Hier bespreken we een serie van protocollen voor de inductie en validatie van cellulaire senescentie in gekweekte cellen. Wij richten op verschillende senescentie-inducerende prikkels en de kwantificering van gemeenschappelijke senescentie-geassocieerde markers te beschrijven. Wij bieden technische details met behulp van fibroblasten als een model, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan verschillende cellulaire modellen.
Cellulaire senescentie is een staat van permanente celcyclus arrestatie geactiveerd in reactie op andere schadelijke stimuli. Activering van cellulaire senescentie is een kenmerk van verschillende pathofysiologische omstandigheden waaronder tumor onderdrukking, weefsel remodeling en veroudering. De inductoren van cellulaire senescentie in vivo worden nog steeds slecht gekenmerkt. Een aantal stimuli kan echter worden gebruikt ter bevordering van cellulaire senescentie ex vivo. Onder hen zijn de meest voorkomende senescentie-inductoren Dr. uitputting, ioniserende en niet-ioniserende straling, genotoxische drugs, oxidatieve stress, demethylating en acetylerend agenten. Hier, zullen we geen gedetailleerde instructies over het gebruik van deze prikkels voor het opwekken van fibroblasten in senescentie. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor verschillende soorten primaire cellen en cellijnen, met inbegrip van kankercellen. Ook beschrijven we de verschillende methoden voor de validatie van senescentie inductie. In het bijzonder richten we ons op het meten van de activiteit van de lysosomale enzym senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), het tempo van de DNA synthese met behulp van de 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) opneming assay, de niveaus van meningsuiting van de celcyclus remmers p16 en p21, en de expressie en secretie van leden van de Senescence-Associated secretoire fenotype (SASP). Tot slot, wij bieden voorbeeld resultaten en toepassingen van deze protocollen verder te bespreken.
In 1961, Hayflick en Moorhead gemeld dat primaire fibroblasten in cultuur hun proliferatieve potentieel na opeenvolgende doorgangen1 verliezen. Dit proces wordt veroorzaakt door de sequentiële verkorting van telomeren na elke celdeling. Als telomeren een kritisch korte tijdsduur bereikt heeft, ze worden herkend door de reactie van DNA-schade (DDR) dat een onomkeerbare arrestatie van proliferatie activeert — ook gedefinieerd als Dr. senescentie. Dr. senescentie is momenteel een van de vele prikkels die bekend zijn voor het opwekken van een staat van permanente celcyclus arrestatie maakt cellen ongevoelig mitogenen zowel apoptotic signalen2,3. Het programma senescentie wordt normaal gesproken gekenmerkt door extra functies waaronder lysosomale hoogactieve, mitochondriale dysfunctie, nucleaire veranderingen, herschikkingen van de chromatine, endoplasmatisch reticulum-stress, DNA-schade en een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)3,4. Verouderend cellen hebben meerdere functies in het lichaam: ontwikkeling, wond genezing en tumor onderdrukking2. Ze zijn ook bekend te spelen een belangrijke rol in veroudering en, paradoxaal genoeg, tumor progressie5. De negatieve, en deels tegenstrijdige gevolgen van senescentie worden vaak toegeschreven aan de SASP6.
Onlangs, werd aangetoond dat afschaffing van verouderend cellen uit muizen tot verlenging van de levensduur en tot afschaffing van veel van de veroudering functies7,8,9,10,11, leidt 12. op dezelfde manier, meerdere geneesmiddelen zijn ontwikkeld om op te heffen ofwel verouderend cellen (senolytics) of te richten op de SASP13,14. De therapeutische mogelijkheden van anti-veroudert heeft onlangs trok meer aandacht aan het veld.
De studie van de mechanismen die zijn gekoppeld aan cellulaire senescentie en de screenings voor farmacologische interventies zwaar afhankelijk van ex vivo modellen, met name op de menselijke primaire fibroblasten. Hoewel er sommige gemeenschappelijke functies geactiveerd door uiteenlopende senescentie inductoren, is een grote variabiliteit in het fenotype senescentie waargenomen en afhankelijk van verschillende factoren, waaronder cel type, stimulans en punt3,15, 16,17. Het is noodzakelijk te overwegen de heterogeniteit voor studeren en targeting verouderend cellen. Daarom heeft dit protocol tot doel een aantal methoden die worden gebruikt voor het opwekken van senescentie in primaire fibroblasten met behulp van verschillende behandelingen. Zoals het zal worden verklaard, kunnen de methoden gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypes.
Afgezien van Dr. senescentie, beschrijven we de vijf andere senescentie-inducerende behandelingen: ioniserende straling en ultraviolette (UV) straling, Doxorubicine, oxidatieve stress, epigenetische veranderingen (namelijk bevordering van Histon acetylation of DNA demethylatie) . Zowel, ioniserende straling en UV-straling veroorzaken directe DNA-beschadiging en, in de juiste dosis, trigger senescentie18,19. Doxorubicine ook senescentie voornamelijk door middel van DNA-schade veroorzaakt door het intercalating in het DNA en verstoren topoisomerase II functie en dus stoppen DNA herstellen mechanismen20. De expressie van genen essentieel voor senescentie wordt normaal bestuurd door Histon acetylation en methylation van DNA. Dientengevolge, histone deacetylase remmers (bijvoorbeeldnatrium butyraat en SAHA) en DNA demethylating (bijvoorbeeld 5-aza) agenten leiden tot senescentie in anders normale cellen21,22.
Tot slot, vier van de meest voorkomende markeringen geassocieerd met verouderend cellen zal worden verklaard: activiteit van de senescentie verbonden-β-galactosidase (SA-β-gal), tarief voor DNA-synthese door EdU opneming assay, overexpressie van de celcyclus regelgevers en cycline-afhankelijk kinase remmers p16 en p21, overexpressie en secretie van leden van de SASP.
De protocollen die hier uitgelegd werden geoptimaliseerd voor menselijke primaire fibroblasten, met name de cellen BJ en WI-38. De protocollen voor Dr. senescentie, ioniserende straling en Doxorubicine, zijn met succes toegepast op andere types van fibroblasten (HCA2 en IMR90) en in andere celtypen (namelijk neonatale melanocyten en keratinocyten of iPSC afkomstige cardiomyocytes) in ons laboratorium. Aanpassingen voor extra celtypes kunnen echter worden geoptimaliseerd door enkele details zoals het aantal geplaatste cel…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de leden van de lab Demaria voor vruchtbare discussies, en Thijmen van Vliet voor het delen van gegevens en het protocol betreffende de UV-geïnduceerde senescentie.
DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
TRIS base | Roche | 11814273001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
Tweezers | |||
Needles |