Summary

Induction et la Validation de la sénescence cellulaire dans les cellules humaines primaires

Published: June 20, 2018
doi:

Summary

Ici, nous discutons une série de protocoles pour l’induction et la validation de la sénescence cellulaire dans les cellules cultivées. Nous nous concentrons sur différents stimulus induisant la sénescence et décrire la quantification de marqueurs communs liés à la sénescence. Nous fournissons des détails techniques à l’aide de fibroblastes comme modèle, mais les protocoles peuvent être adaptés aux différents modèles cellulaires.

Abstract

Sénescence cellulaire est un état d’arrêt permanent cycle cellulaire activé en réponse à différents stimuli nocifs. Activation de la sénescence cellulaire est une caractéristique de diverses conditions physiopathologiques, y compris la suppression tumorale, remodelage et le vieillissement des tissus. Les inducteurs de la sénescence cellulaire in vivo sont encore mal caractérisés. Toutefois, un certain nombre de stimuli peut servir à promouvoir la sénescence cellulaire ex vivo. Parmi eux, les plus courantes de sénescence-inducteurs sont réplicative épuisement, ionisant et non ionisant, génotoxique drogues, stress oxydatif et demethylation et agents d’acétylation. Ici, nous fournirons des instructions détaillées sur l’utilisation de ces stimuli pour induire des fibroblastes en sénescence. Ce protocole peut être facilement adapté pour différents types de piles et de lignées cellulaires, y compris les cellules cancéreuses. Nous décrivons également différentes méthodes pour la validation de l’induction de la sénescence. En particulier, nous nous concentrons sur la mesure de l’activité de l’enzyme lysosomale associés à la sénescence β-galactosidase (SA-β-gal), le taux de synthèse de l’ADN à l’aide d’analyse 5-éthynyl-2′-déoxyuridine (EdU), les niveaux d’expression du cycle cellulaire inhibiteurs p16 et p21 et l’expression et la sécrétion des membres de la phénotype sécrétoire Senescence-Associated (SASP). Enfin, nous fournir les résultats de l’exemple et en discuter plus les applications de ces protocoles.

Introduction

En 1961, Hayflick et Moorhead a signalé que les fibroblastes en culture primaires perdent leur potentiel prolifératif après passages successifs1. Ce processus est provoqué par le séquentiel raccourcissement des télomères après chaque division cellulaire. Quand les télomères atteignent une critique courte longueur, ils sont reconnus par la réponse de lésions de l’ADN (DDR) qui active un arrêt irréversible de prolifération — aussi défini comme la sénescence réplicative. La sénescence réplicative est actuellement l’un des nombreux stimuli qui sont connus pour induire un état de l’arrestation de cycle de cellules permanentes qui rend les cellules insensibles aux mitogènes tant des signaux apoptotic2,3. Le programme de sénescence est normalement caractérisé par des fonctionnalités supplémentaires, y compris la forte activité lysosomale, dysfonctionnement mitochondrial, modifications nucléaires, réarrangements de la chromatine, stress du réticulum endoplasmique, dommages à l’ADN et associée à une sénescence phénotype sécrétoire (SASP)3,4. Les cellules sénescentes ont de multiples fonctions dans le corps : développement, wound healing et tumeur suppression2. De même, ils sont connus pour jouer un rôle important dans le vieillissement et, paradoxalement, en progression de tumeur5. Les effets négatifs et partiellement contradictoires, de sénescence sont souvent attribués à la SASP6.

Récemment, il a été démontré qu’élimination des cellules sénescentes de souris conduit à la prolongation de la durée de vie et à l’élimination d’un grand nombre du vieillissement caractéristiques7,8,9,10,11, 12. de la même façon, plusieurs médicaments ont été développés pour soit éliminer les cellules sénescentes (senolytics) ou de cibler les SASP13,14. Le potentiel thérapeutique de l’anti-aging a récemment attiré plus d’attention au champ.

L’étude des mécanismes liés à la sénescence cellulaire et les projections pour les interventions pharmacologiques insistent beaucoup sur les modèles ex vivo , particulièrement sur les fibroblastes humains primaires. Bien qu’il existe certaines caractéristiques communes activés par des inducteurs de sénescence divers, une grande variabilité dans le phénotype de la sénescence est observée et dépend de divers facteurs, notamment la cellule type, stimulation et temps point3,15, 16,17. Il est impératif de tenir compte de l’hétérogénéité pour l’étude et le ciblage des cellules sénescentes. Par conséquent, ce protocole vise à fournir une série de méthodes utilisées pour induire la sénescence dans des fibroblastes de primaires à l’aide de différents traitements. Comme il sera expliqué, les méthodes peuvent facilement être adaptés à d’autres types de cellules.

En dehors de la sénescence réplicative, les auteurs décrivent cinq autres traitements induisant la sénescence : rayonnement ionisant rayonnement, rayonnement ultraviolet (UV), doxorubicine, le stress oxydatif et les changements épigénétiques (à savoir la promotion de l’acétylation des histones ou de déméthylation de l’ADN) . Rayonnements ionisants et rayonnement UV endommager directe de l’ADN et, à la dose appropriée, déclenchent la sénescence18,19. Doxorubicine provoque également la sénescence principalement par le biais de dommages à l’ADN par intercalation dans l’ADN et perturbent la fonction de topoisomérase II et ainsi mettre un terme à l’ADN réparation mécanismes20. L’expression des gènes essentiels à la sénescence est normalement contrôlée par l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN. En conséquence, les inhibiteurs d’histone déacétylase (p. ex., le butyrate de sodium et SAHA) et ADN demethylating (p. ex., 5-aza) agents déclenchent sénescence dans les cellules normales sinon21,22.

Enfin, quatre des marqueurs plus communs associés aux cellules sénescentes sera expliqué : l’activité de la sénescence associés-β-galactosidase (SA-β-gal), taux de synthèse de l’ADN par EdU analyse, la surexpression des régulateurs de cycle cellulaire et p16 inhibiteurs de kinase cycline-dépendante et p21 et surexpression et la sécrétion des membres de la SASP.

Protocol

1. préparation générale Préparer D10 milieu. Supplément du moyen-Glutamax DMEM avec 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine (concentration finale : 100 U/mL). Préparer une solution PBS stérile. Dissoudre les comprimés dans de l’eau selon les instructions du fabricant. Stériliser à l’autoclave. Préparer la trypsine x 1. Diluer 5 mL de trypsine-Versene EDTA/10 x 01:10 dans 45 mL de PBS stérile.Remarque : Dans tout le protocole, nous utilisons les conditions de cu…

Representative Results

Enrichissement de SA-β-gal de coloration dans les fibroblastes sénescents Β-galactosidase (β-gal) est une enzyme lysosomiale qui s’exprime dans toutes les cellules et qui a un pH optimum de 4,025,26. Cependant, au cours de la sénescence, les lysosomes augmentent en taille et, par conséquent, les cellules sénescentes accumulent β-gal. Les quantités accrues de cett…

Discussion

Les protocoles expliqués ici ont été optimisées pour des fibroblastes humains primaires, en particulier les cellules BJ et WI-38. Les protocoles pour la sénescence réplicative, rayonnements ionisants et la doxorubicine, ont été appliquées avec succès à d’autres types de fibroblastes (HCA2 et IMR90) et dans d’autres types de cellules (à savoir néonatales mélanocytes et kératinocytes ou cardiomyocytes dérivés iPSC) dans notre laboratoire. Toutefois, des adaptations pour les types de cellules supplémen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions les membres du laboratoire Demaria pour des discussions fructueuses et Thijmen van Vliet pour le partage de données et protocole sur la sénescence induite par l’UV.

Materials

DMEM Media – GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

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Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

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