Summary
בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.
Abstract
נקבות יונקים מעת לעת הביוץ הוא מספר כמעט קבוע של oocytes במהלך כל מחזור ייחום. כדי לקיים כזה בהתמדה ובהחלטיות, תקופתיות, רגולציה מתרחש ברמת הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים והן על פיתוח זקיקים בשחלה. למרות מחקרים פעילים, מנגנוני התפתחות זקיק אינם ברורים בשל מספר הצעדים הכרוכים מהפעלה זקיק הקדמוני רדום עד הביוץ, ובשל במורכבות הרגולציה השונה בכל אחד מהשלבים הזקיקים. כדי לחקור את מנגנוני התפתחות זקיק, ואת הדינמיקה של זקיקים במהלך מחזור ייחום, פיתחנו מודל תרביות רקמה השחלות העכבר יכול לשמש כדי לבחון התפתחות זקיק באמצעות מיקרוסקופ. זקיק שיטתית, כתב-העת ביוץ ופיתוח זקיק בהכנת כל מגורמיה במודל השחלה בתרבית, התנאים תרבות יכולה להיות מאופנן השפעול. . הנה, נדגים את התועלת של שיטה זו של לימוד מנגנוני הרגולציה של התפתחות זקיק ושאר התופעות השחלות.
Introduction
העכבר הנשי השחלות מכילות אלף זקיקים מספר1ולאחר הביוץ תקופתיים מבשיל כ 10 oocytes-בכל מחזור ייחום. זקיקים מסווגים לתוך מספר שלבים התפתחותיים: הבראשיתי, ראשי, משני, antral, ו Graafian זקיקים, תלוי בצורת שכבה תאית granulosa המקיפה כל oocyte. רוב הזקיקים הקדמוני רדום, חלקם מופעלים ולגדול לתוך ראשי זקיקי-כל מחזור ייחום2. לאחר שלב הזקיקים המשני, התפתחות זקיק מוסדר בעיקר על ידי gonadotropins, הזקיקים מגרה הורמון (FSH), הורמון מחלמן (LH). עם זאת, התפתחות זקיק הקדמוני, ראשי היא עצמאית של גונדוטרופין, מנגנוני הרגולציה המפקחים על השלבים האלה נשארים גרוע inderstood3,4,5. בנוסף, גורמי גדילה והורמונים זקיק הקדמוני, ראשי מוסדר על ידי האינטראקציות בין זקיקי6,7. לכן, עלינו לבצע ניתוחים של זקיק dynamics ברקמות השחלה העכבר, חקרה את מנגנוני הרגולציה המשויך שימוש בתרביות רקמה השחלות8,9,10.
במסמך זה, נסקור שתי שיטות דגם השחלות תרביות רקמה. הראשון משמש כדי לנתח זקיק פיתוח על ידי מדידה של אזורים הזקיקים, והשני משמש כדי ללמוד את מנגנון רגולטורי במהלך התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים לשלב זקיק משני עם העכברים הטרנסגניים. לצורך ניתוח התפתחות זקיק, בעיקר השתמשנו השחלות של עכברים נקבה 4 - בן שבועיים כי הם מאפשרים קל ויזואליזציה של זקיקים. לזירוז ביוץ תקופתיים ופיתוח מודל ויוו זקיק, אנחנו לשכפל מנחשולים LH ו ביוץ שנצפה זקיק בהכנת, הפרשת אסטרדיול בתנאים תרביות רקמה. תמונות של השחלות בתרבית נלכדו, תהליכי התפתחות של זקיק נותחו על ידי מעקב אחר שינויים באזור הזקיקים. אולם, בניתוח מיקרוסקופיית שדה בהיר, ההבחנה בין הקדמונים ותחילת זקיקים העיקרי היה לא ברור. לכן, פיתחנו שיטת עבודה זקיקים קטנים, ויוכל להבדיל בין הבראשיתי, העיקרית, ותרבותית זקיק המשני של רקמות השחלות באמצעות Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9, השחלות העכברים הטרנסגניים R26-ויזת עבודה H2B-mCherry ימים 0 ו- 4 אחרי הלידה11. הביטוי Oog1 לזיהוי ב oocytes לאחר כניסתו מיוזה, והוא עולה בהדרגה עם התפתחות זקיק, המאפשר התבוננות המעבר הבראשיתי זקיקים הראשי באמצעות תמונות בצילום מואץ של רקמת השחלה בתרבית11 ,12. למרות בשיטות מורפולוגיות שימשו ללמוד הגורמים המפעילים הקדמוני זקיקים רדומים13,14,15,16, התפתחות זקיק פיזיולוגיים של השחלות הוא קשה לצפות, ולהישאר ההשפעות של גורמים שונים uncharacterized. השיטות תרבות נוכח נועדו כתובת זו במחסור בזמן אמת בניתוח הגורמים היעד.
במחקר הנוכחי, אנו מעקב אחר התפתחות הזקיקים באמצעות שיטת הדמיה בצילום מואץ, שאפיינה את תהליך התפתחות זקיק. השיטות הרומן שלנו מציעים כלי חסר תקדים עבור חוקר הפיזיולוגיה של השחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
עכברים שוכנו בחדר לסביבה מבוקרת על 23 ±1 ° C עם 12 שעות אור/12 h מחזור כהה. פרוטוקולי טיפול בבעלי חיים, ניסויים נערכו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים-איצ'י הרפואי האוניברסיטאי, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים היוצא ועל שימוש הוועדה.
1. הכנת תרבות בינוני ומנות
- כדי להכין בינוני תרבות בסיסיים, להוסיף סרום שור עוברית (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 מו/mL), ו פניצילין-סטרפטומיצין (פניצילין, 100 U/mL; סטרפטומיצין, 100 מ"ג/מ"ל) אלפא בינוני חיוני מינימלי (MEM-אלפא), לערבב צינורות 50 מ ל.
הערה: כרכים הכולל של מדיה תרבות הנדרשים משתנים בין ניסויים, אבל 1 מ"ל של תרבות בינוני מספיקה בדרך כלל 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות. - שופכים 1 מ"ל aliquots מעורב בינוני תרבות לתוך 3.5 ס"מ זכוכית-התחתון תרבות מנות וקבע במקום 30 מ מ תא תרבות מוסיף לתוך מנות. לחמם מדיה ומנות בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס).
2. הכנת רקמות השחלה
- פוספט חם מראש buffered תמיסת מלח (PBS) (−) ו MEM-אלפא המכילה 5% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין בתוך אינקובטור (5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס).
הערה: לגבי 3 מ"ל aliquots של PBS (−) לאדם שחלה מספיק לשימוש במהלך ניתוח שחלה הינם 1 מ"ל aliquots של מאמ-אלפא מספיקים עבור אחסון ארעי של השחלות בודד במנות 3.5 ס"מ. -
בלו השחלות של עכברים ICR (על שם אחרי המכון לחקר הסרטן) נקבה 4 - בן שבועיים, לקצץ את הרקמות הסובבות את השחלה באמצעות פינצטה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי ומספריים. להזמין את השחלות שהוסר במדיום תרבות (ראה שלב 2.1) עד השימוש.
- מקום בודד שחלות על גבי נייר סינון בסוידיש מראש חימם PBS (−) (ראה שלב 2.1) פרוסה לחתיכות 4 באמצעות סכין מיקרוטום תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
הערה: השחלות של עכברים ICR 4 - בן שבועיים הן בערך 2 מ מ קוטר. מספר חתיכות תלוי בגודל השחלה; עם זאת, כ-500 מיקרומטר חתיכות עבות לאפשר זקיק נאות תצפיות (בחלקים עבה יותר 500 מ מ, שקיפות הרקמות הוא ירד; בחתיכות דק יותר 500 מ מ, זקיקים רבים antral הם שבור ואיבד). - לאחר ניתוח, למקם את דגימות השחלה הפרוס בינוני תרבות ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ (ראה שלב 2.1).
- מקום בודד שחלות על גבי נייר סינון בסוידיש מראש חימם PBS (−) (ראה שלב 2.1) פרוסה לחתיכות 4 באמצעות סכין מיקרוטום תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.
3. השחלה תרביות רקמה
- זרוק כ 0.5 µL של תרבות בינוני לכל פרוסים רקמות השחלה על תותב התרבות התא שבו רקמת השחלה יהיה להגדיר משתמש של micropipette.
- למקם את הדגימה הפרוס בכל טיפה של תרבות בינוני על התוספות התרבות התא באמצעות פינצטה.
- תרבות רקמות השחלה 5% CO2 ב 37 º C.
- החלף המדיום תרבות בינוני ומחוממת מראש טרי כל יומיים.
הערה: לוח הזמנים עבור שינויים בינונית עבור התרבות של השחלה מקטעים של עכברים ICR 4 - בן שבועיים מוצג באיור1.- כדי להתרבות גל LH, פנקו בתרבית השחלות עכברים ICR 4 - בן שבועיים עם המדיום המכיל 100 מו/mL FSH ו- LH במשך 12 שעות מדי 4 ימים (איור 1).
4. מיקרוסקופ תמונות של השחלות בתרבית
- להתחיל הדמיה השחלות בתרבית לאחר יום 1 כאשר הרקמות יש דבקה על התוספות התרבות תאים, ולבצע ניתוחים מיקרוסקופ קונפוקלי או הפוך במרווחי 24 שעות כדי לאפשר מספיק זקיק צמיחה בין נקודות זמן.
הערה: מיקרוסקופיה קונפוקלית עדיפה מיקרוסקופ הפוכה להתבוננות זקיקים של השחלות לגמרי בתרבית.
5. זמן לשגות הדמיה של השחלות בתרבית
-
למטב את התנאים הדמיה בצילום מואץ, כולל עוצמות לייזר ו פעמים חשיפה, עבור מערכת הדמיה (טבלה 1).
- בחר השחלה לזווג דגימות עכברים יחיד לשימוש כקבוצות טיפול ובקרה. משתנים בעוצמות לייזר וזמן חשיפה כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר (טבלה 1).
- השווה זקיק צמיחה תחת כל תנאי התרבות על ידי מדידת תחומים זקיק בתמונות של דגימות הבקרה במרווחי זמן 24 שעות זמן לשגות דגימות הדמיה (ראה שלב 6). במקביל, לספור את מספר oocytes ovulated בערכת כל השחלה ובחרו את תנאים אופטימליים הדמיה בצילום מואץ.
- לכידת תמונות במרווחי 30 דקות באמצעות מערכת הדמיה בצילום מואץ בכפוף לתנאים נחוש (טבלה 1).
6. זקיק צמיחה ניתוח
-
כדי לנתח את הפיתוח זקיק, למדוד את האזורים זקיק של תמונות שנלכדו באמצעות תוכנת ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- בתחילה, להגדיר את קנה המידה של התמונה על ידי לחיצה על "הגדרת סולם" תחת 'נתח' בסרגל כלי. הזן את אורכי בצד בתמונה שנלכדה והמספרים התואמים של פיקסלים בשדות הריקים של "מרחק ידוע", "מרחק בפיקסלים", בהתאמה.
- לחץ על "יד חופשית" בסרגל כלי ומיתאר הזקיקים של תמונות שנלכדו שדה בהיר.
- לחץ על "מדד" תחת 'נתח' בסרגל כלי.
הערה: אם נתוני מדידה אחרים הם הרצויה, לחץ על "מדידה קבע" תחת 'נתח' בסרגל כלי ובדוק בתיבות המתאימות ברשימה.
7. ניתוח התפתחות זקיק באמצעות העכברים הטרנסגניים
- לאסוף השחלות כמחנכת ימים 0 ו- 4 (P0, P4) נקבה העכברים הטרנסגניים המכיל transgenes Oog1pro3.9 R26-ויזת עבודה H2B-mCherrואת תרבות על הוספת כפי שמתואר צעדים 1.1 – 3.2, חוץ מזה לא פרוסה P0, P4 השחלות.
- החלף את המדיום תרבות בינוני טריים, ומחוממת מראש במנות 3.5 ס"מ בתוך אינקובטור המכילה 5% CO2 ב 37 ° C כל יומיים.
הערה: הריכוז של LH במדיום תרבות P0, P4 השחלות יכול להישאר קבוע בגלל עליות LH לא מתרחשות בעכברים P0, P4. - הגדר את המיקרוסקופ להמחיש רק AcGFP1-חיוביות זקיקים העיקרי P4 בתרבית השחלות (טבלה 1).
הערה: רק הקדמוני, ראשי זקיקי נמצאים P4 העכבר הנשי השחלות. - לכידת תמונות של P0 בתרבית Oog1pro3.9/R26-ויזת עבודה H2B-mCherry השחלות העכברים הטרנסגניים במרווחים של 30 דקות שימוש את ההגדרות המשמשות P4 השחלות (ראה שלב 5.2).
- לאתר ולנתח זקיק פיתוח באמצעות אותות AcGFP1, ויזת עבודה H2B-mCHerry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג את הפרוטוקול עבור השינויים בתקשורת במהלך השחלות תרביות רקמה. בעקבות תוכנית זו, בת 4 בשבוע ICR עכברים השחלות תרבותי, עם תמונה במרווחי 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 2). במהלך תרבות של רקמות השחלה למשך 3 שבועות, זקיקים antral ומשני ביותר היו מנוון מאת בהכנת זקיק, חלקם היו ovulated (איור 2D ו לטבלה 2). בניתוח של זקיק אזורים באמצעות ImageJ (איור 3), פיתח כמה זקיקים בקבוצות במהלך כל מחזור מנחשולים LH (איור 3B ו- 1 הסרט משלים). יתר על כן, הביוץ התרחש כמעט בו זמנית השחלות בתרבית נפרד מן השחלות מימין ומשמאל של עכברים יחיד. ואילו, העיתוי של ביוץ ומספרים של ovulated oocytes (טבלה 2) שונה בין השחלות העכבר (נתונים לא מוצג), הביוץ מן השחלות בתרבית בעיקר אירעה בתוך 48 שעות של עליות LH(איור 3ו- Supplementary סרט 1). עם זאת, לא כל oocytes ovulated שוחרר גופות הקוטב הראשון לאחר הביוץ (איור 2E ו לטבלה 2), למרות ovulated oocytes יכולה להיות מופרית, פיתוח נפסקה ב השלב 4 תאים (נתונים לא מוצג). התירי מנגנון שבאמצעותו הקדמוני זקיקים רדומים מופעלים העכבר השחלות, הבחנו זקיק הקדמוני הפעלה ברקמות בתרבית של העכברים הטרנסגניים נושאת Oog1pro3.9 ו- R26-ויזת עבודה H2B-mCherry (transgenes איור 4, איור 5 והסרט משלים 2). Oocytes אקספרס רמות נמוכות מאוד של הגן Oog1 מן השלב הבראשיתי זקיק, הדמיה בצילום מואץ נבדל זקיקים הקדמוני לבטא AcGFP1 נמוכה גבוהה לבטא AcGFP1 הראשית זקיקי. זקיקים הקדמוני, ראשי נוכחים בו זמנית של השחלות העכבר P4, ואילו רק הקדמונים זקיקים קיימים של השחלות P0 (איור 4A, B). לפיכך, אנו אופטימיזציה זמן לשגות תנאים הדמיה לזהות רק ראשי זקיקים P4 בתרבית השחלות (איור 4C). לאחר מכן, אנחנו בשבי תמונות של השחלות P0 בתרבית למשך 10 ימים בבאותם התנאים (איור 4D-G). AcGFP1 יכול לשמש מדד של זקיקי ראשי אלה העכברים הטרנסגניים והיו זקיקים הראשית AcGFP1-חיוביות לזיהוי של השחלות P0 בתרבית לאחר 30-40 h תרבות (איור 4, איור 5A-F, ו- Supplementary הסרט 2). זקיקים הקדמוני, ראשי של השחלות בתרבית היו מכובדים גם על ידי mCherry-חיוביות הגרעינים של תאים granulosa (איור 5B, E). באופן ספציפי, mCherry אותות מצביעים על צורות של זקיקי ולאפשר התבוננות זקיק שלבים של השחלות בתרבית (איור 5B, E, ו- H). לכן, מערכת תרבות זו באמצעות השחלות מ Oog1pro3.9/ עכבריםR26-ויזת עבודה H2B-mCherry חשף את התהליך של התפתחות זקיק מוקדמת מ הבראשיתי כדי זקיק משני שלבים. שיטות אלה יקל על מחקרים של מנגנוני הרגולציה של התפתחות עצמאית גונדוטרופין זקיק.
איור 1 : כמובן זמן של שינויים בינונית. א בינוני מכיל 5% FBS, 100-mU FSH, LH 10-mU, פניצילין 100-U/mL ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין MEM-אלפא. בינוני B מכיל 5% FBS, 100-mU FSH, LH 100-mU, פניצילין 100-U/mL ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין MEM-אלפא. בינוני B שימש כדי לייצר LH עליות בכל 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תמונות של רקמות השחלה בתרבית. תמונות נלכדו במרווחי 24 שעות ביממה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. (א) תרבות יום א'; (B) תרבות יום 5; (ג) תרבות יום 10; (ד) תרבות יום 13; (E) Magnified תמונה של האזור שצוין על-ידי הריבוע ב (ד); oocytes ברה היו ovulated מן הזקיקים המסומנים על ידי חצים ב B, C וד Oocyte (F) משחררים גוף קוטב לאחר הביוץ; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : מדידות של זקיק באזורים השחלות בתרבית. (א) התמונה של השחלה מתורבתות; קווים מנוקדים לייצג את האזור נמדדת ImageJ. (B) באזורים הזקיקים בשחלה בתרבית לאחר 3 שבועות; קווים אפורים לייצג את תקופת תרבות בין התוספת של 100 מ מ LH (LH גל). קווים להציג את שלבי ההתפתחות בכל זקיק בשחלה מתורבתות; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Hematoxylin אאוזין (H & E) צביעת תמונות של השחלות P0, P4 והדמיה זמן לשגות. (א) H & E מכתים של השחלה P0; (B) H & E מכתים של השחלה P4; (ג) תמונה של השחלה P4 מכל עכבר הטרנסגניים Oog1pro3.6 לאחר 10שע תרבות. החץ מראה זקיק ראשוני של AcGFP1-חיוביות. (D-G) תמונות של השחלות P0 מן העכברים הטרנסגניים לבטא Oog1pro3.9 ו- R26-ויזת עבודה H2B-mCherry; אותות ירוק ואדום ב D ו- F מייצגים AcGFP1, mCherry, בהתאמה. לבן אותות ב E ו- G מייצגים AcGFP1 ב D ו- F, בהתאמה. E ו- D הם תמונות של השחלות בתרבית לאחר 0.5 h תרבות. F ו- G להראות שחלות לאחר 180 h תרבות; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תמונות של זקיקים הקדמוני, והמשניים של השחלות בתרבית מ oog1pro3.9/R26-ויזת עבודה H2B-mCherry עכברים. (A–C) תמונות של זקיקים הקדמוני של השחלות P0 מתורבתות; (נד–) תמונות של ראשי זקיקי השחלה בתרבית P0; (HG–) תמונות של זקיקי המשני של העכבר בת 4 שבוע תרבותי השחלות. A, D, ו- G הם התמונות הממוזגות של B, C, E, F, ו- H ואני, בהתאמה. גרין, AcGFP1; . רד, mCherry; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מיקרוסקופ | המטרה עדשה | לייזר | חשיפה (ms) | רווח | מרווח זמן | z-מחסנית | אחרים | ספרות וסרטים |
| CV1000 | X10 | 488 ננומטר: 30, 561 nm: 20 | 488 ננומטר: 700, 561 nm: 600 | 488 ננומטר: 90, 561nm: 20 | 30 דקות | 5 מ מ | איור 4C-G, סרט 1 ו- 2 | |
| BZ-X700 | X20 (עם צווארון אוסף) | 40% | אוטומטי | X4 | 30 דקות | 10 מ מ | binning 3 x 3 | הסרט 3 |
| LSM710 | X10 | 488 ננומטר: 6%, 564 nm: 5% | מצלמת מהירות: 4 | 488 ננומטר: 850, 564 nm: 850 | h 24 שעות ביממה | 10 מ מ | דיגיטלי לזכות, 488 ננומטר: 2, 564 nm:1 | איור 2, 3 ו-5 |
טבלה 1: זמן לשגות הדמיה תנאים. תנאי הדמיה בצילום מואץ מיקרוסקופ קונפוקלי ובהיר שדה.
| שחלה לא. | המספר של סה כ oocytes ovulated | מספר MII oocytes |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
בטבלה 2: מספר oocytes ovulated בתרבית השחלות. מספרים של oocytes ovulated מן השחלות בתרבית 12; MII מציין את מספר oocytes ovulated שפורסמו גופות הקוטב הראשון לאחר הביוץ.
משלים סרט 1: הסרט בצילום מואץ של השחלה בתרבית. השחלות היו שנאספו עכברים 4 - בן שבועיים, ולא היו פרוסים, תרבותי למשך 3 שבועות. הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 0-200 h 10 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
2 הסרט משלים: הסרט בצילום מואץ השחלה P0 בתרבית של עכבר. גרין, AcGFP1; . רד, mCherry. הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 0-180 h 10 מסגרות/ס אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
הסרט משלים 3: הסרט בצילום מואץ השחלה בתרבית של עכבר בן 4 בשבוע. גרין, AcGFP1; אדום; mCherry; הסרט משתרע על פני תקופה תרבות של 9-13 ימים תרבות-10 מסגרות/s. החיצים בתמונה הראשונה לציין זקיקים ב בהכנת אשר התרחשו במהלך תרבות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, פיתחנו שתי שיטות חדשות ללימוד פיתוח זקיק של העכבר השחלות. השיטה הראשונה כרוכה תרבות של רקמות הפרוס עכברים בוגרים השחלות ואחריו ניתוח התפתחות זקיק, השנייה כרוכה בשימוש הדמיה בצילום מואץ להמחיש את התפתחות מוקדמת זקיק בשלב גונדוטרופין עצמאית. בעבר, אנחנו להשתמש בשיטת תרביות רקמה השחלה הנוכחי כדי להעריך את ההשפעה של לוקמיה מעכבות פקטור ופרוגסטרון על זקיק פיתוח8,9, ולא הראה כי ההשפעות שלהם משתנות עם שלב הריכוז ואת זקיק. במחקר הנוכחי, פרוסים רקמות השחלה הציג זקיק דינמיקה, המצדיקים עוד ניתוחים של מנגנון התפתחות זקיק השחלות באמצעות מודל זה.
השחלות של עכברים של יותר מ 5 שבועות של גיל מכילים lutea קורפוס הכשילה תצפיות מיקרוסקופיות. לפיכך, בת 4 בשבוע העכבר השחלות עדיפים תצפיות של פיתוח זקיק ו ביוץ, עוקבות מאוחר זקיקים ראשי, משני, antral נבדלים בקלות רבה יותר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. השיטות שלנו מציעים השוואות של ההשפעות של גורמי גדילה וסמים בתקשורת תרבות, בשינויים ניכרת בהתפתחות זקיק בין השחלות שטופלו באופן שונה (איור 3).
העכברים הטרנסגניים המבטאים חלבונים Cre או fluorescein ב oocytes תוארו מחקרים קודמים18,19,20. עם זאת, שלב הזקיקים סיווג תלוי היסטולוגית מאפיינים כולל granulosa תא צורות, מספרים granulosa תא שכבות, אם תאי theca נוצרות. לפיכך, הבחנות בין זקיקי הקדמוני, ראשי עלולה להיות מוגבלת של תצפיות של oocytes לבד. במסמך זה, אנחנו נעשה שימוש העכברים הטרנסגניים המכילות את Oog1pro3.9 ואת R26-ויזת עבודה H2B-mCherry transgenes11,17 והמחש התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים כדי זקיק משני שלבים של השחלות בתרבית. Oog1 הביטוי הופך לזיהוי ב- oocytes במהלך השלב הבראשיתי זקיק, הוא גדל במידה ניכרת בתוך זקיקי העיקרי. לפיכך, עוצמות האות AcGFP1 ב oocytes קשורים עם זקיק הבמה (איור 5), שימשו להתבונן מעברים זקיק הבראשיתי-יסודי (איור 4, 2 הסרט משלים). גרעין התא מוכתמים באדום R26-ויזת עבודה H2B-mCherry העכברים הטרנסגניים (איור 4, השלמה סרט 2ו- 3 הסרט משלים), דבר המאפשר תצפיות של זקיק שלבים לפי המספרים של granulosa תאים ( איור 5). לכן, באופן קולקטיבי השיטות לאפשר ניתוח של זקיק להתפתחות של הקדמונים דרך ביוץ באמצעות Oog1pro3.9/ העכברים הטרנסגנייםR26-ויזת עבודה H2B-mCherry . יתר על כן, מכיוון אפופטוטיים להיפגע בתא כרומטין צפוף, mCherry אותות של זקיקים atretic הם חזקים יותר מאשר אלה של זקיקי שיער רגיל (3 הסרט משלים).
בין דקויות מתודולוגי, עוביים הנכון של רקמות הפרוס נדרשים עבור culturing מוצלח, עם מות תאים מוגברת השחלה הפרוסות עבות מדי, הפסדים גדולים antral זקיקי השחלה הפרוסות דקים מדי. מהירות הצמיחה זקיק היא איטית. לפיכך, קל לאתר ולנתח את התהליך של כל זקיק דרך התבוננות מרווח זמן של 24 שעות ביממה. מיקרוסקופ קונפוקלי נוכח הגדרת, כולל לייזר בעוצמה, מרווח הזמן, הגברה דיגיטלית, תלויות מצב מיקרוסקופ, אך הם קריטיים לשקול בעת קבלת תמונות בצילום מואץ. בפרט, עוצמות לייזר חזק, הרבה פעמים חשיפה נדרשים כדי ללכוד תמונות ברורות, אך יכולים להשפיע על תאים בתרבית. ומכאן, מתינות מהגדרות אלה כדי להימנע phototoxicity הוא קריטי. יכול להיות תרבותי הפרוס רקמות השחלה של עכברים בת 4 בשבוע במשך כ- 4 שבועות, בעוד זקיקי הקדמוני, ראשי להיות נוכח כתוצאה מכך, הם אינם גדלים. לעומת זאת, P0, P4 השחלות יכול להיות תרבותי עבור-10 ימים, במהלכם זקיקים הקדמוני, ראשי להתפתח זקיקי ראשית או משנית, בהתאמה. עם זאת, באזור השחלות P0, P4 בתרבית לא להתפתח זקיקים antral. לכן, הכריתה של השחלות נדרשת בשלבים שונים ללימודים של מנגנוני הרגולציה הקשורים להתפתחות הזקיק בשחלה כל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Naojiro ד ר אמסטרדם (אוניברסיטת קיוטו) על מתן העכברים Oog1pro3.9 . מחקר זה נתמך על ידי את JSPS (KAKENHI # JP15H06275) ושל קרן Nitto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
