在这里, 我们讨论了一系列的诱导和确认细胞衰老在培养细胞的协议。我们专注于不同的衰老诱发刺激, 并描述了常见的衰老相关标记的量化。我们提供的技术细节, 以成纤维细胞作为模型, 但协议可以适应各种细胞模型。
细胞衰老是一种永久性细胞周期停止激活的反应, 以应对不同的破坏性刺激。细胞衰老的活化是各种病理生理条件的标志, 包括肿瘤抑制、组织重塑和衰老。细胞衰老的诱导体在体内仍然缺乏特征。然而, 一些刺激可以用来促进细胞衰老前体。其中, 最常见的衰老诱导因子是复制衰竭, 电离和非电离辐射, 毒性药物, 氧化应激, 去甲基化和乙酰剂。在这里, 我们将提供有关如何使用这些刺激诱导成纤维细胞衰老的详细说明。该协议可以很容易地适应不同类型的主要细胞和细胞系, 包括癌细胞。我们还描述了不同的方法来验证衰老诱导。特别是, 我们专注于测量溶酶体与衰老相关的β-乳糖酶 (SA β-加仑) 的活性, 使用 5-乙炔-2 ‘-脱氧尿苷 () 的 DNA 合成率, 细胞周期的表达水平抑制剂 p16 和 p21, 以及衰老相关分泌表型 (SASP) 成员的表达和分泌。最后, 给出了实例结果, 并讨论了这些协议的进一步应用。
在 1961年, 佛烈克和穆尔黑德报告说, 在连续1段后, 培养的主要成纤维细胞失去了增殖潜能。这一过程是由每细胞分裂后端粒的顺序缩短引起的。当端粒到达临界短的长度时, 它们被 DNA 损伤反应 (DDR) 所识别, 它激活了不可逆转的增殖–也被定义为复制衰老。复制衰老是目前已知的许多刺激之一, 导致一个永久性细胞周期逮捕的状态, 使细胞不敏感的 mitogens 和凋亡信号2,3。衰老程序通常的特点是额外的功能, 包括高溶酶活性, 线粒体功能障碍, 核变化, 染色质重组, 内质网应力, DNA 损伤和衰老相关分泌表型 (SASP)3,4。衰老细胞在体内具有多种功能: 发育、创面愈合和肿瘤抑制2。同样, 众所周知, 它们在衰老和肿瘤进展5中起着重要的作用。衰老的消极和部分矛盾的影响通常归因于 SASP6。
最近, 它表明, 消除衰老细胞的小鼠导致寿命延长和消除许多老化功能7,8,9,10,11,12. 同样, 已经开发了多种药物, 以消除衰老细胞 (senolytics) 或靶向 SASP13,14。抗衰老治疗潜力最近引起了人们的广泛关注。
对细胞衰老相关机制的研究和药理干预的筛选严重依赖于体外模型, 特别是在人原代成纤维细胞中。虽然不同的衰老诱导因子激活了一些共同的特征, 但衰老表型的大变异性被观察到, 并依赖于各种因素, 包括细胞类型, 刺激和时间点3,15, 16,17。研究和定位衰老细胞的异质性是当务之急。因此, 本议定书的目的是提供一系列方法, 以诱发衰老的主要成纤维细胞使用不同的治疗。正如它将解释, 这些方法可以很容易地适应其他细胞类型。
除了复制衰老, 我们还描述了其他五种衰老诱导治疗: 电离辐射, 紫外线 (紫外线) 辐射, 阿霉素, 氧化应激和后生变化 (即促进组蛋白乙酰化或 DNA 去甲基化).电离辐射和紫外线辐射直接导致 DNA 损伤, 并在适当剂量下引发衰老18,19。阿霉素还导致衰老主要是通过锂 dna 损伤的 dna 和干扰拓扑异构酶 II 功能, 从而停止 DNA 修复机制20。衰老的关键基因表达通常由组蛋白乙酰化和 DNA 甲基化控制。因此, 组蛋白乙酰抑制剂 (如丁酸钠和萨哈) 和 DNA 去甲基化 (例如, 5-aza) 剂会导致正常细胞21,22的衰老。
最后, 与衰老细胞相关的四种最常见的标记将被解释为: 衰老相关的乳糖酶 (SA β) 的活性、由免疫组织测定的 DNA 合成率、细胞周期调节器的过度表达和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 p16 和 p21, 并表达和分泌的 SASP 成员。
这里解释的协议被优化了为人的主要成纤维细胞, 特别是 BJ 和 WI-38 细胞。复制衰老, 电离辐射和阿霉素的协议已成功地应用于其他类型的成纤维细胞 (HCA2 和 IMR90) 和其他细胞类型 (即新生儿黑色素细胞和角质形成素或 iPSC 衍生心肌细胞)在我们的实验室里。然而, 可以通过调整一些细节, 如种子细胞数量, 方法和化学物质来帮助细胞附着/分离到塑料支架上, 以及治疗的剂量以避免毒性, 来优化其他细?…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Demaria 实验室的成员进行了卓有成效的讨论, 并 Thijmen van 弗利特共享关于紫外线诱发衰老的数据和协议。
DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
TRIS base | Roche | 11814273001 | |
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
Tweezers | |||
Needles |