Summary

ひと初代細胞における細胞老化の誘導性

Published: June 20, 2018
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Summary

ここでは、一連の誘発のためのプロトコルおよび培養細胞の細胞老化の検証について述べる。私たちはさまざまな老化を誘発する刺激に焦点を当てるし、一般的な老化関連マーカーの定量化を記述します。私たちはモデルとして線維芽細胞を使用して技術的な詳細を提供するが、プロトコルは、さまざまな携帯電話モデルに合わせることができます。

Abstract

細胞の老化は、さまざまな有害な刺激への応答でアクティブに永久的な細胞周期の停止の状態です。細胞の老化の活性化は、腫瘍の抑制、組織改造と高齢化を含むさまざまな病態生理学的条件の特徴です。生体内で細胞老化の誘導はまだよく特徴付けられます。ただし、 ex vivo細胞老化を促進する刺激の数を使用できます。その中で、最も一般的な老化誘導が複製枯渇、電離放射線し非電離放射線、遺伝毒性薬、酸化ストレスと demethylating とエージェントをアセチル化します。ここでは、これらの刺激を使用して老化に線維芽細胞を誘導する方法で詳細な指示いたします。このプロトコルは、簡単に、初代培養細胞やがん細胞を含む細胞の種類ごとに適応できます。老化誘導の検証するための異なる方法についても述べる。特に、我々 はライソゾーム酵素老化関連 β ガラクトシダーゼ (SA β gal) 細胞周期の表現のレベル 5-エチニル-2′-デオキシウリジン (EdU) 取り込みアッセイを用いた DNA 合成率の活性の測定に焦点を当てるp16 の阻害剤と p21 と表情やメンバーの Senescence-Associated 分泌形質 (SASP) の分泌。最後に、私達は例の結果を提供し、これらのプロトコルのアプリケーションをさらに議論。

Introduction

1961 年、ヘイフリック、ムーアヘッドは、文化の主要な線維芽細胞が連続通路1の後の増殖の可能性を失うことを報告します。このプロセスは、各細胞分裂後シーケンシャル テロメア短縮が原因です。テロメア批判的に短い長さに達する、増殖の不可逆的な停止を活性化する DNA 損傷応答 (DDR) によって認識されます-複製老化としても定義されています。複製老化細胞のマイトジェンとアポトーシス シグナル2,3の両方に依存しないレンダリングする永久的な細胞周期の停止の状態を誘導するために知られている多くの刺激の 1 つされて。老化プログラムは通常高リソソーム活動、ミトコンドリア、核変化、クロマチン再編成、小胞体ストレス、DNA の損傷と老化関連を含む追加の機能によって特徴付けられる分泌型表現型 (SASP)3,4。老化細胞体に複数の機能がある: 開発、創傷治癒およびがん抑制2。同様に、彼らは高齢化と、逆説的に、腫瘍の進行5で重要な役割を再生する知られています。老化の負の値、および部分的に矛盾した効果は、SASP6頻繁に原因です。

最近では、マウスから老化細胞の除去が寿命延長し老化機能7,8,9,1011,の多くの除去につながることを示した12します。 同じ方法で複数の薬を老化細胞 (senolytics) を排除するか、または SASP13,14を対象に開発されています。アンチエイジング治療の可能性は、フィールドに多くの注目を集めている最近。

細胞の老化に関連したメカニズムの研究と薬理学的介入の上映前のヴィヴォモデルでは、特に主線維芽細胞上に依存します。老化の表現型の変化は観察と細胞の種類、刺激および時間ポイント3,15を含む様々 な要因に依存して多様な老化誘導因子によって活性化されるいくつかの一般的な機能がありますが、 16,17。勉強し、老化細胞をターゲットの不均一性を考慮することが不可欠です。したがって、このプロトコルは一連のさまざまな治療法を使用して、主に線維芽細胞老化を誘導するために使用されるメソッドを提供するために目指しています。それで説明しますが、メソッドは他の細胞型に適応できます。

別に複製老化老化を誘発する他の 5 つの治療について述べる: 電離放射線、紫外線 (UV)、ドキソルビシン、酸化ストレスおよびエピジェネティックな変化 (すなわち DNA 脱メチル化やヒストンのアセチル化の推進).電離放射線と紫外線の両方、直接 DNA 損傷を引き起こすし、適切な用量でトリガー老化18,19。ドキソルビシンまた間を DNA にインターカ レートによって DNA の損傷によって主に老化を引き起こすし、トポイソメラーゼ II の機能を中断、中止 DNA 修復機構20。老化に不可欠な遺伝子の発現は、DNA メチル化とヒストンのアセチル化によって制御されます通常。結果として、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤 (例えば、酪酸ナトリウム、サハ) と DNA demethylating (例えば5 字) エージェントは、正常細胞21,22老化をトリガーします。

最後に、4 つの老化細胞に関連付けられている最も一般的なマーカーの説明される: 老化関連-β-ガラクトシダーゼ (SA β gal) EdU 取り込みアッセイ、細胞周期調節因子の過剰発現による DNA 合成率の活動とサイクリン依存性キナーゼ阻害剤 p16 と p21 と、SASP のメンバーの分泌の過剰発現

Protocol

1. 一般準備 D10 メディアを準備します。10 s と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを DMEM 培地 Glutamax を補う (最終濃度: 100 U/mL)。 滅菌 PBS を準備します。製造元の指示に従って水の錠剤を溶解します。オートクレーブで滅菌します。 1 x トリプシンを準備します。トリプシン Versene EDTA/10 の 5 mL の希釈 1:10 45 mL の滅菌 PBS で x。注: プロトコルを通して我々 使用に近い?…

Representative Results

SA β gal 染色老化線維芽細胞の濃縮 Β-ガラクトシダーゼ (β gal) すべての細胞で発現していること、最適な pH 4.025,26のライソゾーム酵素であります。ただし、老化、中にリソソームのサイズが大きく、その結果、老化細胞蓄積 β gal。この酵素の増加量は、最適 pH 6.025</s…

Discussion

ここで説明したプロトコル最適化した一次線維芽細胞、特に BJ と WI-38 細胞。複製老化、電離放射線、ドキソルビシンのためのプロトコルは (HCA2 および IMR90) 線維芽細胞と他の細胞型 (すなわち新生児メラノサイトとケラチノ サイトまたは iPSC 由来心筋細胞) の他のタイプに正常に適用されています。本研究室では。ただし、その他の細胞のタイプのための適応は、シード細胞、メソッドおよ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

実りある議論のため管理者にラボと Thijmen ヴァン Vliet と紫外線による老化のプロトコルのデータを共有するためのメンバーに感謝いたします。

Materials

DMEM Media – GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

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Cite This Article
Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

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