KCl lösning (hög [K+] i dissektion saltlösning) för en slutlig koncentration på 4 µM.
  2. Med pipett, ersätta de Ca2 +-gratis koksaltlösning i imaging kammaren med hög [K+] FM dye lösningen att stimulera SV endocytos dye upptag.
  3. Omedelbart börja en digital timer för höga [K+] förutbestämd varaktighet depolariserande stimulering period (t.ex., 5 min; (Se figur 2).
  4. För att bekräfta en friska larver beredning, Observera de starka sammandragningarna i muskulaturen under hela perioden för depolarisation av hög [K+].
  5. När timern perioden avslutas, snabbt bort hög [K+] FM dye lösningen och ersätta med Ca2 +-gratis koksaltlösning att stoppa SV cykling.
  6. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa hög [K+] FM dye lösningen avlägsnas helt.
  7. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging med mikroskopet confocal.

3. imaging: Konfokalmikroskopi

  1. Använda en upprätt confocal Mikroskop med 40 X vatten nedsänkning mål att bilden NMJ dye fluorescens (andra Mikroskop kan användas).
  2. Bild muskel 4 NMJ buk segment 2-4 (andra NMJs kan avbildas) och samla in bilder med hjälp av lämplig programvara (Tabell för material).
  3. Använda en HeNe 633 nm laser för att excitera HRP:647 (med lång-passera filter > 635 nm) och en Argon 488 nm laser att excitera FM1-43 (med bandpass filter 530-600 nm).
  4. Operativt bestämma optimala gain och offset för båda kanalerna.
    Obs: Dessa inställningar förblir konstant under hela resten av experimentet.
  5. Ta en confocal Z-stack igenom den hela valda NMJ från HRP-märkta toppen till botten av synaptic terminalen.
  6. Notera noga med den NMJ avbildas (segmentet, sida och muskel) för att säkerställa överskott till den exakt samma NMJ efter FM färga lossning.

4. hög [K+] stimulering: FM Dye lossning

  1. Ersätta Ca2 +-gratis saltlösning med den höga [K+] saltlösning (utan FM1-43 färgämne) att driva depolarisation, SV exocytos och dye frisläppande.
  2. Omedelbart börja en digital timer för den förutbestämda tidsperiod hög [K+] stimulering (t.ex., 2 min; (Se figur 2).
  3. När timern perioden avslutas omedelbart bort den höga [K+] saltlösning och ersätta med Ca2 +-gratis koksaltlösning att stoppa SV cykling.
  4. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa den höga [K+] saltlösning bort helt.
  5. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging med mikroskopet confocal.
  6. Vara säker på att bilden FM1-43 dye fluorescensen vid den samma NMJ ovan med samma confocal inställningar.

5. alternativ 2: Elektrisk stimulering FM Dye lastning

  1. Förbereda en sug pipett med hjälp av mikroelektrod avdragare (Tabell för material) att erhålla den nödvändiga taper och spets storlek.
  2. Brand-polska mikroelektrod spetsen med en mikro-forge tills en motorisk nerv kan sugas med en tight passform.
  3. Skjut sug pipett på elektrodhållare på en micromanipulator och bifoga till långa flexibla plast röret och en spruta.
  4. Stimulator-parametrarna (t.ex., 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varaktighet och tid 5 min (figur 2) eller 1 min (figur 3)).
  5. Ersätta den Ca2 +-gratis koksaltlösning på larval preparatet med ovan FM1-43 saltlösning (4 µM; 1 mM CaCl2) på elektrofysiologi riggen.
  6. Sätta fram på Mikroskop scenen och höja scenen tills den larv och sug pipett är i fokus (40 X nedsänkning i vatten objektiv).
  7. Suga upp en slinga av skuren motor nerv innervating de valda hemisegment med negativa lufttryck som genereras av sprutan i sug elektroden.
  8. Testa funktionen sug elektrod med en kort burst av stimulering samtidigt visuellt övervakning för muskelkontraktion i den valda hemisegment.
  9. Stimulera den motoriska nerven använda valda parametrar (steg 5,4) att köra SV endocytos och FM1-43 dye upptag (figur 2).
  10. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa FM1-43 dye lösningen avlägsnas helt.
  11. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging confocal imaging protokollet från ovan.
  12. Ta noga noterat den NMJ avbildas (segmentet, sida och muskler) för att säkerställa tillgång till de exakta samma NMJ efter FM dye lossning.

6. elektrisk stimulering: FM Dye lossning

  1. Ersätta den Ca2 +-gratis saltlösning med vanlig koksaltlösning (utan FM1-43 färgämne) och placera preparatet tillbaka på elektrofysiologi rigg scenen.
  2. Ange parametrarna stimulator för lossning (t.ex., 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varaktighet och tid på 2 minuter (figur 2) eller 20 s (figur 3)).
  3. Suga på samma motor nerv i den samma elektroden som ovan, och sedan stimulera till aktivera SV exocytos och FM1-43 dye frisläppande.
  4. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa yttre färgen avlägsnas helt.
  5. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging med mikroskopet confocal.
  6. Se till att bilden FM1-43 dye fluorescensen vid den samma NMJ ovan med samma confocal inställningar.

7. alternativ 3: Channelrhodopsin stimulering FM Dye lastning

  1. Höja ChR2-uttryckande larver på livsmedel som innehåller ChR2 kofaktor all-trans-retinal (löst i etanol; 100 µM slutlig koncentration).
  2. Placera larval preparatet i plexiglas kammaren på en dissektion Mikroskop scenen utrustad med en kamera-port.
  3. Bifoga en Blå lysdiod (470 nm. Tabell över material) till en programmerbar stimulator använder en koaxialkabel och placera LED i kameran porten.
  4. Fokus den blå lysdioden ljusstrålen på funktionen dissekerade larval använda mikroskopet zoom-funktionen.
  5. Ersätta den Ca2 +-gratis koksaltlösning på larval preparatet med ovan FM1-43 saltlösning (4 µM; 1 mM CaCl2) på optogenetic scenen.
  6. Ange parametrarna LED använder en stimulator (t.ex., 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varaktighet och tid för 5 min (figur 2)).
  7. Starta lätt stimulering och spåra med en timer för den förutbestämda tidsperiod optogenetic stimulering (t.ex., det 5 min; (Se figur 2).
  8. När timern slutar, snabbt bort FM dye lösningen och ersätta med Ca2 +-gratis koksaltlösning att stoppa SV cykling.
  9. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa FM dye lösningen avlägsnas helt.
  10. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging med mikroskopet confocal imaging protokollet från ovan.
  11. Ta noga noterat den NMJ avbildas (segmentet, sida och muskler) för att säkerställa tillgång till de exakta samma NMJ efter FM dye lossning.

8. Channelrhodopsin stimulering: FM Dye lossning

  1. Ersätta Ca2 +-gratis saltlösning med vanlig koksaltlösning (utan FM1-43 färgämne) på dissektion Mikroskop scenen med kameran port LED fokuserade på larven.
  2. Ange parametrarna stimulator för lossning (t.ex. 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varaktighet och tid på 2 min (figur 2)).
  3. Starta lätt stimulering och spåra med en timer för en förutbestämd tidsperiod optogenetic stimulering (t.ex. 2 min; (Se figur 2).
  4. När timern perioden avslutas, snabbt bort FM dye lösningen och ersätta med Ca2 +-gratis koksaltlösning att stoppa SV cykling.
  5. Tvätta i snabb följd med Ca2 +-gratis saltlösning (5 x 1 min) för att säkerställa yttre färgen avlägsnas helt.
  6. Upprätthålla larval preparatet i färsk Ca2 +-gratis koksaltlösning för omedelbar imaging med mikroskopet confocal.
  7. Se till att bilden FM1-43 dye fluorescensen vid den samma NMJ ovan med samma confocal inställningar.

9. fluorescens kvantifiering

  1. Läsa in bilden i bilden J (NIH öppen källkod) och skapa en maximal intensitet projektion genom att klicka på bild | Stackar | Z-projektet.
  2. Med hjälp av anti-HRP:647 kanal, gå till bild | Justera | Tröskel och skjut översta verktygsfältet tills bara NMJ markeras.
  3. Med verktyget Trollstav, klicka på NMJ. Om NMJ är diskontinuerlig, Håll Shift-knappen och välj alla delar.
  4. Ändra bilden till FM1-43 dye kanal och gå på analysera | Åtgärd för att erhålla fluorescens mätningen.
  5. Upprepa steg 9,1-9,4 för ”lossas” bilden från de samma NMJ (identifierade segment, sida och muskel).
  6. För att få andelen färgämne som var olastat, ta förhållandet mellan stödnivåerna som lossas/laddad fluorescens.
    Observera: Detta förfarande kan ändras för att analysera fluorescens på bouton-per-bouton basis använda antingen ”oval” eller ”Frihand” markeringsverktygen. Bakgrunden fluorescens kan dras genom provtagning muskel fluorescensen. Ombud kan också läggas för att minska denna bakgrund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar arbete-flödet för aktivitet-beroende FM färgämnet protokoll. Experimentet börjar alltid med samma larval lim dissektion, oavsett stimulering metod som därefter används. Figur 1a är en schematisk bild av en dissekerade larv, visar den ventrala nerv sladden (VNC), utstrålande nerver och upprepade hemisegmental muskelmönster. VNC tas bort och preparatet badade i en 4 µM lösning av FM1-43 (figur 1b, rosa). Preparatet stimuleras då i närvaro av FM dye använder en av tre möjliga alternativ för att ladda färgämnet via aktivitet-beroende SV endocytos (figur 1cI-III). Nästa, FM dye cykling grips med Ca2 +-gratis saltlösning och en viss NMJ terminal som har laddats med FM färgämne är avbildade med confocal Mikroskop (”laddad bild”; Figur 1 d). I det här fallet lastade muskeln 4 NMJ väljs med Schematisk visar placeringen av nerv, NMJ terminal förgrening och FM synaptic knappar. Synaptic preparatet stimuleras en andra gång med samma metod valts ovan, men i avsaknad av FM färgämnet för att driva SV exocytos och FM1-43 release (figur 1e). Samma identifierade NMJ (muskel 4 NMJ i detta exempel) är sedan åter avbildas med HRP:647 synaptic label och kvarstående FM1-43 vesikler signal (”lossas bild”; Figur 1f). Experimenter avgör styrkan och varaktigheten av lastning och lossning faser för att optimera måtten för en specifik analys eller muterade skick. Fluorescensintensiteten kvantifieras efter lastning och lossning (figur 1 d, 1f), för att få mätningar av synaptic dye endocytos och exocytos andelen lastat FM dye släppt. Analyser kan göras för hela NMJ eller enstaka knappar.

FM dye cykling kan stimuleras på tre sätt: 1) hög [K+] saltlösning depolarisation av hela preparatet 2) sug elektrod stimulering av motoriska nerven, eller 3) ljus driven aktivering av riktade channelrhodopsin (ChR2; (Se figur 2). För en direkt sida-vid-sida jämförelse av alla tre metoderna, vi stimuleras med varje strategi för 5 min i närvaro av FM1-43 (lastning) och sedan 2 min i avsaknad av FM1-43 (lossning), och avbildas HRP-märkt NMJs använder identiska confocal inställningar ( Figur 2). Hög [K+] saltlösning depolarisation metoden följer utbredda FM1-43 protokollet för Drosophila larval NMJ23, utom vi använda lim istället för stift för larval dissektion. Limmet undviker störningen med Mikroskop mål och möjliggör mer exakt bestämning av kroppen väggen spänning, men kräver en måttlig inlärningskurva. Alla tre metoderna producera stark och konsekvent fluorescerande signaler över hela NMJ synaptic bouton bersån och inom enskilda synaptic knappar (indragen). Hög [K+] saltlösning depolarisation metoden orsakar alla NMJs ska FM-laddat hela larven som det depolarizes varje neuron i djuret (figur 2A, mitten). Metoden nerv sug elektrod elektrisk stimulering enheter bara i en enda hemisegment av larvaena som den motsvarande innervating motor nerv har varit stimuleras (figur 2B, mitten). Ostimulerade segment på samma djur är distinguishable använder HRP etiketten men innehåller inga observerbara fluorescerande färg lastning och fungera som utmärkta interna kontroller. Optogenetic ChR2 metod producerar riktade depolarisation beroende av transgena Gal4 föraren anställd (figur 2 c). Föraren var här, vesikulär glutamat transportör (vglut) Gal4, så alla glutamatergic neuroner är Aricebo med blå ljus stimulans, inklusive alla de glutamaterga motoriska nervceller. Som ett resultat, är alla NMJs laddade med FM1-43 färgämne i det här exemplet (figur 2 c, mitten). Cell-specifika drivrutiner kan användas för att märka specifika NMJs och lämna andra omärkt för intern kontroll.

FM dye lossning uppnåddes via samma metod som användes för att lasta färgämne. I den första metoden badade helt enkelt larval preparatet i hög [K+] saltlösning i avsaknad av FM1-43 depolariseras celler, bilresa SV exocytos, och lossa de synaptiska terminalerna (figur 2A, höger). Vi väljer vanligtvis lossning kortare (2 min), så lossning är partiell och terminaler förblir synliga i FM-kanal. Sug elektrod elektrisk stimulering lossning är betydligt mer utmanande, eftersom det innebär att återgå till den samma hemisegment, identifiera den samma nerven och åter stimulera den nerven i avsaknad av FM1-43 att köra lossning färgämne (figur 2B , höger). Observera att färgämnet lossning igen var partiska. ChR2 lossning innebär en andra period på blå LED-belysning larval förberedelserna i avsaknad av FM1-43 aktivera kanaler, depolariseras de motoriska nervcellerna och stimulera SV exocytos dye release (figur 2 c, höger). Med denna tidsskala för lossning (2 min), var och en av dessa depolarisering metoder lossas endast en procentandel av den inlästa FM1-43 dye, med höga [K+] starkaste och ChR2 svagaste i körning dye release (figur 2). Vi mätte LED ljusintensiteten används (140 µW/mm2), som var i den publicera utbud (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 aktiveras maximally genom ~ 1 mW belysning från 50-200 mW ljuskällor, med ChR2 effektivitet också beroende av ATR koncentrationen matas till larv27,28. Således, ChR2 stimulering styrka kan manipuleras. Förhållandet kan dessutom inte vara sant med stimulering styrkor, tidsskalor eller genotyper. Om experimenter arbetar med en mutant som har minskat SV endocytos eller ovanligt snabb exocytos, kan parametrarna stimulering behöva ändras för att upprätthålla en observerbar signal efter lossning. Anti-HRP etiketten gör att man kan identifiera NMJ även i fullständig avsaknad av FM signalen, men detta är inte idealiskt för kvantifiering. I princip kan lossning stimulering också vara av olika typ från lastning stimulering.

Vi har nyligen studerat förlusten av utsöndrade synaptic deacylase hhhhhh effekterna på SV cykeln använder elektrisk stimulering4. Här, utvidga vi denna analys för att jämföra (1) hög [K+] depolarisation och 2) sug elektrod motor nerv stimulering metoder (figur 3). Vi tycker att både metoder ger ett liknande resultat, visar minskad FM1-43 dye lastning i en hhhhhh null mutant; graden av fenotypen är dock tydliga mellan de två metoderna. Efter depolarisation med hög [K+] saltlösning i fem min finns det en stor minskning av inlästa fluorescensintensiteten mellan genetisk bakgrund kontroll (w1118) med höga nivåer och hhhhhh null mutanter (hhhhhhKO ) med låga nivåer (figur 3A, överst). Kvantifierade mätningar minskas normaliserade FM fluorescensintensiteten inom HRP-beskrivs NMJ terminaler avsevärt i avsaknad av hhhhhh (w1118 1,0 ± 0,05 vs. hhhhhhKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0,0001; Figur 3B). Efter elektrisk stimulering vid 20 Hz för 1 min hittar vi en obetydlig minskning laddade FM1-43 intensitet mellan kontroller och hhhhhh nullvärden när kvantifiera hela NMJ fluorescens (w1118 1,0 ± 0,05 vs. hhhhhhKO 0.86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figur 3A, B). Vid mätning av färgämne införlivande på basis av bouton-per-bouton, finner vi en signifikant minskning av färgämne laddad med båda metoderna. I kvantifierade mätningar efter stimulering med hög [K+] koksaltlösning, normaliserade FM fluorescensintensiteten per bouton avsevärt sänkt (w1118 1,0 ± 0,02 vs. hhhhhhKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0,0001; Figur 3 c). Efter elektrisk stimulering, normaliserade fluorescensintensiteten per bouton minskas också avsevärt, om än i lägre grad (w1118 1,0 ± 0,02 vs. hhhhhhKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001, Figur 3 c).

Resultatet skillnaderna mellan två stimulering paradigm kan bero på ett antal faktorer. Först, stimulering styrkan antas vara större med hög [K+] jämfört med elektrisk motor nervstimulering. Elektrofysiologi inspelningar kan inte göras i närvaro av den höga [K+] saltlösning, men de larver neuromusculature tydligt stimuleras kraftfullt, som muskelsammandragningar är starka och kontinuerlig under hela 5 minuters bad. Dock vet vi inte styrka eller frekvensen av stimulering. Däremot styrs mycket mer av elektrisk stimulering med användaren att välja exakt spänning styrka och frekvens av stimulering. Andra stimulering varaktighet var längre med hög [K+] jämfört med elektrisk nervstimulering (figur 3). Vi valde 1 min av 20 Hz elektrisk stimulering efter upprepade försök. Efter 1 min av färgämne lastning fanns det en stark och pålitlig FM1-43 signal, så vi valde det paradigmen för vår studie4, även om 5 min av stimulering gav en ännu starkare fluorescerande signal (figur 2). Således, längden på stimulering paradigm sannolikt bidrar till magnitud variabiliteten i FM1-43 lastning mellan hög [K+] och elektrisk stimulering (figur 3B, C). Även om metoden hög [K+] visade en mer robust fenotyp för hhhhhh mutanter, används vi fortfarande elektriska metoden på grund av den största kontroll4. Det finns många parametrar för att styra till exempel styrka, frekvens och varaktighet av stimulering, och dessa inställningar måste beslutas baserat på muterat och frågan. Till exempel stimulering metod valet kan bero på SV pool förhördes7 och mekanismen för aktivitet-beroende undersökt10.

Efter FM1-43 lastning i NMJ terminal, kan man använda fluorescens dye photoconversion att producera elektron-tät signalen för elektronmikroskopi (figur 4). I denna metod utsätts dye-loaded preparatet för intensiv fluorescerande ljus i närvaro av Diaminobenzidin (DAB), med den reaktiva syreradikaler från FM färgämnet oxiderande DAB för att skapa en mörka fällningen (figur 4A)11. Vänligen se JoVE artikeln på photoconversion av styryl färgämnen för kompletta Detaljer12. Fördelen med denna metod är att SVs avslöjas tydligt på ultrastrukturella nivå, även om SV cykeln är naturligtvis greps med statiska elektronmikroskop imaging. I avsaknad av stimulering, synaptic knappar på den Drosophila NMJ läses tätt med blåsor (~ 40 nm i diameter; Figur 4B), med sällsynta förekomsten av utvidgade organeller (>100 nm i diameter) förmodas vara cykling endosomes. Hög [K+] saltlösning depolariserande stimulering starkt ändrar denna profil, med en partiell utarmning av SV befolkning och snabb ackumulering av många utvidgade organeller (>100 nm i diameter) tros härröra från bulk endocytos av plasmamembranet (figur 4 c, vänster). Även liknande fack finns i ostimulerade kontroller, väcker den höga tätheten av dessa organeller efter hög [K+] saltlösning depolarisation oro att detta kan vara en icke-fysiologisk reaktion. Sug elektrod elektrisk stimulering av motoriska nerven är relativt effektivare i ozonnedbrytande SV befolkning och producerar inte mer av de utvidgade endosomal blåsor (figur 4 d, vänster). Detta tyder på att den bulk endocytos drivs av hög [K+] depolarisation hjälper till att upprätthålla SV befolkningen under mer intensiv efterfrågan.

FM1-43 photoconversion kan åstadkommas med antingen hög [K+] saltlösning depolarisation eller sug elektrod elektrisk stimulering av motoriska nerv, för att jämföra synaptic ultrastruktur i förhållande till en vilande bouton (figur 4). Med hög [K+] depolariserande stimulering, både enskilda SVs och utvidgade blåsor (>100 nm i diameter) kan märkas med den elektron-tät DAB fällning följande ljus-driven photoconversion (figur 4 c, höger). Av okänd anledning är den utvidgade vesikler membranen vanligtvis mindre tätt märkt än mindre SV membranet. Dessutom SVs visas ofta fylld med DAB fällningen, snarare än bara membranet, men detta gör dem mycket lättare att skilja från de namnlösa blåsor. Med sug elektrod stimulering av motoriska nerven, kan cykling SV befolkning också markeras i förhållande till namnlösa SVs (figur 4 d, höger). Med elektrisk stimulering, förstorade blåsor (>100 nm i diameter) bildas inte nötkreatur i knappar och, konsekvent, membranen i den förmodade endosomes är inte märkta av FM1-43 photoconversion. Som är ovan, Cykling SVs vanligtvis fyllda med DAB fällning i ett något mode, och därför lättare urskiljbara från SVs som inte har bildats under stimulering (figur 4 d, höger). Vi har ännu inte försökt photoconversion ChR2 stimulering. Med olika tidsförlopp för stimulering gör FM1-43 dye photoconversion att man kan bestämma där SVs bildas, hur SVs smugglas och tidpunkten för rörlighet mellan olika rumsliga pooler inom den synaptiska bouton. Jämförelse av hög [K+] och nervstimulering tillåter dissektion av bulk och enda SV endocytos mekanismer.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema över FM1-43 dye lastning protokoll på den Drosophila NMJ. Larver lim dissektion producerar en tillplattad neuromusculature beredning, med den ventrala nerv sladden (VNC) projicera segmentell nerver från ventrala mittlinjen (Vm) till hemisegmentally upprepade kroppen väggen muskel matriser (steg ett). VNC är skär gratis, och hela larval dissektion är sedan inkuberas i rosa FM1-43 lösningen (4 µM) som förberedelse för stimulering (steg b). FM1-43 läses sedan med en valda stimulering paradigm (steg 3); med alternativen för hög [K+] depolarisation av hela larven (cI), sug elektrod stimulering av en enda motor nerv (cII), eller ljus-driven aktivering av välriktad channelrhodopsin (cIII). FM1-43 inkorporering grips med Ca2 +-gratis saltlösning och den dye-loaded NMJ avbildas (steg d). En andra stimulering sker sedan utan FM1-43 i badet att köra dye synaptiskt vesikelprotein exocytos (steg e). Den samma NMJ är sedan åter avbildas för att assay lossas synaptic terminalen (steg f). Fluorescerande intensitet mäts från både lastade och olastade NMJs att kvantifiera SV endocytos och SV exocytos nivåer. Den nedre panelen visar konstruktionen parametrar och dimensioner för transparent akryl kammaren används för dessa studier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: FM färga lastning och lossning jämförelse av alla stimulering metoder. Jämförelse mellan FM1-43 färga lastning och lossning i den vandrande tredje instar NMJ med 1) hög [K+] depolarisation av hela larval preparatet (överst), 2) sug elektrod elektrisk stimulering av motoriska nerven (mitten) och 3) ljus-driven aktivering av den riktade channelrhodopsin (ChR2) endast i motoriska nervceller (nederst). (A) det larval NMJ märkt med anti-HRP:647 presynaptiska membranet markör (blå, vänster), laddad med FM1-43 via hög [K+] depolarisation för 5 min (mitten) och sedan lossas via hög [K+] depolarisation för 2 min. (B) Jämförelse med sug elektrod elektrisk nervstimulering med samma stimuli perioder för båda FM1-43 dye lastning och lossning. (C) riktade vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R uttryck i motoriska nervceller aktiveras med blå (470 nm) ljus för samma stimuli perioder av FM1-43 färgämne lastning och lossning. Asterisker avser inläggningar visar högre förstoring knappar. Skalstapeln är 10 µm, med infälld synaptic knappar förstorade 3,5 X från huvudsakliga paneler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Hhhhhh null mutanter Visa minskad FM dye lastning i synaptic knappar. FM1-43 lästs in synaptiska terminaler de vandrande instar tredje NMJ jämföra genetisk kontroll (w1118) till hhhhhh null mutanter (hhhhhhKO). (A), NMJ knappar märkta med hög [K+] depolarisation av hela larval förberedelse (överst) eller sug elektrod stimulering av en motorisk nerv (botten) i w1118 (vänster) och hhhhhhKO (höger). (B) kvantifierade laddad FM1-43 fluorescens per NMJ som ett spridningsdiagram jämförde hög [K+] depolarisation och sug elektrod stimulering i w1118 kontroller vs. hhhhhhKO mutanter. (C) kvantifierade laddad fluorescens på basis av bouton-per-bouton som en box-och-whisker komplott jämföra hög [K+] depolarisation och sug elektrod stimulering i w1118 kontroller vs. hhhhhhKO . Students tvåsidiga t-tester utfördes för varje jämförelse med p-värden visas i diagrammen. Staplarna visar medelvärde ± SEM gjort med prisma (Version 7.0 för Windows). Elektrisk stimulering data har anpassats med tillstånd från Kopke et al., utveckling 144 (19): 3499-510, 2017. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Synaptic ultrastruktur med FM dye photoconversion att markera vesicles. Fluorescerande FM1-43 kan vara photoconverted till ett oxiderat Diaminobenzidin (DAB) elektron-tät fällningen för visualisering via transmissionselektronmikroskopi (TEM). (A) A Schematisk bild av metoden photoconversion att märka den Drosophila NMJ efter aktivitet-beroende FM1-43 dye lastning. (B), representativa TEM bild av en vildtyp synaptic bouton i vila (ostimulerade). Observera tät population av enhetlig storlek SVs. (C) Synaptic knappar som har stimulerats med hög [K+] saltlösning depolarisation för 5 min, utan photoconversion (vänster) eller med FM1-43 photoconversion (höger). Notera förekomsten av bulk endosomal strukturer, märkt och omärkt. (D) Synaptic knappar som har varit stimuleras elektriskt med en nerv sug elektrod vid 20 Hz för 5 min med ingen photoconversion (vänster) eller med FM1-43 photoconversion (höger). Observera att de dye-loaded blåsor visas mycket mörkare än angränsande lossas blåsor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hög [K+] saltlösning depolariserande stimulering är den absolut enklaste av de tre alternativen för aktivitet-beroende FM dye Cykling, men sannolikt den minst fysiologiska29. Den här enkla metoden depolarizes varje tillgänglig cell i hela djuret, och så tillåter inte riktade studier. Det kan vara möjligt att tillämpa lokalt hög [K+] saltlösning med en mikropipett, men detta kommer fortfarande depolariseras pre/postsynaptiska celler och sannolikt synaps-associerade glia1. En annan viktig fråga är att hög [K+] depolarisation enheter snabbt bildande av bulk endosomes som sällan ses i ostimulerade knappar. Bulk endosome bildandet är dock en aktiv mekanism blockeras av mutationer29, som anger en riktig fysiologisk process. FM1-43 avbildning med hög [K+] depolarisation kan således användas selektivt studera bulk endocytos i synapser. Sug elektrod elektrisk stimulering av motoriska nerv är en mycket mer kontrollerad metod. Det har den fördelen att endast en enda axon bunt stimuleras, och endast de presynaptiska termini är direkt Aricebo (naturligtvis muskelfibern är sedan Aricebo av sändaren åtgärd). Det ger därför en bra intern kontroll av NMJs på samma djur som inte stimuleras. Denna metod gör att noggrant styra parametrarna stimulering, till skillnad från hög [K+] stimulering metoden möjliggör direkt jämförelse med elektrofysiologi inspelningar4. Men denna teknik kräver specialutrustning och en ganska hög grad av teknisk skicklighet, och är därför mindre tillgänglig. Ljus-driven aktivering av riktade channelrhodopsin (ChR2) har fördelen av inriktning Välj nervceller30. Denna metod kräver ingen förtrogenhet med elektrofysiologi metoder, och kan göras med mycket billig utrustning i någon labb, men denna metod kräver grundläggande kunskaper om Drosophila genetik.

Valet av stimulering parametrar är kritiskt viktigt för testning SV cykel dynamics efterfrågas inom en rad genetiska förhållanden med mycket variabla fenotyper1. För alla metoder, den externa [Ca2 +] används är en viktig parameter som styr den drivande kraften i SV cykling. Med metoden hög [K+] stimulering, är ett viktigt val [K+] används, som bestämmer graden av depolarisation styrka. Mätningar av Drosophila eukaryot indikerar en [K+] på 5 mM och 90 mM är normalt den koncentration som oftast valts för aktivitet stimulering3,7,15,17 , 31. dock ett [K+] intervall från 30-90 mM har varit anställd att variera den stimulering styrka5,16,32. En annan kritisk parameter beslut är längden av hög [K+] stimulering för båda FM1-43 lastning och lossning. Perioden för lastning avgör huruvida hela cykling SV befolkning laddas effektivt, eller bara en delmängd av aktiva blåsor7. Perioden för lossning på samma sätt dikterar procentandelen av SVs genomgår exocytos i perioden stimulering, som kan avslöja eller skymma mutant fenotyper beroende av hastigheten ändras i SV cykling frekvens2. Med sug elektrod elektrisk motor nervstimulering inkluderar parametervalen även stimulering spänning, frekvens, varaktighet och puls intervall. Temporally mönstrade aktivitet är en avgörande faktor för SV cykling dynamics7, och olika stimulans mönster kan selektivt mobilisera distinkta SV pooler. Med riktade ljus-driven ChR2 aktivering, val inkluderar alla ovanstående (med ljusintensitet variabler) och ytterligare transgena alternativ diskuteras i nästa avsnitt. Med dessa parameter kommer val mer experimentell kontroll, men också ökad teknisk komplexitet.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) är en ljus-gated membran kanal genomsläppliga för mono- och divalenta katjoner33. Om ChR2 stimulering väljs, finns det många val som skall göras inklusive Gal4 förare, UAS-ChR2 konstruera och ljuskälla variabler för kanal aktivering. Gal4 förare allt från allestädes närvarande till mycket specifika. Till exempel allestädes närvarande UH1-Gal4 (daughterless) skulle uttrycka ChR2 i varje cell, medan CcapR-Gal4 (Janelia) driver ChR2 i muskeln 6/7 NMJ men inte den muskel 4 NMJ31,34. Denna selektivitet kan användas som en kraftfull intern kontroll. Finns det jämväl många UAS-ChR2 varianter, inklusive ChR2-H134R (används här, de muterade rester orsakar ökad photocurrents)35, VChR1, ChIEF och många fler36. Alla dessa kanal varianter har distinkta egenskaper ljusets gating, konduktans, ion selektivitet, kinetik och hyposensibilisering. Observera vissa konstruktioner innehåller en fluorescerande tagg som kan hindra FM imaging. Till exempel den UAS-ChR2-H134R används här är märkta med mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), men producerar inte spårbar utsläpp med FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) imaging filter. Tekniska parametervalen inkluderar ljuskälla, våglängd och intensitet för kanal aktivering. Ett alternativ som används här är en billig blå-avger LED, med stimulering visuellt bekräftas av testmetoder muskelsammandragningar. Vi lyckades också aktivera ChR2 använder epifluorescence, även om en skanning confocal laser inte var tillräcklig. Epifluorescence kunde användas i riktad stimulering (specifika segment i stället för hela djuret), men stimulering parametrar är svåra att kontrollera, medan LED ansluten upp till en enkel stimulator enkelt förändrar både varaktighet och frekvens av ljus pulser. Fokusera lampan genom dissektion Mikroskop kamera port tillåter mer kontrollerad, intensivt ljus stimulering.

Det är upp till försöksledaren att besluta huruvida lämna ventrala nerv sladd/hjärnan intakt under stimulering paradigm. Vi valde att ta bort hela centrala nervsystemet för jämförelse av de tre metoder som används här, men ibland uppströms ledningar är kvar intakt15. En komplikation är att endogena neurala aktiviteten inträffar när nervsystemet är kvar hela. Graden av denna aktivitet är mycket varierande från djur till djur, i hög grad beroende av dissektion sakkunskapen hos experimenter. Denna variabel aktivitet kan bidra till mängden FM1-43 färgämne som lastas och lossas, vilket är därför inte enbart på grund av exogen stimulering sysselsatta15. En relaterade tekniska komplikation är att intakt dissekerade larver kontrakt muskulaturen i fiktiva rörelse, och denna förskjutning kraftigt stör NMJ imaging. Denna rörelse lindras om centrala nervsystemet tas bort, och även genom tillämpning av Ca2 +-gratis saltlösning under imaging4. Dessa metoder som används här är tillräckliga för att utmärkta FM1-43 dye imaging i NMJ preparatet. Dock välja vissa praktiker att lägga till droger för att hämma muskelkontraktion (t.ex. ryanodine, philanthotoxin-433), eller använda aktionspotential blockerare (t.ex. tetrodotoxin)37,38. En rad läkemedel kan användas för att selektivt manipulera SV cykeln, för att belysa vissa steg eller accentuera mutant fenotyper för att undersöka neurotransmission mekanismer. Till exempel vissa praktiker har anställt Veratridine (aktiverar spänningskänsliga Na+ kanaler39) för att öka SV lastning i reserven poolen, cyklosporin A (hämmar kalcineurin aktivitet40) för att förbättra SV endocytos, och Forskolin (aktiverar viktreglerande cyclase41, som förbättrar synaptisk transmission42) att öka de exo/endo cykliska pool7,43,44. Sådan farmakologiska manipulationer kan ge ytterligare insikter. FM1-43 bakgrund kan slutligen uppstå i varierande grad baserat på kvaliteten på dissektion, tvätt effektivitet och stimulering protokoll. Några lägga ett sulfobutylated derivat av β-cyklodextrin Advasep-745, eller den aqueous fluorophore sulforhodamine46, att släcka ospecifik fluorescens och förbättra signalen till bakgrunden förhållande.

Det finns många tekniker som kan åtfölja FM fluorescerande imaging till ytterligare förståelse av SV cykeln (t.ex. elektrofysiologi, synaptopHluorin, elektronmikroskopi). Ett exempel visas här är FM fluorescens photoconversion som används för att undersöka SV cykel ultrastrukturella i detalj. SVs är organiserade i flera pooler som är rumsligt och funktionellt distinkta2. Den lätt releasable poolen (RRP) innehåller blåsor omedelbart släpps vid akut stimulering. En större återvinning pool underhåller SV release under förhållanden av måttlig aktivitet. En inre reserve pool (RP) bara rekryteras med stark (till synes nära icke-fysiologisk) stimulering2. SV poolerna som aktiveras beror på vilken typ av stimulering används47, och rapporter från de Drosophila NMJ använder FM photoconversion har avslöjat viktiga insikter i rumsliga och funktionella egenskaper hos dessa olika SV pool48. FM photoconversion kan användas för att studera SV pooler aktiverats under olika stimulering paradigm, och fråga frågor såsom länge debatterade människohandel samspelet mellan endosomes och SVs49. Om försöksledaren är intresserade av FM imaging i kombination med andra aktivitet-beroende förändringar vid synapsen, finns det en enligt uppgift fastställbara analog av FM1-43 färgämnet (FM1-43FX). Denna sond bör tillåter en att fixa den Drosophila NMJ efter aktivitet-beroende dye lastning, och sedan följa upp med antikropp märkning för att testa för korrelationer mellan bouton aktivitetsnivå (FM dye fluorescens) och aktivitet-beroende uttryck för en protein av intresse. I framtiden, det kommer vara mycket givande för att utforska ytterligare metoder som kan möjliggöra kombinationen av FM dye imaging med andra bildgivande metoder vid vackra Drosophila NMJ modell synapsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Broadie Lab medlemmar för bidrag till denna artikel. Detta arbete fick stöd av NIH R01s MH096832 och MH084989 till K.B., och NIH pre gemenskap F31 MH111144 till D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Neurovetenskap fråga 135 Drosophila neuromuskulära förbindelsen FM1-43 elektrofysiologi photoconversion transmissionselektronmikroskopi
FM-Dye cykling på synapsen: jämföra höga kalium depolarisation, elektriska och Channelrhodopsin stimulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter