Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

Abstract

FM boyalar sinaptik vezikül (SV) döngüsü incelemek için kullanılır. Bu amfipatik probları hidrofilik baş ve hidrofobik kuyruk, onları geri dönülebilir olarak girin ve membran lipid bilayers çıkmak için yeteneği ile suda çözünebilir hale var. Bu styryl boya nispeten olmayan sulu ortamda floresan, ancak plazma zarı dış broşür içine ekleme neden bir > 40 X artırmak floresans içinde. Nöronal sinapslarda içinde FM boyalar sırasında SV endositoz, neurotransmission presynaptic aşamaları görselleştirmek için güçlü bir araç sağlayarak hem içinde hem de SV havuzları arasında ticareti ve ile yayımlanan SV ekzositozu içselleştirilmiş. Bir birincil genetik glutamatergic sinaps geliştirme ve işlev nöromüsküler kavşak (NMJ), nerede FM boya görüntüleme yoğun SV dynamics mutant koşulları geniş bir alanda ölçmek için kullanılan Drosophila modeldir. Büyük sinaptik boutons için görüntüleme uygulamalarında ideal güzel bir dizi NMJ sinaptik terminal kolayca ulaşılabilir. Burada, biz karşılaştırın ve kontrast Drosophila NMJ etkinlik bağımlı FM1-43 boya alımı/release sürücü teşvik için üç yol: 1) banyo uygulama yüksek [K+nöromüsküler doku depolarize, 2) elektrot motor sinir emme için] presynaptic sinir terminal ve 3 depolarize stimülasyon) depolarizasyon ışık uyarılmış, mekansal kontrolü için channelrhodopsin versiyonlarının transgenik ifade hedef. Bu yöntemlerin her birinin yararlarını ve sakıncalarını SV döngüsü üzerinde genetik mutasyon etkileri incelenmesi için Drosophila NMJ var. Biz bu avantajları ve dezavantajları her strateji için belirli metodolojisi ile birlikte stimülasyon yaklaşım yelpazesi yardımcı olmak için görüşecek. Floresan görüntüleme ek olarak FM boyalar-ebilmek var olmak photoconverted elektron yoğun sinyalleri SV döngüsü mekanizmaları ultrastructural bir düzeyde çalışmaya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntülenir. Biz confocal karşılaştırmalar sağlamak ve elektron mikroskobu Drosophila NMJ stimülasyon, rehber yardımcı olmak için farklı yöntemler gelecekteki deneysel paradigmalar yelpazesi görüntüleme.

Introduction

Synapse oluşumu ve genetik tedirginlikler1geniş bir yelpazede işleviyle çalışmaya Drosophila larva nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic güzel karakterize synapse modeli kullanılmıştır. Motor nöron terminal birden çok axon dalları, her biri pek çok genişlemiş sinaptik boutons oluşur. Bu geniş varicosities (ilâ 5 mikron çapında) tek tip glutamatergic sinaptik veziküller dahil olmak üzere neurotransmission makine içeren (SVs; ~ 40 nm çapında) sitozolik rezerv ve kolayca derledi havuzları2. Bu veziküller nerede ekzositozu aracılık eder glutamat nörotransmitter serbest bırakılması için transpresynaptic plazma zarı fusion site aktif bölgelerde (AZs), dock-sinaptik iletişim. Daha sonra SVs tekrarlanan exo/endositoz devredir plazma zarı öpücük tarafından işletilen geri dönüşüm veya clathrin-aracılı endositoz (CME) üzerinden alınır. Drosophila NMJ kolayca erişilebilir ve yalıtma ve SV döngüsü mutantlar karakterize için oldukça uygundur. İleri genetik ekranları kullanarak, yeni genlerin SV döngüsü3için kritik kimliği roman mutasyonlar açmıştır. Ayrıca, zaten bilinen genler ile başlayarak geriye doğru genetik yaklaşımlar yeni SV döngüsü mekanizmalar aracılığıyla fenotipleri4Bisiklete binme mutant dikkatli açıklaması aydınlatma yol açmıştır. Drosophila NMJ neredeyse SV endositoz ve ekzositozu mekanizmaları yöntemleri için optik neurotransmission sırasında Bisiklete binme parça vezikül ile dissekan için deneysel bir sinaptik hazırlık olarak idealdir.

Flüoresan işaretler bir dizi dynamics Bisiklete binme sırasında veziküller görsel izlenmesine izin, ancak ilk Mao, F., ve arktarafından sentezlenir FM boya analogları en çok yönlü vardır. 5. yapısal olarak, FM boyalar hidrofilik bir baş ve bir aromatik halka aracılığıyla spektral özellikleri veriyor bir merkez bölge ile bağlı bir lipofilik kuyruğu içerir. Bu styryl boyalar ters bölme içinde membranlar, 'membran broşürler arasında flip-flop değil' de hiç öyle sitozol ücretsiz ve su5' ten membranlar içinde çok daha floresan. Lipid bilayer içine ters çevrilebilir ekleme floresans6' 40-fold bir artış neden olur. Nöronal sinapslarda Klasik FM boya etiketleme deneyler sinaptik hazırlık stimülasyon depolarize sırasında boya boya SV endositoz ile yüklemek için banyo oluşur. Dış boya sonra yıkanıp ve SV döngüsü yüklü sinapslarda7görüntüye bir kalsiyum ücretsiz zil çözümünde tutuklandı. Stimülasyon boya ücretsiz banyo içindeki ikinci turunda FM yayın ekzositozu, floresan yoğunluğu azalma ölçerek takip edilebilir bir süreç aracılığıyla tetikler. Tek bir vezikül SV gruplarından veziküller yüzlerce içeren havuzlarına kantitatif izlenen6,7olabilir. İşlevsel olarak farklı SV havuzları etkinlik bağımlı seferberlik teşrih ve öpücük ve çalıştırma8,9Bisiklete binme CME vs karşılaştırmak için FM boyalar kullanılmaktadır. Yöntem uyarılmış, ayrı ayrı tahlil için spontan ve minyatür sinaptik döngüsü faaliyetleri (ile çok küçük floresan değişiklikleri algılamak ve photobleaching azaltmak için son derece hassas ekipman)10değiştirildi. Transmisyon Elektron mikroskobu11,12,13,14 elektron yoğun bir etiket içine photoconverting floresan FM sinyal tarafından ultrastructural seviyeye uzatılabilir deneyleri .

Tarihsel olarak, banyo sinaptik hazırlıkları (bundan sonra "yüksek [K+]" anılacaktır) potasyum yüksek bir konsantrasyon içinde Bisiklete binme SV ikna etmek için stimülasyon depolarize için seçtiğiniz yöntemi olmuştur; kurbağa kolinerjik NMJ5, değişen kemirgen beyin hipokampal nöronlar15, Drosophila glutamatergic NMJ modeli16,17kültürlü. Bu yüksek [K+] yaklaşımı basittir, hiçbir özel ekipman gerektirir ve bu nedenle çoğu Labs'e erişilemez ama uygulama ve veri yorumu için sınırlamalar vardır. Sinir4,5,12emme elektrot elektriksel stimülasyon kullanın fizyolojik açıdan çok daha uygun bir yöntemdir. Bu yaklaşım doğrudan presynaptic sinir uyarılması için Aksiyon potansiyeli yayılma terminal sürücüler ve sonuçları doğrudan neurotransmission işlevi13,14elektrofizyolojik deneyleri için karşılaştırılabilir, 15, ama özel ekipman gerektirir ve teknik olarak çok daha zordur. Optogenetics gelişiyle channelrhodopsin nöronal stimülasyon kullanımı kanal ifade kullanarak ikili Gal4/UAS sistem20sıkı kronolojik zamanmekansal kontrolü de dahil olmak üzere ek avantajlar vardır. Bu yaklaşım teknik olarak emme elektrot stimülasyon çok daha kolay ve çok ucuz bir LED ışık kaynağı başka bir şey gerektirir. Burada, çalışan sayımız görüntüleme FM1-hem karşılaştırmak ve bu üç farklı stimülasyon yöntemi Drosophila NMJ, kontrast için 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide): basit yüksek [K+ ], elektrik ve yeni channelrhodopsin yaklaşımlar zorlu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. larva tutkal diseksiyon

  1. Silikon elastomer temel silikon elastomer Ajan elastomer kiti (Tablo reçetesi) kür, 1 kısım ile 10 parçaları iyice karıştırın.
  2. 22 x 22 mm cam coverslips elastomer ve tedavi 75 ˚C de sıcak bir tabak üzerinde birkaç saat (artık yapışkan kadar dokunmak) kat.
  3. Bir tek elastomer kaplı cam coverslip larva diseksiyon için hazırlık özel yapım pleksi cam diseksiyon odanın içine (Şekil 1, alt) yerleştirin.
  4. Borosilikat cam kılcal bir standart elektrot çektirmenin istenen konik elde edilir ve boyutu ipucu kullanarak üzerinden Tutkal pipetler hazırlayın.
  5. Yavaşça micropipette ucu kapalı ve diğer ucunu kırmak, esnek plastik boru (1/32" iç çapı, kimliği 3/32" dış çapı, OD; 1/32" duvar; 2 ft eklemek Tablo malzeme) (P2 pipet ucu) uygun ağzıyla.
  6. Tutkal (Tablo reçetesi) larva diseksiyon için hazırlık küçük hacimli (~ 20 µL) ile küçük bir kap (0.6 mL Eppendorf tüp kap) doldurun.
  7. Odası (mM) salin ile doldurun: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sukroz ve 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.2.
  8. Anti-at turp peroksidaz (HRP) antikor Alexa Fluor 647 için Birleşik ekleyin (anti-HRP:647; 1 mg/mL stoktan seyreltik 1:10) NMJ etiketleme için diseksiyon21,22sırasında presynaptic terminal.
  9. İnce fırça (boyutu 2) kullanarak, bir göçebe üçüncü INSTAR gıda şişeyi çıkarın ve elastomer kaplı cam yerleştirin.
  10. Cam micropipette uç ağız eki (adım 1.5) ile olumsuz hava basıncı kullanarak tutkal küçük bir birim ile doldurun.
  11. Pozisyon larva dorsal tarafı yukarı ile forseps ve yapıştırıcı tutkal olumlu hava basıncı ağız yoluyla kullanarak küçük bir elastomer kaplı coverslip başına bırak.
  12. Hayvan gerilir iki tutkal ekleri arasında gergin emin larva, posterior sonu ile bu yordamı yineleyin.
  13. Makas kullanarak (bıçaklar 3 mm; Malzemeler tablo), yatay kesim (~ 1 mm) arka ve dorsal orta çizgi boyunca dikey bir kesim yapmak.
  14. İyi forseps (#5, Tablo malzemeler), hafifçe kullanarak dorsal trakea, gut, yağ vücut ve kas kapsayan diğer iç organlara kaldırın.
  15. Yapıştırma yordamı yavaşça hem yatay hem de dikey olarak vücut duvar germek emin dört vücut duvar kapakları için yineleyin.
  16. Forseps kullanarak ventral sinir kablosu (VNC), dikkatle motor sinirler makasla kesin kaldırıp sonra tamamen VNC çıkarın.
  17. Diseksiyon serum Ca2 +ile değiştirin-ücretsiz serum (yukarıdaki diseksiyon salin CaCl2olmadan aynı) SV durdurmak için Bisiklete binme.

2. seçenek 1: Yüksek [K+] FM boya yükleme

  1. Bir FM1-43 hisse senedi çözümden (4 mM), 90 mm KCl çözüm (yüksek [K+] diseksiyon serum) 4 µM son bir konsantrasyon için 1 mL 1 µL ekleyin.
  2. Bir pipet kullanarak yerine Ca2 +-SV endositoz boya alımı teşvik için yüksek [K+] FM boya solüsyonu ile görüntüleme odasında ücretsiz salin.
  3. Hemen bir dijital zamanlayıcı stimülasyon dönemi depolarize yüksek [K+] önceden belirlenmiş süre başlatmak (Örn., 5 min; Şekil 2).
  4. Sağlıklı bir larva hazırlık onaylamak için yüksek [K+] depolarizasyon dönemi süresince kas güçlü kasılmalar unutmayın.
  5. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hızlı bir şekilde yüksek [K+] FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-SV durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  6. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) yüksek [K+] FM boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  7. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.

3. Multimedya: Confocal mikroskobu

  1. Bir dik confocal mikroskobu 40 X su daldırma amaç görüntü NMJ boya Floresan (diğer mikroskoplar kullanılabilir) için kullanın.
  2. Resim 2-4 (diğer NMJs görüntüsü) karın segmentlerinin 4 NMJ kas ve toplamak uygun yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak görüntüler.
  3. Helene 633 nm lazer HRP:647 (ile uzun geçiren Filtre > 635 nm) ve FM1-43 (bant filtre 530-600 nm ile) heyecanlandırmak için bir Argon 488 nm lazer heyecanlandırmak için kullanın.
  4. Operasyonel en iyi kazanç ve her iki kanal için uzaklığını belirler.
    Not: Bu ayarlar deneme geri kalanı sabit kalır.
  5. Bir confocal Z-yığınında alt sinaptik terminal kısmındaki için tüm seçili NMJ HRP işaretli üst alır.
  6. Dikkatli yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya sonra boşaltma için tam olarak aynı NMJ aşırı sağlamak için dikkat edin.

4. yüksek [K+] stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. CA2 +değiştirmek-sürücü depolarizasyon için yüksek [K+] serum (olmadan FM1-43 boya) ücretsiz serum SV ekzositozu ve boya yayın.
  2. Hemen bir dijital zamanlayıcı önceden belirlenmiş yüksek [K+] stimülasyon dönemi süresince başlatmak (Örn., 2 dk; Şekil 2).
  3. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hemen yüksek [K+] salin kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-SV durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  4. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) yüksek [K+] salin tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  5. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  6. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü emin olun.

5. seçenek 2: Elektriksel stimülasyon FM boya yükleme

  1. Emme bir pipet gerekli konik elde edilir ve boyutu ipucu elektrot çektirme (Tablo reçetesi) kullanarak hazırlayın.
  2. Yangın-elektrot uç bir mikro-forge ile tek bir motor sinir ile sıkı bir uyum kadar sucked kadar Lehçe.
  3. Bir micromanipulator üzerinde emme pipet Elektrot tutucu üzerine kaydırın ve uzun esnek plastik tüp ve bir şırınga ekleyin.
  4. Uyarıcı parametreleri belirleme (Örn., 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve zaman 5 dk (Şekil 2) ya da 1 dk (Şekil 3)).
  5. Ca2 +değiştirmek-FM1-43 serum fizyolojik (4 µM; 1 mM CaCl2) Elektrofizyoloji sondaj platformu üzerinde yukarıda ile hazırlık larva üzerinde ücretsiz salin.
  6. Hazırlık mikroskop sahneye koymak ve larva ve emme pipet (40 X su-daldırma amaç) odakta olana aşaması yükseltmek.
  7. Kesim motor sinir emme elektrot şırınga tarafından oluşturulan olumsuz hava basıncı ile seçilen hemisegment innerve bir döngü kadar emmek.
  8. Seçili hemisegment kas kasılması için görsel olarak izleme sırasında stimülasyon kısa bir patlama ile emme elektrot işlevi sınayın.
  9. SV endositoz sürmeyi seçme parameters (adım 5,4) ve FM1-43 boya alımı (Şekil 2) kullanarak motor sinir uyarmak.
  10. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-FM1-43 boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için ücretsiz serum (5 x 1 dk. için).
  11. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-yukarıdan confocal görüntüleme protokolü kullanarak anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  12. Yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya boşaltma sonra tam aynı NMJ erişim sağlamak için dikkatli dikkat edin.

6. elektriksel stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. Ca2 +değiştirmek-ücretsiz (olmadan FM1-43 boya) normal serum fizyolojik serum ve hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat sahnesinde yerini.
  2. Boşaltma için uyarıcı parametrelerini ayarlayın (Örneğin, 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve saati 2 dk (Şekil 2) veya 20 s (Şekil 3)).
  3. Aynı motor sinir yukarıdaki gibi aynı elektrot içine emmek ve SV ekzositozu ve FM1-43 boya yayın etkinleştirmek için teşvik etmek.
  4. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) dış boya tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  5. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  6. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü için emin olun.

7. seçenek 3: Channelrhodopsin stimülasyon FM boya yükleme

  1. ChR2 ifade larva ChR2 ortak faktör all-trans retinal (içinde çözünmüş etanol; 100 µM son konsantrasyonu) içeren gıda yükseltmek.
  2. Larva hazırlık Pleksiglas odasında kamera bağlantı noktası ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop sahne üzerine yerleştirin.
  3. Mavi LED eklemek (470 nm; Tablo malzeme) programlanabilir bir uyarıcı bir koaksiyel kablo kullanarak ve LED Kamera bağlantı noktasına yerleştirin.
  4. Mavi LED ışık ışını mikroskobu Yakınlaştır işlevini kullanarak disseke larva işlevi üzerine odaklanır.
  5. Ca2 +değiştirmek-ücretsiz salin ile optogenetic sahnede larva hazırlık FM1-43 serum (4 µM; 1 mM CaCl2) yukarıda üzerinde.
  6. Uyarıcı (Örneğin, 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve 5 dk (Şekil 2) zaman) kullanarak LED parametrelerini ayarlayın.
  7. Işık stimülasyon başlatmak ve optogenetic stimülasyon dönemi (Örneğin, 5 min; önceden belirlenmiş süresi için bir zamanlayıcı ile izlemek Şekil 2).
  8. Zamanlayıcıyı sona erdiğinde, hızlı bir şekilde FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-ZF durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  9. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-FM boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için ücretsiz serum (5 x 1 dk. için).
  10. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-yukarıdan görüntüleme iletişim kuralını kullanarak confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  11. Yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya boşaltma sonra tam aynı NMJ erişim sağlamak için dikkatli dikkat edin.

8. Channelrhodopsin stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. CA2 +değiştirmek-kamera bağlantı noktasını LED ile diseksiyon mikroskop sahnede (olmadan FM1-43 boya) normal salin ücretsiz serum larva üzerinde duruldu.
  2. Boşaltma (örn., 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve 2 dk (Şekil 2) zaman) yönelik uyarıcı parametreleri ayarlayın.
  3. Işık stimülasyon başlatmak ve optogenetic stimülasyon dönemi önceden belirlenmiş süresi için bir zamanlayıcı ile takip (Örneğin, 2 dk; Şekil 2).
  4. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hızlı bir şekilde FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-ZF durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  5. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) dış boya tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  6. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  7. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü için emin olun.

9. floresans miktar

  1. Resim içinde resim J (NIH açık kaynak) yüklemek ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü tıklatarak oluşturun | Yığınlar | Z proje.
  2. Kullanma belgili tanımlık anti-HRP:647 kanal, görüntüye git | Ayarlamak | Eşik ve slayt sadece NMJ vurgulanana kadar üst araç çubuğu.
  3. Değnek aracını kullanarak, NMJ üzerinde tıklatın. NMJ kesintili ise, ÜST KRKT tuşunu basılı tutun ve tüm parçaları seçin.
  4. Görüntü FM1-43 boya kanal değiştirmek ve Çözümle'git | Floresans ölçü elde etmek için ölçü birimi.
  5. (Tespit kesimi, yan ve kas) aynı NMJ adımlardan 9.1-9,4 "boş" görüntü için tekrarlayın.
  6. Boş boya yüzdesini elde etmek için boş/dolu floresans yoğunluklarını oranı almak.
    Not: Bu yordam floresan "oval" veya "serbest" seçim araçlarını kullanarak bouton başına bouton olarak analiz etmek için değiştirilebilir. Arka plan floresans kas floresans örnekleme tarafından çıkarılır. Ajanlar da bu arka plan azaltmak için eklenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 Protokolü Imaging etkinlik bağımlı FM boya için iş akışı gösterilmektedir. Deney her zaman daha sonra kullanılan stimülasyon yöntemi ne olursa olsun aynı larva tutkal diseksiyon ile başlıyor. Şekil 1a bir disseke larva, şematik ventral sinir kablosu (VNC), sinirler ve tekrarlanan hemisegmental kas desen yayılan bir şey. VNC kaldırılır ve hazırlık FM1-43 (Şekil 1b, pembe) 4 µM çözeltilerine boğulmuş. Hazırlık sonra FM boya boya etkinlik bağımlı SV endositoz (Şekil 1cI-III) üzerinden yüklemek için üç olası seçeneklerden birini kullanarak huzurunda uyarılır. Sonra FM boya Bisiklete binme tutuklandı Ca2 +kullanarak-ücretsiz serum ve FM boya ile yüklenen belirli bir NMJ terminal yansıma kullanarak confocal mikroskop ("yüklenen görüntü"; Şekil 1 d). Bu durumda, 4 NMJ sinir, NMJ terminal dallanma ve FM şematik gösteren yerleşim ile seçilir kas sinaptik boutons dolu. Sinaptik hazırlık SV ekzositozu ve FM1-43 yayın (Şekil 1e) sürücü için yukarıda ama FM boya yokluğunda seçili aynı yöntemi kullanarak ikinci kez için uyarılır. Aynı NMJ tespit (Bu örnekte 4 NMJ kas) sonra HRP:647 sinaptik etiket ve kalan FM1-43 vezikül sinyal ("boş görüntü"; kullanarak yeniden yansıma Şekil 1f). Deneyci gücü ve ölçümler bir özel tahlil veya mutant koşul için en iyi duruma getirmek için aşamalardan boşaltma ve yükleme süresini belirler. Floresan yoğunluğu yükleme ve boşaltma (Şekil 1 d, 1f) sonra sayılabilir, sinaptik boya endositoz, ekzositozu ve yüzdesini ölçümler elde etmek için serbest FM boya yüklü. Analizler tüm NMJ veya tek boutons için yapılabilir.

FM boya Bisiklete binme uyarılmış üç şekilde: 1) yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon tüm hazırlık, motor sinir uyarılması 2) emme elektrot veya 3) hafif tahrik aktivasyon hedeflenen channelrhodopsin (ChR2; Şekil 2). Bir doğrudan yan yana karşılaştırma için tüm üç yöntemden, 5 min FM1-43 (yükleme) huzurunda ve sonra FM1-43 (boşaltma) 2 dk yokluğunda her yaklaşım ile uyarılmış ve HRP etiketli NMJs aynı confocal ayarları ( kullanarak yansıma Şekil 2). Larva diseksiyon için iğne yerine tutkal kullandığımız dışında yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon yöntemi yaygın olarak kullanılan FM1-43 Protokolü Drosophila larva NMJ23, izler. Tutkal ile belgili tanımlık mikroskop objektif müdahale önler ve daha hassas vücut duvar gerilimi tayini sağlar ama ılımlı bir öğrenme eğrisi gerektirir. Her üç Yöntem güçlü ve tutarlı floresan sinyallerini NMJ sinaptik bouton ağaç dikme boyunca ve bireysel sinaptik boutons (girintisiyle) içinde üretmek. Yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon Yöntem her nöron hayvan (Şekil 2A, orta) depolarizes FM-larva yüklü olmak tüm NMJs neden olur. Sinir emme elektrot elektriksel stimülasyon yöntemi yalnızca kendisi için karşılık gelen innerve motor sinir olmuştur (Şekil 2B, orta) uyarılmış larva bir tek hemisegment kullanıyor. Aynı hayvan unstimulated segmentlerinde HRP etiket kullanma ayırdedilebilir ama hiçbir gözlemlenebilir floresan boya yükleme içeren ve mükemmel iç kontrol hizmet. Optogenetic ChR2 Yöntemi hedeflenen depolarizasyon istihdam üzerindeki transgenik Gal4 sürücüsü (Şekil 2C) bağımlı üretir. Sürücü bir veziküler glutamat taşıyıcı (vglut) Gal4, Bütün glutamatergic nöronlar dahil tüm glutamatergic motor nöronların mavi ışık stimülasyon ile depolarized bu yüzden buradaydı. Sonuç olarak, tüm NMJs (Şekil 2C, orta) Bu örnekte FM1-43 boya ile yüklenir. Hücre özel sürücüleri belirli NMJs etiket ve diğerleri için bir iç kontrol etiketsiz bırakmak için kullanılabilir.

FM boya boşaltma boya yüklemek için kullanılan aynı yöntemi ile elde edildi. İlk yöntemde, larva hazırlık sadece yüksek [K+] salin yokluğunda hücreleri, sürücü SV ekzositozu, depolarize ve sinaptik terminalleri (Şekil 2A, sağ) boşaltma FM1-43, boğulmuş. Biz genellikle daha kısa bir boşaltma dönem (2 dk) seçin, yani boşaltma kısmi ve terminaller FM kanalı görünür kalır. İşin içinde aynı hemisegment dönen, aynı sinir belirlenmesi ve bu sinir boya boşaltma (Şekil 2B sürmeyi FM1-43 yokluğu yeniden uyarıcı emme elektrot elektriksel stimülasyon boşaltma önemli ölçüde daha zor, çünkü , değil). Boya boşaltma tekrar kısmi unutmayın. ChR2 boşaltma mavi LED aydınlatma kanallarý etkinleþtirmek, motor nöronlar depolarize ve SV ekzositozu boya yayın (Şekil 2C, şu) teşvik FM1-43 yokluğunda hazırlık larva ikinci bir süre gerektirir. Bu zaman ölçeği-boşaltma (2 dk), bunların her biri depolarization yöntemleri boş yüksek [K+] ile yüklenen FM1-43 boya sadece bir yüzdesi en güçlü ve ChR2 boya yayın (Şekil 2) sürüş en zayıf. İçinde yayımlanmış aralığı (20-1000 µW/mm2)24,25,26olan kullanılan LED ışık yoğunluğunu (140 µW/mm2), şiddetindeydi. ChR2 sonuna kadar 50-200 mW ışık kaynakları, ~ 1 mW aydınlatma tarafından ChR2 etkinliği de larva27,28için beslenen ATR konsantrasyon bağımlı ile etkinleştirilir. Böylece, ChR2 stimülasyon gücü manipüle edilebilir. Ayrıca, ilişki diğer stimülasyon güçlü, zaman ölçeği veya genotip ile gerçek kalabilir değil. Deneyci SV endositoz azalmış bir mutant ile çalışma veya olağandışı ekzositozu hızlı, stimülasyon parametreleri gözlemlenebilir bir sinyal boşaltma sonra korumak için değiştirilmesi gerekebilir. Anti-HRP etiket bir FM sinyal tam yokluğunda bile NMJ tanımlamak izin verir, ancak bu miktar için ideal değildir. Prensip olarak, boşaltma stimülasyon da yükleme stimülasyon üzerinden farklı türde olabilir.

Biz son zamanlarda salgılanan sinaptik deacylase Notum etkisi elektriksel stimülasyon4kullanarak SV döngüsü kaybı inceledik. Burada, biz 1) yüksek [K+] depolarizasyon ve 2) emme elektrot motor sinir stimülasyonu Yöntemleri (Şekil 3) karşılaştırmak için bu analiz uzatmak. Biz hem yöntemleri benzer bir sonuç vermek, gösteren bir Notum null mutant yükleme FM1-43 boya azaltılmış bulmak; Ancak, fenotip derecesini iki yöntem arasında farklıdır. Beş dakika için yüksek [K+] salin ile depolarizasyon sonra işte yüklü floresan yoğunluğu genetik arka plan denetimi (w1118) arasında büyük bir düşüş ile yüksek düzeyleri ve Notum null mutantlar (NotumKO ) düzeyi düşük (Şekil 3A, üst). Quantified ölçümlerde normalleştirilmiş FM floresan yoğunluğu HRP özetlenen NMJ terminalleri içinde Notum (w1118 1.0 ± 0,05 NotumKO 0,57 ± 0,07 vs; n≥13, p yokluğunda önemli ölçüde azalır < 0.0001; Şekil 3B). 1 dk. 20 Hz, elektriksel stimülasyon sonra biz bütün NMJ Floresan (w1118 1.0 ± 0,05 NotumKO vs. miktarının ne zaman yüklenen FM1-43 Yoğunluk kontrolleri ve Notum boş değerlere arasında önemsiz bir azalma bulmak 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Şekil 3A, B). Ne zaman boya birleşme bouton başına bouton olarak ölçme, yöntemlerin her ikisi de ile yüklenen boya önemli bir azalma bul. Stimülasyon yüksek [K+] salin ile sonra quantified ölçümlerde normalleştirilmiş FM floresan yoğunluğu bouton başına önemli ölçüde azalır (w1118 1.0 ± 0,02 NotumKO 0,52 ± 0,02 vs; n≥241, p< 0.0001; Şekil 3 c). Elektriksel stimülasyon sonra normalleştirilmiş floresan yoğunluğu bouton başına de önemli ölçüde, daha düşük bir ölçüde de olsa azalır (w1118 1.0 ± 0,02 NotumKO 0.83 ± 0,02 vs; n≥127, p< 0,0001; Şekil 3 c).

İki stimülasyon paradigmalar sonuç farklılıkları bir dizi faktöre nedeniyle olabilir. İlk olarak, stimülasyon gücü daha fazla olduğu tahmin edilmektedir elektrik motor sinir stimülasyonu için karşılaştırıldığında yüksek [K+]. Elektrofizyoloji kayıtları huzurunda yüksek [K+] salin mümkün değil ama kas kasılmaları güçlü ve 5 min banyo süresi boyunca sürekli olarak larva neuromusculature açıkça sağlam, uyarılır. Ancak, gücü ve stimülasyon sıklığını bilmiyoruz. Buna ek olarak, elektriksel stimülasyon çok daha tam gerilim gücü ve stimülasyon sıklığını seçme Kullanıcı ile kontrol edilir. İkinci olarak, stimülasyon süresi daha uzun elektriksel sinir stimülasyonu (Şekil 3) karşılaştırıldığında yüksek [K+]. 1 dk. 20 Hz elektrik stimülasyon tekrarlanan denemeler sonra seçtik. Boya yükleme 1 dakika sonra vardı güçlü ve güvenilir FM1-43 sinyal stimülasyon 5 dk daha da güçlü bir floresan sinyal (Şekil 2) verdi rağmen biz bizim çalışma4için Bu paradigma seçti. Böylece, stimülasyon paradigma uzunluğu büyük olasılıkla FM1-43 yükleme yüksek [K+] ve elektriksel stimülasyon (Şekil 3B, C) arasında büyüklüğü değişkenlik katkıda bulunmaktadır. Yüksek [K+] yöntemi daha sağlam bir fenotip Notum mutantlar için olsa da, biz hala nedeniyle büyük kontrolü4elektrik yöntemi kullanılır. Gücü, sıklığı ve süresi, stimülasyon gibi kontrol etmek için birçok parametre vardır ve bu ayarları temel alınarak mutant soru karar vermesi ve gerekir. Örneğin, stimülasyon yöntemi seçimi üzerinde SV sorguya havuzu7 bağlı olabilir ve faaliyet bağımlı mekanizma10araştırıldı.

FM1-43 sonra NMJ bilgisayara yükleme, bir elektron mikroskobu (Şekil 4) elektron yoğun sinyali üretmek için floresans boya photoconversion istihdam edebilirsiniz. Bu yöntemde, boya yüklü hazırlık diaminobenzidine (DAB), reaktif oksijen türleri üzerinden bir karanlık çökelti (Şekil 4A)11oluşturmak için DAB oksitleyici FM boya ile huzurunda yoğun floresan ışık maruz kalmaktadır. Lütfen tüm ayrıntılar12boyaları styryl photoconversion Aman Tanrım makalesine bakın. SV döngüsü tabii ile statik elektron mikroskobu görüntülemede tutuklandı bu yöntemin yararı SVs açıkça ultrastructural bir düzeyde ortaya olsa da. Stimülasyon yokluğunda, Drosophila NMJ, sinaptik boutons yoğun veziküller ile yüklenir (~ 40 nm çapında; Şekil 4B), genişlemiş organelleri nadir görülmesi ile (>100 nm çapında) olduğu tahmin Bisiklete binme endosomes olmak. Kuvvetle stimülasyon depolarize yüksek [K+] serum bu profili, SV nüfus kısmi tükenmesi ve çok sayıda genişlemiş organelleri hızlı birikimi ile değiştirir (>100 nm çapında) düşündüm toplu türetmek endositoz plazma zarı (Şekil 4 c, sol). Unstimulated denetimleri benzer bölmeler mevcut olmasına rağmen bu organelleri yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon sonra yüksek yoğunluklu bu fizyolojik olmayan bir yanıt olabilir endişe yükseltir. Motor sinir emme elektrot elektriksel stimülasyon SV nüfus tüketen nispeten daha etkilidir ve genişlemiş endosomal veziküller (Şekil 4 d, sol) daha fazla üretmek değildir. Bu yüksek [K+] depolarizasyon tarafından tahrik toplu endositoz SV popülasyon daha yoğun talep sırasında korumaya yardımcı olur göstermektedir.

FM1-43 photoconversion sinaptik ultrastructure istirahat bouton (Şekil 4) göre karşılaştırmak için yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon veya motor sinir emme elektrot elektrik stimülasyon kullanılarak gerçekleştirilebilir. Stimülasyon, bireysel SVs ve genişlemiş veziküller depolarize yüksek [K+] (>100 nm çapında) elektron yoğun DAB acele aşağıdaki ışık tahrik photoconversion ile (Şekil 4 c, sağ) etiketli. Bilinmeyen nedenlerden dolayı genişlemiş vezikül membran genellikle daha az yoğun daha küçük SV membran etiketli. Ayrıca, SVs kez DAB çökelti ile dolu görünür yerine sadece membran, ama bu does yapmak onları etiketlenmemiş veziküller ayırt etmek çok daha kolay. Motor sinir emme elektrot uyarılması ile Bisiklete binme SV nüfus etiketlenmemiş SVs (Şekil 4 d, sağ) göreli olarak işaretlenebilir. Elektriksel stimülasyon ile veziküller genişlemiş (>100 nm çapında) detectably boutons ve tertibatın zarı, sürekli olarak, oluşan değil endosomes değil FM1-43 photoconversion tarafından etiketlenir. Olarak yukarıda, Bisiklet SVs genellikle DAB biraz yaparak bir moda acele ve bu nedenle daha kolay ayırt gelen stimülasyon (Şekil 4 d, sağ) sırasında biçimi değil SVs doldurulur. Henüz ChR2 stimülasyon takip photoconversion çalıştılar değil. Stimülasyon farklı zaman derslerin ile FM1-43 boya photoconversion bir SVs nereye kurulur, nasıl SVs ticareti ve zamanlama sinaptik bouton içinde farklı kayma havuzları arasında hareketinin belirlemek izin verir. Yüksek [K+] ve sinir stimülasyonu karşılaştırılması diseksiyon toplu ve tek SV endositoz mekanizmaları sağlar.

Figure 1
Resim 1: Akış çizelgesi Protokolü Drosophila NMJ, yükleme FM1-43 boya. Larva tutkal diseksiyon bir düzleştirilmiş neuromusculature hazırlık üretir, ventral sinir kablosu (VNC) ile gelen bir segmental ventral orta hat (Vm) hemisegmentally için sinirleri projelendirme vücut duvar tekrarlanan kas diziler (adım bir). VNC ücretsiz kesilir ve tüm larva diseksiyon sonra stimülasyon (adım b) için hazırlık pembe FM1-43 çözüm (4 µM) içinde inkübe. FM1-43 daha sonra seçili stimülasyon paradigma (adım 3); ile yüklenir Bütün larva (CI) yüksek [K+] depolarizasyon seçenekleri ile tek motor sinir (CII) elektrot uyarılması veya ışık tahrik aktivasyon yüksek oranda hedeflenen channelrhodopsin (cIII) emme. FM1-43 birleşme tutuklandı Ca2 +kullanarak-ücretsiz serum ve boya yüklü NMJ görüntüsü (adım d). İkinci bir stimülasyon sonra boya sinaptik vezikül ekzositozu (adım e) sürücü için banyoda FM1-43 yapılır. Aynı NMJ sonra bellekten sinaptik terminal (adım f) tahlil için yeniden yansıma. Floresan yoğunluğu SV endositoz ve SV ekzositozu düzeylerini ölçmek için yüklü ve yüksüz NMJs ölçülür. Alt paneli inşaat parametreleri ve bu çalışmalar için kullanılan şeffaf akrilik odası için boyutları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: FM boya yükleme ve boşaltma tüm stimülasyon yöntemlerinin karşılaştırılması. Karşılaştırma FM1-43 boya yükleme ve 1) yüksek [K+] depolarizasyon bütün larva hazırlık (üst), ile dolaşıp üçüncü INSTAR NMJ boşaltma 2) elektrot elektriksel stimülasyon motor sinir (orta), emiş ve 3) ışık kaynaklı sadece motor nöronlar (alt) içinde hedeflenen channelrhodopsin (ChR2) etkinleştirme. (A) larva NMJ etiketli ile anti-HRP:647 presynaptic membran marker (mavi, sol), 5 min (orta) için yüksek [K+] depolarizasyon üzerinden FM1-43 ile yüklenen ve yüksek [K+] depolarizasyon 2 dk. (B) ile boş Emme elektrot elektriksel sinir stimülasyonu ile yükleme ve boşaltma her iki FM1-43 boya aynı uyaranlara süre ile karşılaştırma. (C) hedef vglut-Gal4>motor nöronlar ile mavi aktif ifadede UAS-ChR2-H134R (470 nm) yükleme ve boşaltma FM1-43 boya aynı uyaranlara süreler için ışık. Yıldız daha yüksek büyütme boutons görüntüleme insets bakın. 10 ölçek çubuğu olduğunu µm, iç metin sinaptik boutons ile genişlemiş 3.5 X ana pano üzerinden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Notum null mutantlar sinaptik boutons yükleme azaltılmış FM boya göster. FM1-43 göçebe sinaptik terminalleri yüklenen üçüncü Notum null mutantlar (NotumKO) genetik kontrol (w1118) karşılaştırma NMJ biçim. (A) NMJ boutons yüksek [K+] depolarizasyon bütün larva hazırlık (üst) veya bir motor sinir (alt) w1118 (solda) ve NotumKO (sağda) emme elektrot uyarılması ile etiketlenmiş. (B) Quantified FM1-43 floresans NMJ başına yüksek [K+] depolarizasyon ve emme elektrot stimülasyon w1118 denetimlerde NotumKO mutantlar vs karşılaştırma dağılım çizim olarak yüklendi. (C) Quantified bouton başına bouton olarak floresans yüksek [K+] depolarizasyon ve emme elektrot stimülasyon w1118 denetimlerde NotumKO vs Karşılaştırma kutusunu ve bıyık Arsa olarak yüklü . Öğrencinin iki kuyruklu t-testleri her karşılaştırma için p-grafikler üzerinde görüntülenen değerleri ile gerçekleştirilmiştir. Çubukları prizma (Windows için sürüm 7.0) ile yapılan ortalama ± SEM gösterir. Elektriksel stimülasyon veri Köpke ve arkizniyle adapte edilmiş., geliştirme 144 (19): 3499-510, 2017. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: veziküller işaretlemek için FM boya photoconversion ile sinaptik ultrastructure. Floresan FM1-43 photoconverted oksitlenmiş diaminobenzidine (DAB) elektron yoğun çökelti transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirme için için olabilir. (A) A etkinlik bağımlı FM1-43 boya yükleme. takip Drosophila NMJ etiketlemek için photoconversion yönteminin Şematik diyagramı Wildtype sinaptik bouton dinlenme (unstimulated), (B) temsilcisi TEM görüntüsü. Bu photoconversion (solda) olmadan 5 min için yüksek [K+] tuzlu depolarizasyon veya FM1-43 photoconversion (sağda) ile uyarılmış üniforma ölçekli SVs. (C) sinaptik boutons fazla yoğun nüfusu unutmayın. Etiketli ve etiketsiz toplu endosomal yapıları, varlığını unutmayın. Bir sinir elektriksel olarak uyarılmış (D) sinaptik boutons hiçbir photoconversion (sol) veya FM1-43 photoconversion (sağda) ile 20 Hz, elektrot 5 min için emiş. Boya yüklü veziküller bitişik boş veziküller çok daha koyu göründüğüne dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yüksek [K+] serum fizyolojik uyarılma depolarize tarafından çok aktivite bağımlı FM boya Bisiklete binme ama büyük olasılıkla az fizyolojik29için üç seçenek en kolay yoldur. Bu basit yöntem tüm hayvan erişilebilir her hücrede depolarizes ve bu yüzden yönlendirilmiş çalışmalar izin vermez. Yerel olarak bir micropipette yüksek [K+] serum uygulamak mümkün olabilir, ama bu hala pre/postsinaptik hücre ve büyük olasılıkla synapse ilişkili glia1depolarize. Başka bir büyük sorundur bu yüksek [K+] depolarizasyon sürücüler hızlı oluşumu içinde unstimulated boutons nadiren görülür toplu endosomes. Ancak, toplu endosome oluşumu gösteren gerçek fizyolojik bir süreç mutasyonlar29tarafından bloke etkin bir mekanizmadır. Böylece, yüksek [K+] depolarizasyon ile FM1-43 görüntülemede seçerek toplu endositoz sinapslarda, çalışma için kullanılabilir. Motor sinir emme elektrot elektrik stimülasyon çok daha kontrollü bir yöntemdir. Sadece bir tek axon bohça uyarılır ve sadece presynaptic termini doğrudan depolarized avantajı vardır (Tabii ki, kas lif sonra verici eylem tarafından depolarized). Bu nedenle NMJs büyük bir iç kontrol değil uyarılır aynı hayvan sağlar. Bu yöntem bir stimülasyon parametreleri doğrudan karşılaştırma Elektrofizyoloji kayıtları4etkinleştirme yüksek [K+] stimülasyon yöntemi, aksine sıkı bir şekilde denetlemesi izin verir. Ancak, bu teknik özel ekipman ve teknik beceri oldukça yüksek düzeyde gerektirir ve bu nedenle daha az erişilemez. Işık tahrik aktivasyonu hedeflenen channelrhodopsin (ChR2) seçme nöronlar30hedefleme avantajına sahiptir. Bu yöntem Elektrofizyoloji yöntemleri ile yok aşinalık gerektirir ve herhangi bir laboratuvarda çok ucuz ekipman ile yapılabilir, ama bu yaklaşım Drosophila genetik temel olarak bilindiğini gerektirir.

Stimülasyon parametreleri seçimi son derece değişken fenotipleri1genetik koşullar bir dizi içinde sorgulanan SV döngüsü dynamics test etmek için kritik öneme sahip. Tüm yöntemleri için kullanılan dış [Ca2 +] SV itici gücü kontrol bir anahtar parametresidir Bisiklete binme. Yüksek [K+] stimülasyon yöntemi ile [K+] önemli bir seçimdir kullanılıp, hangi depolarizasyon gücü derecesini belirler. Drosophila haemolymph ölçümleri bir [K+] 5 mm belirtmek ve 90 mM, genellikle en sık aktivite stimülasyon3,7,15,17 için seçili konsantrasyon. , 31. ancak, 30-90 mM [K+] aralığından stimülasyon gücü5,16,32çeşitlendirmek için istihdam. Başka bir kritik parametre kararı her iki FM1-yükleme ve boşaltma 43 için yüksek [K+] stimülasyon uzunluğudur. Yükleme için olup tüm Bisiklete binme SV nüfus etkili yüklendiğinde veya yalnızca bir alt kümesini etkin veziküller7belirler. Benzer şekilde hangi ortaya çıkarmak ya da mutant fenotipleri oranına bağlı karanlık ekzositozu stimülasyon döneminde geçiyor SVs yüzdesi frekans2Bisiklete binme SV içinde değiştirir dikte boşaltma süresi. Emme elektrot elektrik motor sinir stimülasyonu ile parametre seçimleri de stimülasyon voltaj, frekans, süresi ve nabız aralığı içerir. Geçici desenli dynamics7Bisiklete binme SV önemli bir belirleyici bir faaliyettir ve farklı stimülasyon desenleri seçerek farklı SV havuzları seferber. Hedeflenen ışık tahrik ChR2 harekete geçirmek ile seçenek tüm yukarıda (ışık şiddeti değişkenlerle) içerir ve ek transgenik seçenekleri bölümünde ele sonraki bölüm. Bu parametre ile seçimler daha deneysel kontrol değil, aynı zamanda artan teknik karmaşıklık gelir.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) mono - ve divalent katyonlar33geçirgen bir zar ışık-gated kanalıdır. ChR2 uyarım seçtiyseniz, Gal4 sürücü, UAS-ChR2 yapı ve ışık kaynağı değişkenleri için Kanal harekete geçirmek dahil edilmek için birçok seçenek vardır. Gal4 sürücüler arasında değişir her yerde çok özel. Örneğin, her yerde UH1-Gal4 (daughterless) CcapR-Gal4 (Janelia) ChR2 içinde kas sürücüler ise her hücresinde, ChR2 ifade 6/7 NMJ ama kas 4 NMJ3431,değil. Bu seçicilik güçlü iç kontrol kullanılabilir. Aynı şekilde ChR2-H134R (kullanılan burada; mutasyona uğramış kalıntısı nedenler artan photocurrents)35, VChR1, Şef ve çok daha fazla36da dahil olmak üzere birçok UAS-ChR2 türevleri vardır. Her biri bu kanal çeşitleri geçişi, gürültülerinden, iyon seçicilik, kinetik ve duyarsızlaştırma ışığın farklı özellikleri vardır. Not bazı yapıları ile FM görüntülemede engelleyebilir bir floresan etiketi içerir. Örneğin, UAS-ChR2-H134R burada kullanılan mCherry ile etiketlenir (ex: 587 nm, em: 610 nm), detectible emisyon FM1-43 ile üretmek değildir ama (ex: 479 nm, em: 598 nm) filtreleri görüntüleme. Teknik parametre seçenek ışık kaynağı, dalga boyu ve yoğunluk Kanal harekete geçirmek için içerir. Burada kullanılan bir seçenek bir ucuz mavi yayan LED, görsel olarak kas kasılmaları raporlaması tarafından teyit stimülasyon ile. Biz de ChR2 aktive başarılı bir tarama confocal lazer yeterli olmamasına rağmen epifluorescence, kullanarak. Epifluorescence hedeflenen stimülasyon (tüm hayvan yerine belirli kesimleri) kullanılabilir, ancak kadar basit bir uyarıcı kolayca bağlı-LED ışık sıklığı ve süresi değiştirir, ancak stimülasyon parametrelerini kontrol etmek zor Bakliyat. LED ışık diseksiyon mikroskop kamera bağlantı noktası üzerinden odaklanarak daha kontrollü, yoğun ışık stimülasyon sağlar.

Ventral sinir kablosu/beyin stimülasyonu paradigma sırasında olduğu gibi bırakmak karar deneyci kalmıştır. Burada kullanılan üç yöntemlerinin karşılaştırılması için tüm merkezi sinir sistemi kaldırmak için seçtim, ancak bazen ters yönde kablolama olduğu gibi15bırakılır. Sinir sisteminin tüm kalan her endojen sinirsel aktivite gerçekleşir bir komplikasyondur. Bu etkinlik derecesini çok hayvandan hayvana, büyük ölçüde bağımlı deneyci diseksiyon uzmanlık değişken. Bu değişken etkinlik yüklenen ve boş, FM1-43 boya miktarı da bu nedenle eksojen stimülasyon istihdam15' e sadece nedeniyle değil katkıda bulunabilir. Bir ilgili teknik sağlam disseke larva kurgusal hareket kas sözleşme ve bu deplasman büyük ölçüde NMJ görüntüleme ile müdahale komplikasyondur. Bu hareket merkezi sinir sistemi kaldırılırsa ve aynı zamanda Ca2 +uygulanması yoluyla hafifletti-4görüntüleme sırasında ücretsiz salin. Burada kullanılan bu yaklaşımlar NMJ hazırlanmasında Imaging mükemmel FM1-43 boya etkinleştirmek yeterlidir. Ancak, bazı Denemecileri kas kasılması (Örneğin, ryanodine, philanthotoxin-433) inhibe veya Aksiyon potansiyeli blokerleri (Örneğin, Tetradotoksin)37,38kullanmak için uyuşturucu eklemek için seçin. Uyuşturucu aralığı seçerek belirli adımları vurgulamak veya neurotransmission mekanizmaları incelemek için mutant fenotipleri vurgulamak için SV döngüsü işlemek için kullanılabilir. Örneğin, bazı Denemecileri (etkinleştirir voltaj Na+ kanalları39) Veratridine SV SV endositoz, geliştirmek için rezerv havuzu, Cyclosporin A (inhibe kalsinörin etkinlik40) yükleme artırmak için istihdam ve (Sinaptik iletimi42artırır gozlemler cyclase41, etkinleştirir) Forskolin exo/endo Bisiklete binme havuzu7,43,44artırmak için. Bu tür farmakolojik manipülasyonlar ek anlayışlar sağlayabilir. Son olarak, FM1-43 arka plan etkinliği ve stimülasyon Protokolü yıkama diseksiyon, kalitesine göre değişen derecelerde oluşabilir. Bazı β-cyclodextrin Advasep-745ya da nonspesifik floresans gidermek ve sinyal arka plan oranı artırmak için sulu fluorophore sulforhodamine46, sulfobutylated türevi ekleyin.

FM Imaging floresan SV döngüsü (Örneğin, Elektrofizyoloji, synaptopHluorin, elektron mikroskobu) daha fazla anlayış için eşlik edebilir çeşitli teknikler vardır. İşte ZF araştırmak için kullanılan FM floresan photoconversion gösterildiği bir örnek ultrastructural ayrıntılı olarak geçiş yapın. SVs dağınık şekilde ve işlevsel olarak ayrı2birkaç havuzunun düzenlenir. Hemen akut stimülasyon serbest veziküller kolayca derledi Havuzu (RRP) içerir. Daha büyük bir geri dönüşüm havuzu SV yayın orta etkinliğinin koşullar altında tutar. Bir iç rezerv havuzu (RP) sadece (görünüşte yakınındaki fizyolojik olmayan) güçlü stimülasyon2ile oluşturulmuştur. Aktif hale gelir SV havuzları kullanılan stimülasyon47türüne göre değişir ve FM photoconversion kullanarak Drosophila NMJ gelen raporlar bu farklı SV havuzları48kayma ve fonksiyonel özellikleri içine anahtar anlayışlar ortaya koymuştur. FM photoconversion SV havuzları altında farklı stimülasyon paradigmaları ve sorgu sorular endosomes ve SVs49arasında uzun tartışılan kaçakçılığı etkileşim gibi aktif çalışma için kullanılabilir. Deneyci FM görüntülemede synapse sırasında diğer faaliyet bağımlı değişiklikleri ile birlikte ilgi ise, FM1-43 boya (FM1-43FX) bildirildi tamir edilebilir bir analog vardır. Bu sonda Drosophila NMJ yükleme etkinliği bağımlı boya sonra düzeltmek izin ve ardından korelasyon bouton faaliyet düzeyi (FM boya floresan) ve faaliyet bağımlı ifade arasında sınamak için antikor etiketleme ile takip etmek bir protein ilgi. Gelecekte, bu son derece FM boya kombinasyonu sağlayabilir ek yöntemler keşfetmek için faydalı olabilir güzel Drosophila NMJ modeli sinaps, diğer görüntüleme yaklaşımlarla görüntüleme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Acknowledgments

Broadie laboratuvar Üyeler bu makalede katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser NIH R01s MH096832 ve MH084989 b. için tarafından desteklenen ve NIH HGUGM dostluk F31 MH111144 D.L.K. için

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Neuroscience nöromüsküler kavşak sorunu 135 DrosophilaFM1-43 Elektrofizyoloji photoconversion transmisyon elektron mikroskobu
FM sinaps Bisiklete binme boya: yüksek potasyum depolarizasyon, elektrik ve Channelrhodopsin stimülasyon karşılaştırma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter