Summary
Här diskuterar vi en serie av protokoll för induktion och validering av cellulära åldras i odlade celler. Vi fokuserar på olika åldras-inducerande stimuli och beskriva kvantifieringen av gemensamma åldras-associerade markörer. Vi tillhandahåller tekniska detaljer med fibroblaster som modell, men protokoll som kan anpassas till olika cellular-modeller.
Abstract
Cellulära åldras är ett tillstånd av permanent cellcykelarrest aktiveras som svar på olika skadliga stimuli. Aktivering av cellulära åldras är ett kännetecken för olika patofysiologiska förhållanden inklusive tumör dämpning, vävnad remodeling och åldrande. Inducerare av cellulära åldras i vivo kännetecknas fortfarande dåligt. Ett antal stimuli kan dock användas för att främja cellulära åldras ex vivo. Bland dem är de vanligaste åldras-inducerare replikationsförmåga utmattning, joniserande och icke-joniserande strålning, genotoxiska droger, oxidativ stress, och demethylating och acetylating agenter. Här, kommer vi att ge detaljerade instruktioner om hur du använder dessa stimuli för att inducera fibroblaster in åldras. Detta protokoll kan enkelt anpassas för olika typer av primära celler och cellinjer, inklusive cancerceller. Vi beskriver också olika metoder för validering av åldras induktion. Framför allt fokuserar vi på att mäta aktiviteten av det lysosomala enzymet åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-gal), graden av DNA-syntes med 5-ethynyl-2'-deoxiuridin (EdU) införlivandet analys, nivåerna av uttryck av cellcykeln hämmare p16 och p21, och uttryck och utsöndringen av medlemmar av den Senescence-Associated sekretoriska fenotyp (SASP). Slutligen, vi ge exempel på resultat och diskutera ytterligare tillämpningar av dessa protokoll.
Introduction
I 1961 rapporterade Hayflick och Moorhead att primära fibroblaster i kulturen förlorar sin proliferativa potential efter successiva passager1. Denna process orsakas av sekventiell förkortningen av telomererna efter varje celldelning. När telomererna når ett kritiskt kort längd, de erkänns av DNA-skada svar (DDR) som aktiverar en irreversibel gripandet av spridning — också definieras som replikationsförmåga åldras. Replikationsförmåga åldras är idag en av de många stimuli som är kända för att framkalla ett tillstånd av permanent cellcykelarrest som återger celler okänsliga både mitogena substanser och apoptotiska signaler2,3. Åldras programmet kännetecknas normalt av ytterligare funktioner, inklusive hög lysosomal aktivitet, mitokondriell dysfunktion, nukleära förändringar, kromatin omflyttningar, endoplasmatiska nätverket stress, DNA-skador och en åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP)3,4. Senescent celler har flera funktioner i kroppen: utveckling, sår läkning och tumör dämpning2. Likaså är de kända för att spela en viktig roll i åldrande och, paradoxalt nog, i tumör progression5. Negativa och delvis motsägelsefulla, effekterna av åldras tillskrivs ofta de SASP6.
Nyligen visades att eliminering av senescent celler från möss leder till livslängd förlängning och eliminering av många av åldrande funktioner7,8,9,10,11, 12. på samma sätt, flera droger har utvecklats att antingen eliminera senescent celler (senolytics) eller rikta den SASP13,14. Anti-aging terapeutiska potential har nyligen väckt mer uppmärksamhet till fältet.
Studier av mekanismer som är associerade till cellulära åldras och visningarna för farmakologiska interventioner är kraftigt beroende av ex vivo modeller, särskilt på mänskliga primära fibroblaster. Medan det finns vissa gemensamma funktioner som aktiveras av olika åldras inducerare, är en stor variabilitet i åldras fenotypen observerade och beroende av olika faktorer inklusive cell typ, stimulans och tid punkt3,15, 16,17. Det är absolut nödvändigt att överväga heterogenitet för att studera och inriktning senescent celler. Detta protokoll syftar därför till att tillhandahålla en rad metoder används för att framkalla åldras i primära fibroblaster med hjälp av olika behandlingar. Som det kommer att förklaras, kan metoderna enkelt anpassas till andra celltyper.
Frånsett replikationsförmåga åldras, beskriver vi fem andra åldras-inducerande behandlingar: joniserande strålning, ultraviolett (UV) strålning, doxorubicin, oxidativ stress och epigenetiska förändringar (nämligen främjande av Histon acetylering eller DNA demetylering) . Både, joniserande strålning och UV-strålning orsakar direkta DNA-skador och vid lämplig dos utlösa åldras18,19. Doxorubicin orsakar också åldras främst genom DNA-skador genom att infoga i DNA och störa topoisomeras II funktion och därmed stoppa DNA reparation mekanismer20. Uttrycket av gener som är viktiga för åldras styrs normalt av Histon acetylering och DNA-metylering. Följaktligen, utlösa Histon histondeacetylas hämmare (t.ex., natrium butyrate och SAHA) och DNA demethylating (t.ex. 5-aza) ombud åldras i övrigt normala celler21,22.
Slutligen, fyra av de vanligaste markörer associerade till senescent celler kommer att förklaras: aktivitet av åldras associerade-β-galaktosidas (SA-β-gal), graden av DNA-syntes av EdU inkorporering assay, överuttryck av cellcykeln tillsynsmyndigheterna och cyklin-beroende kinase hämmare p16 och p21, och överuttryck och utsöndringen av medlemmar av SASP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. allmänna beredning
- Förbereda D10 medium. Komplettera DMEM medium-Glutamax med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin (slutlig koncentration: 100 U/mL).
- Förbereda sterila PBS. Lös inte upp tabletterna i vatten enligt tillverkarens anvisningar. Sterilisera i autoklav.
- Bered 1 x trypsin. Späd 5 mL av Trypsin-Versene EDTA/10 x 1:10 i 45 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
Obs: I hela protokollet, vi använder cell odlingsbetingelser som ligger närmare den fysiologiska villkor för primär fibroblaster. Detta innebär att vi Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 är normalt klar men använda 5% O2 istället för den ”standard” 20% O2. - Hantera alla prover i sterila förhållanden med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
2. induktion av åldras
- Replikationsförmåga åldras
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.) arbeta under sterila förhållanden och med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Frö 7 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg folkmängd fördubbling (PD) i en T75 kolv (~9.3 x 103 celler/cm2) innehållande 10 mL D10.
- Växa cellerna i en cell inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2 tills de når 70 – 80% sammanflödet (3 – 4 dagar för prolifererande kulturer i en låg PD).
- Lossa cellerna med 3 mL 1 x trypsin och inkubation för ~ 5 – 7 min i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2. Regelbundet övervaka cellerna med en cell kultur Mikroskop för att kontrollera detaching processen.
- När cellerna är sfärisk, stoppa trypsin reaktionen genom att lägga till 9 mL D10. Inte Inkubera längre än 10 min.
- Snurra cellerna på 300 x g för 5 min. celler kommer att bilda en pellet längst ned på röret, medan skräp och mindre partiklar kommer att förbli i supernatanten.
- Avlägsna supernatanten och upplösa cellpelleten i 1 mL D10 och utföra en cell sammanräkning med en automatisk cell räknare enligt tillverkarens anvisningar eller en Neubauer kammare för manuell räkning. Samtidigt räknar, inkludera ett test för att kontrollera livskraft hos cellerna (t.ex., Trypan blå utslagning23).
- Beräkna den kumulativa PD med följande formel:
PDnya = 3.32* (LOG(cell number total)-(LOG (cell nummer seedade)) + PDold
Mobiltelefonnummer totala = alla celler räknas: döda och levande.
Mobiltelefonnummer seedade = antalet livskraftiga celler seedade (8 x 105 celler).
PDgamla = befolkningen fördubblas vid tidpunkten för sådd.
PDnya = befolkningen fördubblas vid tidpunkten för inventering (efter inkubation).
Obs: Om 7 x 105 primära fibroblaster (PD 35,2) var seedad på en T-75 kolv och, efter 4 dagar de når 80% sammanflödet och delas igen, räknar nu 1,3 x 106 totala celler (döda + lever).
PDnya = 3.32* (LOG(1,300,000 cells)-LOG(700,000)) + 35,2
PDnya = 36,1 - Reseed 8 x 105 celler i en ny T75, upprepa steg 2.1.2–2.1.8.
Obs: Efter flera på varandra följande passager, kulturen tar längre tid att få konfluenta tills cellerna slutar att dela alls. När celler slutar att dela, testa för åldras markörer eller skörd för nedströms tillämpningar. - Anser att den större storleken på senescent celler kan orsaka kulturen ska visas full och ännu har lågt antal blodkroppar. Därför åldras kan antas när PD är stabil och andra åldras markörer visas i kulturen (se protokoll 3.1 – 3.5).
Obs: Använd prolifererande primära fibroblaster som kontroll.
- Joniserande strålning-inducerad åldras
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.), arbeta under sterila förhållanden med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Frö 7 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg PD i en T75 kolv (~9.3 x 103 celler/cm2) innehållande 10 mL D10.
- Inkubera cellerna över natten i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Utsätta celler till 10 grå av gammastrålning enligt anvisningarna från vilken maskin som används.
- Aspirera på medellång från cellerna och Ersätt med 10 mL D10.
- Inkubera cellerna i 10 mL D10 i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2 i en annan 10 dagar ersätta mediet regelbundet, ungefär var 3 dagar.
- Efter 10 dagar, testa för åldras markörer och/eller använda cellerna för efterföljande program.
Obs: Använd prolifererande primära fibroblaster av samma PD (före bestrålning) som kontroll.
- Ultraviolett (UV) inducerad strålning-åldras
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.), arbeta under sterila förhållanden med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Utsäde 1,5 – 2 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg PD i en väl 6-well platta (1,5 – 2,0 x 104 celler/cm2), tillsätt 2 mL av D10 medium.
- Placera cellerna i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2 och tillåta dem att hålla sig till plast för minst 5 h.
- Ta bort mediet från cellerna. Placera 6-väl plattan i mitten av UV-strålning kammaren och tar plastlock. Bestråla med UVB, 20 – 30 mJ/cm2.
- Tillsätt 2 mL av medium per brunn.
- Inkubera cellerna i 2 mL D10 i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2 i ytterligare 7 dagar ersätta mediet regelbundet, ungefär var 3 dagar.
Obs: Efter 7 dagar, celler kan testas för åldras markörer och användas för efterföljande program. Använd prolifererande primära fibroblaster av samma PD (före bestrålning) som kontroll.
- Doxorubicin-inducerad åldras
- Förbereda 1000 x Doxorubicin stamlösning: göra en 250 µM lager av Doxorubicin i 1 x PBS, filter-sterilisera den lösningen och delprov i 500 µL per sterilt rör. Lagra doxorubicin beståndet vid-80 ° C.
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.), arbeta under sterila förhållanden med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Frö 7 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg PD i en T75 kolv (~9.3 x 103 celler/cm2) innehållande 10 mL D10.
- Inkubera cellerna över natten i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Späd 11 µL av 1000 x doxorubicin stamlösning i 11 mL D10 till en slutlig koncentration av 250 nM.
- Aspirera på medellång från cellerna och Ersätt med 10 mL D10 + doxorubicin.
- Inkubera cellerna för exakt 24 h i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Sug ut mediet från cellerna och noggrant tvätta en gång med 10 mL D10.
- Inkubera cellerna i 10 mL D10 i ytterligare 6 dagar ersätta mediet regelbundet, ungefär var 3 dagar.
- Dag 7, testa för åldras markörer eller användning för nedströms tillämpningar.
Obs: som kontroll, Använd frodas primära fibroblaster av samma PD behandlas för 24 h med fordon (PBS) 1:1,000 i D10.
- Oxidativ Stress-inducerad åldras
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.) arbeta under sterila förhållanden med hjälp av en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Frö 7 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg PD i en T75 kolv (~9.3 x 103 celler/cm2) innehållande 10 mL D10.
- Inkubera cellerna över natten i en cell inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Bered en ~ 200 μM väteperoxid i D10 medium genom att lägga till 22,6 μl av 30% väteperoxid i 11 mL D10.
Obs: Optimera behandlingen för den celltyp av intresse genom att göra en kurva dos-respons att utvärdera toxicitet. - Sug ut mediet från cellerna och tillsätt 10 mL av den nylagade D10 medium + väteperoxid. Inkubera i 2 h vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Aspirera på medellång från cellerna och tvätta en gång med färska D10 utan väteperoxid.
- Tillsätt 10 mL av D10 utan väteperoxid.
- Inkubera i 48 h i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Upprepa steg 2.5.4–2.5.8 två gånger mer för sammanlagt tre behandlingar.
- Kontrollera om åldras markörer eller skörden för nedströms tillämpningar.
Obs: Som kontroll, Använd prolifererande celler av samma PD behandlas med 22,6 µL sterilt vatten i D10 för 2 h.
- Epigenetiskt-inducerad åldras
- Förbereda lager och fungerande lösningar för de små molecule(s) att använda enligt tabell 1. Filter-sterilisera lösningarna. Delprov i sterilt rör. Förvaras vid-20 ° C.
- Vid hantering av celler eller material som kommer i kontakt med dem (pipetter, kolvar, media, etc.) arbeta under sterila förhållanden, exempelvis genom att använda en LAF, labbrock och handskar. Hålla celler på 20% O2 (rumsvillkoren) endast samtidigt som hanteras.
- Frö 7 x 105 livskraftig primära fibroblaster i en låg PD i en T75 kolv (~9.3 x 103 celler/cm2) innehållande 10 mL D10.
- Inkubera cellerna över natten i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Bereda 11 mL D10 medium + fungerande lösning för önskad behandling. Den exakta utspädningen per behandling kan ses i tabell 1.
- Förbereda 11 µL av 1 mM SAHA fungerande lösning i 11 mL D10.
- Förbereda 44 µL av 1 M natrium butyrate fungerande lösning i 11 mL D10.
- Förbereda 11 µL 10 mM 5-aza arbetslösning i 11 mL D10.
Obs: Optimera behandlingar för celltypen ränta, till exempel att göra en kurva dos-respons att utvärdera toxicitet.
- Lägg till D10 medium + fungerande lösning för önskad behandling till kulturen.
- Inkubera under 24 h i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Upprepa steg 2.6.4–2.6.6 två gånger mer, för totalt tre behandlingar.
- Ändra medium för enkel D10 utan drog.
- Efter 3 dagar mer blir celler senescent och klart för testning av åldras markörer och nedströms tillämpningar.
Obs: som kontroll, Använd frodas primära fibroblaster av samma PD behandlas i tre dagar med D10 medium + fordon. D10 medel + fordonet behöver uppdateras varje 24 h under dessa tre dagar. Fordonet är beroende av den behandling som används: 1:1,000 DMSO för SAHA och 5-aza och 1: 250 sterilt vatten för natrium Butyrate.
3. markörer för åldras
- Beredning
- Förbereda 20 mg/mL X-gal: Lös 20 mg X-gal i 1 mL dimetylformamid eller DMSO. Förvaras vid-20 ° C skyddas från ljus.
- Förbereda 0,1 M citronsyrelösning: Lös 2,1 g citronsyremonohydrat i 100 mL vatten. Förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 0,2 M natriumfosfat lösning: Lös upp 2.84 g dibasiskt natriumfosfat eller 3,56 g dibasiskt natriumfosfat torka i 100 mL vatten. Förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 0,2 M citronsyra, natrium fosfatbuffert pH 6.0: upplösa 36.85 mL 0,1 M citronsyrelösning och 63.15 mL 0,2 M natriumfosfat. Justera exakt till pH 6.0. Förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 100 mM kaliumferrocyanid: Lös 2,1 g kaliumferrocyanid i 50 mL vatten. Förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus.
- Förbereda 100 mM Kaliumferricyanid: Lös upp 1,7 g kalium Kaliumferricyanid i 50 mL vatten. Förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus.
- Förbereda 5 M natriumklorid: lös 14,6 g natriumklorid i 50 mL vatten. Förvara i rumstemperatur.
- Förbereda 1 M magnesiumklorid: Lös 4,8 g magnesiumklorid i 50 mL vatten. Förvara i rumstemperatur.
- Förbered 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyd i PBS: Lös upp 800 µL av 25% glutaraldehyd och 12,5 µL av 16% formaldehyd i 100 μL av PBS. Förvara i rumstemperatur skyddas från ljus.
- Förbereda färglösningen färska enligt tabell 2.
- Åldras-associerade β-galaktosidas färgning
- För varje prov, utsäde 1 x 104 celler i minst en brunn på en 24-well plate (5,2 x 103 celler/cm2) innehållande 500 µL av D10 så att cellerna är gles. Behandlingar (i tillämpliga fall) kan utföras direkt på denna platta eller, alternativt celler behandlas redan kan vara åter seedade till en 24-bra platta.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Tvätta cellerna två gånger med 500 μL av PBS.
- Fixa 3 – 5 min i rumstemperatur med 500 μL/brunn 2% formaldehyd + 0,2% glutaraldehyd i PBS.
- Tvätta cellerna två gånger med 500 μL av PBS.
- Förbereda färska färgning lösning, enligt antalet prover att färga.
- Tillsätt färglösningen (500 µL per brunn) och försegla plattan med parafilm att undvika avdunstning.
Obs: Avdunstning kan orsaka kristaller till form och hindra observationen under mikroskopet. - Inkubera cellerna i mörkret (t.ex. omfattas i aluminiumfolie) vid 37 ° C i en torr inkubator (utan CO2) för 12 – 16 h.
Obs: CO2 kan påverka pH och därför ändra resultaten. Vissa celltyper kan kräva kortare inkubationstider. - Tvätta två gånger med 500 μL av PBS.
- Utvärdera resultaten. Positiva celler presentera en blå (mestadels) perinukleära färgning under en normal ljusmikroskop (figur 1A).
- För kvantifiering, Observera minst 100 celler per prov och räkna antalet positiva celler. Eftersom senescent cellerna ändrar form, är det ofta svårt att definiera cellgränserna och räkna cellerna. Motfärg med DAPI att underlätta visualisering och kvantifiering av enskilda celler (figur 1B). Kvantifiera proverna (andelen positiva celler kontra totala mängden celler) med fluorescerande Mikroskop (figur 1 c). Ta flera bilder av samma prov så att i slutet kan du räkna minst 100 singel-celler och utvärdera procentandelen av SA-β-gal positiva celler i dem.
- Jämföra resultaten av senescent celler kontra deras lämplig kontroll för den behandling som används.
Obs: En samtidig färgning med EdU på samma prov är möjligt. Överväga att celler bör sedan vara dirigeras till coverslips.
- EdU inkorporering Assay
- Sätta ett täckglas per brunn i en 24-well platta enligt antalet prov att bedöma.
- Frö 1 x 104 celler i minst en väl 24-well platta (5,2 x 103 celler/cm2) per skick innehållande 500 µL av D10 så att cellerna är gles. Behandlingar (i tillämpliga fall) kan utföras direkt på denna platta eller, alternativt redan behandlade cellerna kan vara åter seedade till en 24-bra platta.
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2.
- Göra en 20 µM lösning för EdU i D10 (1: 250) beroende på antalet prover att behandla (250 μl per prov).
- Ta bort hälften av medium (250 μL) från varje brunn för att behandla och ersätta det med D10 + EdU lösning som var bara beredd. EdU slutkoncentration är 10 µM.
- Inkubera 18 – 24 h i en cell kultur inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 och 5% O2. Använd samma inkubationstiden i kontroll och senescent celler.
- Tvätta 2 x med 500 μL av PBS.
- Fixa cellerna för 10 min med 500 μL av 4% formaldehyd i PBS.
- Inkubera i 5 minuter i 500 μL av 100 mM Tris (pH 7,6).
- Permeabilize cellerna i 10 min i 500 μL av 0,1% Triton x-100 i PBS.
- Tvätta 3 x med PBS.
- Förbereda 50 μL av etikett mix för varje täckglas, lägga till komponenter i följande ordning: 44,45 µL av PBS, 0,5 µL av Cu (II) SO4, 0,05 µL av sulfo-Cy3-natriumazid, 5 µL natriumaskorbat.
- Sätta 50 μL av etikett blandningen på en bit av parafilm. Lyft täckglaset med hjälp av ett par pincett och en nål och låt den vila ovanpå etikett mixen, med ytan som innehåller celler nedåt. Se till att det finns inga bubblor och att hela ytan av täckglaset vidrör etikett mixen. Inkubera i 30 min i mörker.
- Sätta cellerna tillbaka i brunnarna Skyltens 24-väl och tvätta dem tre gånger med PBS.
- Montera med montering medier (inklusive DAPI för att visualisera atomkärnor) på objektglas och låt dem torka över natten.
- Visualisera EdU inkorporeringen med fluorescerande Mikroskop. Använda ett filter som är lämpliga för Cy3 (excitation/utsläpp: 552/570 nm).
- Ta flera bilder av celler för senare kvantifiering av minst 100 celler per tillstånd (Cy3 och DAPI).
- Kvantifiera andelen celler som införlivade EdU med hjälp av följande formel:
EdU positiva celler (%) = (EdU positiva celltal (Cy3) / totalt antal blodkroppar (DAPI)) * 100 - Jämföra resultaten av senescent celler kontra deras lämplig kontroll för den behandling som används.
Obs: En samtidig färgning med SA-β-gal på samma prov är möjligt. Överväga att cellerna fortfarande bör vara seedad på coverslips.
- Genuttryck p16, p21 och SASP
- Förbereda primer-uppsättningar av gener av intresse (50 µM varje primer).
Obs: En qPCR av p16, p21 och några relevanta SASP faktorer är informativ åldras status. Protokollet beskrivs här gör användning av universell Probe bibliotek (UPL) systemet för relativ kvantifiering med en realtid-PCR. Tabell 3 visar en översikt över primers används för detektion av CDK-hämmare p16 och p21 och de mest relevanta SASP medlemmarnas samt för Tubulin och aktin, som tjänar som referens gener för analysen. Den sista kolumnen i tabell 3 anlitar särskilda UPL sonden som ska användas för varje analys. - Förbereda separat qPCR reaktionsblandning för önskad analyserna. Inkludera alltid Referensgenen samt enligt tabell 4.
- Köra alla prover i två eller tre exemplar.
- Ladda 7,5 µL per brunn av qPCR reaktion mixen på en plattan med 384 brunnar.
- Lägg till ~ 5 ng av cDNA upplöst i 2,5 µL RNase-gratis vatten.
Obs: Det är bättre att ha liknande belopp av cDNA för alla prover ska jämföras. Detta kan uppnås med hjälp av lika mängder RNA för omvänd Transkription. - Täcka plattan med en tätning och se till att det fastnar korrekt täcker jämnt alla brunnarna på plattan.
- Snurra på plattan vid 2000 x g i 1 min.
- Kör plattan i Lightcycler i 40 cykler med följande protokoll:
95 ° C under 7 min
40 cykler av 95 ° C för 5 s och 60 ° C under 30 s
37 ° C i 1 min - För analys av resultaten, använda den metod som föreslås för Livak och kollegor för att analysera qPCR data24. Använd antingen Tubulin eller aktin som referens gener att beräkna ΔCt värde och använder lämplig kontroll för att beräkna den ΔΔCt värde för den särskilda behandlingen som åldras-inducerande.
- Förbereda primer-uppsättningar av gener av intresse (50 µM varje primer).
- Proteinuttryck och utsöndring av IL6
- Utsäde 5 – 10 x 104 celler i minst en väl 6-well platta (5.2 – 10,5 x 103 celler/cm2) per skick innehållande 2 mL D10. Behandlingar (i tillämpliga fall) kan utföras direkt på denna platta eller, alternativt celler behandlas redan kan vara åter seedade till en 24-bra platta. Låt den stå över natten efter sådd.
- Ta bort mediet och ersätta för 2 mL DMEM medium utan FBS. Inkubera under normala förhållanden för 24 h.
- Samla in mediet i en 15 mL tub.
- Centrifugera provet vid 300 x g i 5 min. Medium kan lagras vid-80 ° C tills bearbetas.
- Följ tillverkarens instruktioner för att utföra ELISA.
- Jämföra resultaten av senescent celler kontra lämplig kontroll för den särskilda behandlingen som åldras-inducerande
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anrikning av SA-β-gal färgning i senescent fibroblaster
Β-galaktosidas (β-gal) är en lysosomala enzym som uttrycks i alla celler och som har en optimal pH 4.025,26. Dock under åldras, lysosomer ökar i storlek och följaktligen senescent celler ansamlas β-gal. Den ökade mängden detta enzym gör det möjligt att upptäcka dess aktivitet även vid en suboptimal pH 6,025,27. Figur 1A visar representativa bilder av SA-β-gal färgningen i frodas kontra senescent primära fibroblaster. Cellerna ser också utvidgat och med en oregelbunden cellkroppen. Som nämnts, kan det vara svårt att särskilja enskilda celler, så att en samtidig färgning med DAPI underlättar visualisering och cell räknar (figur 1B). Det är nödvändigt att ta bilder i fluorescens Mikroskop för att kunna observera DAPI färgningen. Detta innebär att bilder på ljusa fältet kanal tas i svartvitt, så att den ”blå” färgning av SA-β-gal visas svart på bilderna. Notera är inte alla celler i ett prov positivt för β-gal. Effektiviteten i åldras induktion är starkt beroende av stimulans- och cell typ/stammen används. De protokoll som beskrivs här gav > 50% β-gal positiva celler i primära fibroblaster (BJ och WI-38) i våra händer.
Färre celler införliva EdU efter induktion av åldras
EdU är en analog till den nukleosid tymidin som, under aktiv DNA-syntes, kommer att införlivas i den DNA-28. Införlivandet av EdU i DNA kan visualiseras efter utföre den Copper-Catalyzed natriumazid-alkynen cykloadditionen (CuAAC) till EdU, reaktion som inte kan utföras i regelbundna tymidin eftersom det saknar de alkynen grupp28. I detta särskilda protokoll används en Sulfo-Cy3-natriumazid. Om kopplingen av natriumazid till alkynen har ägt rum, visas celler fluorescens under ett Cy3 filter (figur 2A). Det är viktigt att beakta att celler som breder genom att utföra EdU inkorporering analysen, kan särskiljas från icke-frodas celler. De icke-frodas cellerna kan vara antingen quiescent eller senescent, menande som EdU inkorporering analysen inte kan diskriminera mellan dessa två typer av cellcykelarrest.
Senescent fibroblaster upregulate CDK hämmare p16 och p21
Senescent celler göra använda av hämmare av CDKs för att stoppa cellcykeln29. Särskilt p16 och p21 mäts ofta som markörer för senescent celler3. Antingen en eller båda markörer är normalt uppreglerad i senescent celler och uppreglering mäts ofta på transkriptionell nivå. Det uppmuntras att använda båda markörer samtidigt eftersom vissa celler gör inte upregulate p16 på transkriptionell nivå och p21 är en universal men inte specifik markör för åldras15,17,30. Figur 3 visar representativa relativa kvantifieringar av p16 och p21 mRNA i fibroblaster förmås att åldras. Det finns även andra tekniker såsom immunfärgning och/eller western blotting för att påvisa proteinnivåer.
Senescent fibroblaster visas en SASP
Den senescent celler transcriptionally upregulate utsöndras flera gener som kodar för proteiner, ett fenomen som kallas SASP6. SASP inkluderar faktorer involverade i inflammation, t.ex., interleukiner och chemokiner eller i extracellulär matrix (ECM) nedbrytning, t.ex., MMP, men det är mycket heterogen. Induktion av SASP faktorer kan utvärderas genom att mäta antingen mRNA-uttrycksnivåerna via qPCR eller nivåer av utsöndrade proteinet via enzymkopplad Immuno Sorbent Assay (ELISA). Figur 4 visar en representativ bild visar uppreglering av IL6 både på transkriptionell och utsöndrade nivåer. Vi använde IL6 endast som en framställning; men uppmuntras det att mäta flera medlemmar av SASP från listan på protokollet 3.4.
Figur 1: anrikning av SA-β-gal färgning i senescent primära fibroblaster. BJ primära förhud fibroblaster (PD 34,1) förmåddes att åldras genom att utsätta dem för joniserande strålning (10 Gy). Cellerna var färgas för SA-βgal tio dagar efter bestrålning. (A) representativa resultat för SA-βgal färgningen i BJ primära fibroblaster antingen obehandlade (upp) eller utsätts för joniserande strålning (nedåt). Slutliga förstoringen: 100 X. (B) representativ bild av SA-β-gal Co färgas med DAPI för BJ primära fibroblaster antingen obehandlade (tre vänster paneler) eller utsätts för joniserande strålning (tre rätt paneler). Den DAPI färgning (blå) hjälper till att visualisera enskilda celler att underlätta kvantifiering. Bilder tagna på ljusa-fältet visas i svartvitt. Därför i dessa särskilda bilder SA-β-gal ser färgning ut svart perinukleära ställen. Slutliga förstoringen: 100 X. (C) kvantifiering av SA-β-gal positiva celler i prolifererande (Prol., vit) BJ fibroblaster kontra joniserande bestrålade-behandlade motsvarigheter (senatorn, blå). Kvantifiering utfördes med hjälp av tre biologiska replikat med felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Statistisk signifikans bestämdes av en oparade tvåsidiga Students t-test på delta-CT-värden. (n = 3, ± SEM, *** = p värdet < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: färre celler införliva EdU efter induktion av åldras. (A) representativ bild för EdU inkorporering analysen i prolifererande WI-38 fibroblaster PD 43.86 (vänster) och deras joniserande bestrålade motsvarigheter (höger). Slutliga förstoringen: 100 X. (B) kvantifiering av EdU positiva celler i prolifererande (Prol., vit) BJ fibroblaster (PD 38,7) kontra motsvarigheterna bestrålade (senatorn, blå). Kvantifiering utfördes med hjälp av tre biologiska replikat med felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Statistisk signifikans bestämdes genom en oparade tvåsidiga Students t-test på delta-CT-värden (n = 3, ± SEM, *** = p värdet < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Senescent fibroblaster upregulate CDK hämmare p16 och p21. (A) kvantifiering av p16 mRNA uttryck i prolifererande (Prol., vit, PD 35,3) eller 5-aza-behandlade BJ celler (senatorn, blå). (B) kvantifiering av p21 mRNA uttryck i prolifererande (Prol., vit, PD 35,3) eller 5-aza-behandlade BJ celler (senatorn, blå). Kvantifiering utfördes med hjälp av tre biologiska replikat (var och en med två tekniska replikerar) med felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. Statistisk signifikans bestämdes genom en oparade tvåsidiga Students t-test på delta-CT-värden (n = 3, ± SEM, *** = p värdet < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Senescent fibroblaster visas en sekretoriska fenotyp (SASP). (A), kvantifiering av IL6 mRNA uttryck i BJ fibroblaster antingen frodas (Prol., vit, PD 38,7) eller inducerad att åldras av joniserande strålning (senatorn, blå). (B) kvantifiering av IL6 proteinuttryck i prolifererande PD 38,6 (Prol., vit) eller behandlats med joniserande strålning WI38 fibroblaster (senatorn, blå). Kvantifiering utfördes med hjälp av tre biologiska replikat med felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet. När det gäller qPCR data hade varje biologisk replikat två tekniska dubbletter. Statistisk signifikans bestämdes genom en oparade tvåsidiga Students t-test på delta-CT-värden (n = 3, ± SEM, *** =p värdet < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Spädningsvätska | Stamlösning | Fungerande lösning | Utspädning för behandling | Slutlig koncentration | |
| SAHA | DMSO | 100 mM | 1 mM | 1:1,000 | 1 ΜM |
| Natrium butyrate | Sterilt vatten | --- | 1 M | 1: 250 | 4 mM |
| 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza) | DMSO | 100 mM | 10 mM | 1:1,000 | 10 ΜM |
Tabell 1: Lager och arbetar lösningar för de olika behandlingar som används för epigenetiskt-inducerad åldras.
| Komponent | Volym | Slutlig koncentration |
| 20 mg/mL X-gal | 1 mL | 1 mg/mL |
| 0,2 M citronsyra, natrium fosfatbuffert ph 6.0 | 4 mL | 40 mM |
| 100 mM kaliumferrocyanid | 1 mL | 5 mM |
| 100 mM Kaliumferricyanid | 1 mL | 5 mM |
| 5 M natriumklorid | 0,6 mL | 150 mM |
| 1 M magnesiumklorid | 0,04 mL | 2 mM |
| Vatten | 12,4 mL | - |
| Totalt | 20 mL |
Tabell 2: Sammansättning av färgning lösningen används för åldras associerade (SA) - β - gal färgning.
| Mål | Vidarebefordra Primer (5'--> 3') | Reverse Primer (5'--> 3') | UPL sond | ||
| Tubulin | CTTCGTCTCCGCCATCAG | CGTGTTCCAGGCAGTAGAGC | #40 | ||
| Aktin B | ccaaccgcgagaagatga | ccagaggcgtacagggatag | #64 | ||
| P16 | GAGCAGCATGGAGCCTTC | CGTAACTATTCGGTGCGTTG | #67 | ||
| P21 | tcactgtcttgtacccttgtgc | ggcgtttggagtggtagaaa | #32 | ||
| IL6 | CAGGAGCCCAGCTATGAACT | GAAGGCAGCAGGCAACAC | #45 | ||
| IL8 | GAGCACTCCATAAGGCACAAA | ATGGTTCCTTCCGGTGGT | #72 | ||
| IL1a | GGTTGAGTTTAAGCCAATCCA | TGCTGACCTAGGCTTGATGA | #6 | ||
| CXCL1 | CATCGAAAAGATGCTGAACAGT | ATAAGGGCAGGGCCTCCT | #83 | ||
| CXCL10 | GAAAGCAGTTAGCAAGGAAAGGT | GACATATACTCCATGTAGGGAAGTGA | #34 | ||
| CCL2 | AGTCTCTGCCGCCCTTCT | GTGACTGGGGCATTGATTG | #40 | ||
| CCL20 | GCTGCTTTGATGTCAGTGCT | GCAGTCAAAGTTGCTTGCTG | #39 | ||
| PAI1 | AAGGCACCTCTGAGAACTTCA | CCCAGGACTAGGCAGGTG | #19 | ||
| MMP1 | GCTAACCTTTGATGCTATAACTACGA | TTTGTGCGCATGTAGAATCTG | #7 | ||
| MMP3 | CCAGGTGTGGAGTTCCTGAT | CATCTTTTGGCAAATCTGGTG | #72 | ||
| MMP9 | GAACCAATCTCACCGACAGG | GCCACCCGAGTGTAACCATA | #53 | ||
Tabell 3: Primer sekvenser och deras motsvarande UPL sonden för att påvisa mRNA av åldras markörer i prover från människor.
| Komponent | Volym/sample |
| Sensifast sond Lo-Rox mix | 5 ΜL |
| Primer-set (50 µM) | 0.1 ΜL |
| UPL sond | 0.1 ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | 2.3 ΜL |
| cDNA (~ 4 ng) | 2,5 ΜL |
| Totalt | 7.5 ΜL |
Tabell 4: Sammansättning av qPCR reaktionen blanda för UPL-systemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protokoll som förklaras här var optimerad för mänskliga primära fibroblaster, särskilt BJ och WI-38 celler. Protokollen för replikationsförmåga åldras, joniserande strålning och doxorubicin, har tillämpats framgångsrikt på andra typer av fibroblaster (HCA2 och IMR90) och i andra celltyper (nämligen neonatal melanocyter och keratinocyter eller iPSC-derived hjärtmuskelcellerna) i vårt laboratorium. Anpassningar för ytterligare celltyper kan dock optimeras genom att justera vissa detaljer som antalet seedade celler, metoder och kemikalier att hjälpa cellerna för fästa/demontering till plast stöder och doseringen av behandling för att undvika toxicitet.
Även användningen av primära fibroblaster innebär ett antal utmaningar. Senescent celler är vanligtvis svårare att lossa än sina prolifererande motsvarigheter, och de är ofta mer känsliga för trypsinization eller någon annan typ av demontering metod, vilket innebär att lönsamheten efter demontering är något lägre än för prolifererande celler. Valet av lämplig kontroll för de olika metoderna som åldras-inducerande är svårt. Exempelvis för de drog-baserade behandlingarna såsom doxorubicin, föreslår vi en kort behandling med fordonet: PBS för 24 h vid kontrollproverna för doxorubicin-behandlade celler följt av omedelbar skörd/bearbetning. Det kan hävdas att cellerna att åldras genomgår en utökad kulturtid efter behandling tillämpades (sex extra dagar av kultur för doxorubicin-behandlade celler) och att kontroll celler bör odlade lika mycket tid efter avlägsnande av PBS. Dock sådan lång kultur skulle tillåta cellerna att dela vidare, att bli alltför konfluenta eller att kräva ytterligare passaging och att öka PD. över sammanflödet kan orsaka åldras markörer, såsom SA-β-gal visas trots celler att upprätthålla sin prolifererande potentiella31. Den ökade PD skulle få dem närmare till sin replikering gräns (och replikationsförmåga åldras) och göra dem mindre jämförbar med motsvarigheterna behandlade med doxorubicin. En liknande situation skulle gälla för andra behandlingar. Vi har föreslagit de kontroller som vi anser vara mer lämpliga för varje fall.
De flesta av de tekniker som används för att framkalla celler in åldras verkar relativt enkel och rättfram, men många faktorer kan påverka resultatet av experimenten. Exempelvis är normal glukos koncentration av konventionella cell Odlingsmedier för fibroblaster 4,5 g/L. Dock för vissa celltyper som stamceller förlänga lägre koncentrationer av glukos deras proliferativ potentiella32, medan för andra högre koncentrationer kan leda till för tidigt åldrande33. Dessutom som senescent celler är mycket metabola och spenderar stora mängder energi för att producera utsöndrade faktorer34, kan andra åldras-associerade fenotyper påverkas av svängningar i glukos koncentrationer.
En annan potentiell variabel i cellodlingsmedium är serum. Sammansättningen av serumet definieras normalt inte och varierar beroende på djur källan och batchen. Särskilt, kan mängden tillväxtfaktorer och pro-inflammatoriska proteiner påverka åldras35. Vi rekommenderar att samma parti av serum används för hela experimentet för att undvika onödig och störande variabilitet. Ändå kan vissa oundvikliga tekniska villkor såsom användning av serumfritt medium som används för vissa ELISA-baserade protokoll minska SASP uttryck.
Syre spänning är viktigt för komplett åldras induktion. Hypoxi kan hämma geroconversion, så att celler inte föröka inte men oåterkalleligt greps36. Det vanligaste problemet i experimentell setup är dock inte hypoxi utan hyperoxia. Ja, standard odlingsbetingelser använder ofta 20% syre som ”normoxia”, men fysiologiska förhållanden för de flesta celltyper är lägre. Mus blastocyster presentera markörer för åldras (SA-βgal och DNA-skada) när odlade på 20% syre, till skillnad från deras in-vivo-härrör motsvarigheter eller samma celler odlade på 5% syre37. Dessutom odlade mus fibroblaster på mer fysiologiska förhållanden (3% syre) och inte på konventionella ettor (20% syre) display en SASP38. Här använde vi 5% syre för alla kulturer och experiment och vi uppmanar forskare att ompröva de syrehalter används för viss celltyp av intresse.
En annan faktor att beakta är slutligen senescent celler inneboende heterogenitet. Å ena sidan visar olika celltyper och även cell stammar skillnader i åldras-associerade fenotyper. Exempelvis gör vissa stammar av fibroblaster inte upregulate p16 på transkriptionell nivå vid åldras induktion15,16,17, som det också visas i figur 3A, där trots ser en uppreglering av P16, detta var inte statistiskt signifikant. P16 kontrolleras även på translationell och post-translationella nivå, så mäta proteinnivåer kan i vissa fall påvisa en ökad aktivitet av denna CDK-hämmare. Det kan dock vara att vissa celler helt enkelt lita på andra CDK-hämmare som p21. Vi rekommenderar att mäta transkriptionell nivåerna av dem båda. Den exakta sammansättningen av SASP beror också på cellen som producerar det3. Dessutom uttrycker vissa celler konstitutivt höga nivåer av β-galaktosidas, ger ett positivt resultat för SA-β-gal färgning som inte är nödvändigtvis ett tecken på åldrande3. I vissa fall kan problemet lösas genom att minska inkubationstiden med färglösningen under SA-β-gal färgning protokollet. Som nämnts, kan över konfluenta celler också fläcken med SA-β-gal utan dem är senescent31, så vi uppmanar forskare att odla celler glest för att utföra denna färgning. Däremot, är åldras fenotypen själv inte stabil39. Sammansättningen av SASP och uppkomsten av andra markörer för åldras är tidsberoende17,40. Här har vi föreslagit tidpunkter efter varje behandling där celler anses fullt senescent och det används rutinmässigt i vårt laboratorium. Ännu viktigare, kan mäta markörer vid en kortare tid göra negativa resultat på grund av ofullständig åldras40. Dessutom eftersom i de flesta av behandlingarna som en procentandel av celler inte blir senescent, kan använder en längre tidpunkt ge tillräckligt med tid för några icke-senescent cellerna att expandera och köra om kulturen, minskar uttrycket av senescent markörer. Över heterogena senescent celler och de flera varningar av olika markörer, rekommenderar vi varmt att forskare att använda flera åldras markörer inom samma prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EJ TILLÄMPLIGT
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Demaria lab för givande diskussioner och Thijmen van Vliet för att dela data och protokollet om den UV-inducerad åldras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM Media - GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
