Här diskuterar vi en serie av protokoll för induktion och validering av cellulära åldras i odlade celler. Vi fokuserar på olika åldras-inducerande stimuli och beskriva kvantifieringen av gemensamma åldras-associerade markörer. Vi tillhandahåller tekniska detaljer med fibroblaster som modell, men protokoll som kan anpassas till olika cellular-modeller.
Cellulära åldras är ett tillstånd av permanent cellcykelarrest aktiveras som svar på olika skadliga stimuli. Aktivering av cellulära åldras är ett kännetecken för olika patofysiologiska förhållanden inklusive tumör dämpning, vävnad remodeling och åldrande. Inducerare av cellulära åldras i vivo kännetecknas fortfarande dåligt. Ett antal stimuli kan dock användas för att främja cellulära åldras ex vivo. Bland dem är de vanligaste åldras-inducerare replikationsförmåga utmattning, joniserande och icke-joniserande strålning, genotoxiska droger, oxidativ stress, och demethylating och acetylating agenter. Här, kommer vi att ge detaljerade instruktioner om hur du använder dessa stimuli för att inducera fibroblaster in åldras. Detta protokoll kan enkelt anpassas för olika typer av primära celler och cellinjer, inklusive cancerceller. Vi beskriver också olika metoder för validering av åldras induktion. Framför allt fokuserar vi på att mäta aktiviteten av det lysosomala enzymet åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-gal), graden av DNA-syntes med 5-ethynyl-2′-deoxiuridin (EdU) införlivandet analys, nivåerna av uttryck av cellcykeln hämmare p16 och p21, och uttryck och utsöndringen av medlemmar av den Senescence-Associated sekretoriska fenotyp (SASP). Slutligen, vi ge exempel på resultat och diskutera ytterligare tillämpningar av dessa protokoll.
I 1961 rapporterade Hayflick och Moorhead att primära fibroblaster i kulturen förlorar sin proliferativa potential efter successiva passager1. Denna process orsakas av sekventiell förkortningen av telomererna efter varje celldelning. När telomererna når ett kritiskt kort längd, de erkänns av DNA-skada svar (DDR) som aktiverar en irreversibel gripandet av spridning — också definieras som replikationsförmåga åldras. Replikationsförmåga åldras är idag en av de många stimuli som är kända för att framkalla ett tillstånd av permanent cellcykelarrest som återger celler okänsliga både mitogena substanser och apoptotiska signaler2,3. Åldras programmet kännetecknas normalt av ytterligare funktioner, inklusive hög lysosomal aktivitet, mitokondriell dysfunktion, nukleära förändringar, kromatin omflyttningar, endoplasmatiska nätverket stress, DNA-skador och en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP)3,4. Senescent celler har flera funktioner i kroppen: utveckling, sår läkning och tumör dämpning2. Likaså är de kända för att spela en viktig roll i åldrande och, paradoxalt nog, i tumör progression5. Negativa och delvis motsägelsefulla, effekterna av åldras tillskrivs ofta de SASP6.
Nyligen visades att eliminering av senescent celler från möss leder till livslängd förlängning och eliminering av många av åldrande funktioner7,8,9,10,11, 12. på samma sätt, flera droger har utvecklats att antingen eliminera senescent celler (senolytics) eller rikta den SASP13,14. Anti-aging terapeutiska potential har nyligen väckt mer uppmärksamhet till fältet.
Studier av mekanismer som är associerade till cellulära åldras och visningarna för farmakologiska interventioner är kraftigt beroende av ex vivo modeller, särskilt på mänskliga primära fibroblaster. Medan det finns vissa gemensamma funktioner som aktiveras av olika åldras inducerare, är en stor variabilitet i åldras fenotypen observerade och beroende av olika faktorer inklusive cell typ, stimulans och tid punkt3,15, 16,17. Det är absolut nödvändigt att överväga heterogenitet för att studera och inriktning senescent celler. Detta protokoll syftar därför till att tillhandahålla en rad metoder används för att framkalla åldras i primära fibroblaster med hjälp av olika behandlingar. Som det kommer att förklaras, kan metoderna enkelt anpassas till andra celltyper.
Frånsett replikationsförmåga åldras, beskriver vi fem andra åldras-inducerande behandlingar: joniserande strålning, ultraviolett (UV) strålning, doxorubicin, oxidativ stress och epigenetiska förändringar (nämligen främjande av Histon acetylering eller DNA demetylering) . Både, joniserande strålning och UV-strålning orsakar direkta DNA-skador och vid lämplig dos utlösa åldras18,19. Doxorubicin orsakar också åldras främst genom DNA-skador genom att infoga i DNA och störa topoisomeras II funktion och därmed stoppa DNA reparation mekanismer20. Uttrycket av gener som är viktiga för åldras styrs normalt av Histon acetylering och DNA-metylering. Följaktligen, utlösa Histon histondeacetylas hämmare (t.ex., natrium butyrate och SAHA) och DNA demethylating (t.ex. 5-aza) ombud åldras i övrigt normala celler21,22.
Slutligen, fyra av de vanligaste markörer associerade till senescent celler kommer att förklaras: aktivitet av åldras associerade-β-galaktosidas (SA-β-gal), graden av DNA-syntes av EdU inkorporering assay, överuttryck av cellcykeln tillsynsmyndigheterna och cyklin-beroende kinase hämmare p16 och p21, och överuttryck och utsöndringen av medlemmar av SASP.
De protokoll som förklaras här var optimerad för mänskliga primära fibroblaster, särskilt BJ och WI-38 celler. Protokollen för replikationsförmåga åldras, joniserande strålning och doxorubicin, har tillämpats framgångsrikt på andra typer av fibroblaster (HCA2 och IMR90) och i andra celltyper (nämligen neonatal melanocyter och keratinocyter eller iPSC-derived hjärtmuskelcellerna) i vårt laboratorium. Anpassningar för ytterligare celltyper kan dock optimeras genom att justera vissa detaljer som antalet se…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar medlemmar i Demaria lab för givande diskussioner och Thijmen van Vliet för att dela data och protokollet om den UV-inducerad åldras.
DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
TRIS base | Roche | 11814273001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
Tweezers | |||
Needles |