Her diskuterer vi en rekke protokoller for induksjon og validering av mobilnettet senescence i kulturperler celler. Vi fokuserer på ulike senescence-inducing stimuli og beskrive kvantifisering av vanlige senescence-assosiert markører. Vi tilbyr tekniske detaljer med fibroblaster som modell, men protokollene kan tilpasses ulike mobilnettet modeller.
Mobilnettet senescence er en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon aktivert svar på ulike skadelige stimuli. Aktivering av mobilnettet senescence er et kjennetegn på ulike patofysiologiske forhold inkludert svulst undertrykkelse, vev remodeling og aldring. Indusere av mobilnettet senescence i vivo kjennetegnes fortsatt dårlig. En rekke stimuli kan imidlertid brukes til å fremme mobilnettet senescence ex vivo. Blant dem er de vanligste senescence-indusere replicative utmattelse, ioniserende og ikke-ioniserende stråling, gentoksisk narkotika, oksidativt stress, demethylating og acetylerende agenter. Her vil vi gi detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker disse stimuli for å indusere fibroblaster til senescence. Denne protokollen kan lett tilpasses for ulike typer primære celler og linjer, inkludert kreftceller. Vi har også beskriver forskjellige metoder for validering av senescence induksjon. Spesielt fokusere vi på å måle aktiviteten til lysosomale enzymet Senescence-assosiert β-galactosidase (SA-β-gal,) frekvensen av DNA-syntese med 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) inkorporering analysen, nivåer av uttrykket av cellen syklus hemmere p16 og p21, og uttrykket og sekresjon av medlemmene av Senescence-Associated sekretoriske fenotypen (SASP). Endelig vi gi eksempel resultater og diskutere videre programmer av disse protokollene.
I 1961 rapportert Hayflick og Moorhead at primære fibroblaster i kultur miste sitt proliferativ potensial etter påfølgende avsnitt1. Denne prosessen er forårsaket av den sekvensielle forkortelsen av telomeres etter hver celledeling. Når telomeres når en kritisk kort lengde, gjenkjennes de av DNA-skade svar (DDR) som aktiverer en irreversibel arrest spredning-også definert som replicative senescence. Replicative senescence er en av mange stimuli som er kjent for å indusere en tilstand av permanente celle syklus arrestasjon som gjengir cellene ufølsomt både mitogens og apoptotisk signaler2,3. Senescence programmet er vanligvis preget av tilleggsfunksjoner inkludert høy lysosomale aktivitet, mitokondrie dysfunksjon, kjernefysiske endringer, chromatin rearrangements, endoplasmatiske retikulum stress, DNA skade og en senescence-assosiert sekretoriske fenotypen (SASP)3,4. Senescent celler har flere funksjoner i kroppen: utvikling, sår helbredelse og tumor undertrykkelse2. Like, de er kjent for å spille en viktig rolle i aldring og paradoksalt nok i svulst progresjon5. Negativ, og delvis motstridende, effekten av senescence er ofte knyttet til SASP6.
Nylig ble det vist at eliminering av senescent celler fra mus fører livslengden utvidelse og eliminering av mange av aldring funksjoner7,8,9,10,11, 12. er utviklet flere medikamenter på samme måte, å enten fjerne senescent celler (senolytics) eller å målrette de SASP13,14. Anti-aging terapeutiske potensialet har nylig fått mer oppmerksomhet til feltet.
Studiet av mekanismer knyttet til mobilnettet senescence og visninger for farmakologiske intervensjoner avhengig tungt av ex vivo modeller, spesielt på menneskelig primære fibroblaster. Mens det er noen fellestrekk aktivert ved ulike senescence indusere, er en stor variasjon i senescence fenotypen observert og avhengig av forskjellige faktorer, inkludert celle type, stimulans og tid punkt3,15, 16,17. Det er viktig å vurdere heterogenitet for å studere og målretting senescent celler. Derfor mål denne protokollen å gi en rekke metoder for å indusere senescence i primære fibroblaster ved hjelp av ulike behandlinger. Som det vil bli forklart, kan metodene lett tilpasses andre celletyper.
Bortsett fra replicative senescence, beskriver vi fem andre senescence-inducing behandlinger: ioniserende stråling, ultrafiolett (UV) stråling, doksorubicin, oksidativt stress og epigenetic endringer (nemlig markedsføringen av histone acetylation eller DNA demethylation) . Både ioniserende stråling og UV-stråling direkte DNA skade og på riktig dose, utløse senescence18,19. Doksorubicin fører også til senescence hovedsakelig gjennom DNA skade av intercalating i DNA og forstyrre topoisomerase II funksjon og dermed stoppe DNA reparasjon mekanismer20. Uttrykket av gener som er avgjørende for senescence er vanligvis styrt av histone acetylation og DNA metylering. Som en konsekvens, utløse histone deacetylase hemmere (f.eks, natrium butyrate og SAHA) og DNA demethylating (f.eks 5-aza) agenter senescence i andre normale celler21,22.
Til slutt, fire av de vanligste markørene knyttet til senescent celler vil bli forklart: aktiviteten til den senescence tilknyttet-β-galactosidase (SA-β-gal), rate av DNA-syntese av EdU innlemmelse analysen, overuttrykte celle syklus regulatorer og cyclin-avhengige kinase hemmere p16 og p21, og overuttrykte og sekresjon av medlemmene av SASP.
Protokollene forklart her var optimalisert for menneskelig primære fibroblaster, spesielt BJ og WI-38 celler. Protokollene for replicative senescence, ioniserende stråling og doksorubicin, har blitt aktivert for andre typer fibroblaster (HCA2 og IMR90) og i andre celletyper (nemlig neonatal melanocytter og keratinocytter eller iPSC-avledet cardiomyocytes) i vårt laboratorium. Imidlertid kan tilpasninger for flere celletyper optimaliseres ved å justere noen detaljer som antall seeded celler, metoder og kjemikalier som…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker medlemmer av The lab for fruktbart diskusjoner og Thijmen van Vliet for deling av data og protokollen på UV-indusert senescence.
DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
TRIS base | Roche | 11814273001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
Tweezers | |||
Needles |