Summary
卵巣の組織培養卵胞開発、排卵や卵胞閉鎖のモデルとして使用することができ、卵巣の動的過程の制御機構を示します。
Abstract
哺乳類の女性は、各発情周期中に卵母細胞数をほぼ一定を定期的に排卵します。このような規則性と周期性を維持するためには、視床下部-下垂体-性腺軸レベル、卵巣内の卵胞の開発に規制が発生します。アクティブな研究にもかかわらずいくつか手順休眠原始卵胞活性化から排卵して卵胞の各段階で異なる規制の複雑さのため、卵胞の発達メカニズムは明らかありません。卵胞発育のメカニズムと発情サイクルを通して卵胞のダイナミクスを調べるためには、顕微鏡を用いて卵胞の発育を観察するために使用できるマウス卵巣組織培養モデルを開発しました。体系的な卵胞発育、周期的な排卵と卵胞閉鎖すべてで再現できる卵巣培養モデルと培養条件を実験的変調することができます。ここでは、卵胞発育の調節機構とその他卵巣現象における本法の有用性を示す.
Introduction
雌マウス卵巣いくつか千包1、および周期的な排卵発情サイクルごとに約 10 卵母細胞が成熟します。卵胞は、いくつかの発達段階に分類: 原初、プライマリ、セカンダリ、幽門洞、および各卵子を取り巻く顆粒膜細胞層の形態によって、グラーフ卵胞。ほとんどの原始卵胞が休止状態とそれらのいくつかはアクティブし各発情周期2プライマリ卵胞に成長します。二次濾胞ステージ後卵胞発育は主に性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン (FSH) と黄体形成ホルモン (LH) によって調整されます。しかし、原始、プライマリ卵胞発育、性腺刺激ホルモンとは無関係です、これらの段階を支配する制御機構のまま悪い inderstood3,4,5。成長因子およびホルモンのほか、原始、プライマリ卵胞は卵胞6,7間の相互作用によって調整されます。したがって、マウス卵巣組織の卵胞動力学の解析を実行し、卵巣の組織培養8,9,10を使用して関連付けられている規制メカニズムを検討しました。
ここで、2 つの卵巣組織培養モデルのメソッドを紹介します。最初、卵胞の測定により卵胞発育を分析するため、2 番目はトランスジェニック マウスとセカンダリ卵胞期に原始から初期の卵胞発育中規制機構の研究使用されます。小胞の開発の分析、主に使用しました 4 週齢の雌マウスの卵巣卵胞を簡単に表示できるため。定期的な排卵とモデル生体内で卵胞発育を誘導するには、培養条件下でのエストラジ オールの分泌卵胞閉鎖と観測された排卵 LH サージが再現されております。培養の卵巣のイメージが捕獲されたと濾胞領域でトレースの変更によって卵胞の開発プロセスを分析しました。ただし、明視野顕微鏡解析で原始と初期プライマリ卵胞の区別は明確です。したがって、小卵胞を検出、原初、プライマリ、区別する手法を開発したし、の二次卵胞培養を用いた卵巣組織Oogenesin1 (Oog1) pro3 。9 と 0 と 4 日誕生11 R26 H2B mCherryトランスジェニック マウスの卵巣。Oog1式減数分裂、参入後は、卵母細胞の検出と原初から培養卵巣組織11 時間経過画像を用いたプライマリ卵胞への移行が観察、卵胞の発育とともに徐々 に増大 ,12。形態学的方法は、休止状態の原始卵胞13,14,15,16を活性化する要因を検討し使用されている、卵巣の生理学的な卵胞発育が観察することは困難、様々 な要因の影響残る例を紹介。本培養法は、ターゲット要素のリアルタイム解析でこの不足に対処するため設計されました。
本研究で我々 はタイムラプス イメージング法による卵胞の発育を追跡され、卵胞発育のプロセスが特徴します。私たちの手法は、卵巣の生理学を調査するための前例のないツールを提供しています。
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Protocol
マウスは、23 ± 1 ° C 12 h 光/12 h 暗いサイクルで環境制御部屋で収容されました。動物のケアのプロトコルおよび実験愛知医科大学動物実験ガイドラインに従って実施し、現職のケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 培地や料理の準備
- 基本的な文化のメディアの準備、ウシ胎児血清 (FBS、5 %v/v)、FSH を追加 (100 Miu/ml) LH (10 mU/mL) とペニシリン-ストレプトマイシン (ペニシリン、100 U/mL; ストレプトマイシン、100 mg/mL) 最小必須培地 α (MEM-α) とミックスは 50 mL の管に。
注: 合計ボリュームの必要な文化メディア実験の間で変わるが、培養液 1 mL は 3.5 cm ガラス底培養皿だけで十分です。 - 3.5 cm ガラス底培養皿に 1 mL 混合培地の因数を注ぐし、料理に場所 30 mm 細胞培養チップを設定します。中古メディアとインキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で料理を温めます。
2. 卵巣組織の準備
- あらかじめ暖かいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (−) と MEM-アルファ 5 %fbs、100 U/mL ペニシリン、インキュベーター (5% CO2と 37 ° C) で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含みます。
注: 約 3 mL 卵巣あたり因数 PBS (−) の使用のための十分な卵巣の解剖中に、MEM アルファの 1 mL 因数 3.5 cm 皿で単一の卵巣の一時的なストレージとして十分です。 -
4 週間の古い女性 ICR の (がん研究所の後の名前) マウスから卵巣を切除し、はさみと実体顕微鏡下で、ピンセットを使用して卵巣を周囲の組織をトリムします。培地の除去の卵巣をぜひご予約ください (手順 2.1 参照) に使用されるまで。
- PBS (−) で加温で湿らせたろ紙上に単一の卵巣の場所 (手順 2.1 参照) と実体顕微鏡下のミクロトーム刃を使用して 4 枚にスライス。
注: 4 週齢 ICR マウスの卵巣は、直径約 2 mm です。ピースの数によって異なります卵巣サイズ;ただし、約 500 μ m 厚い個できる適切な卵胞観察 (作品は 500 mm よりも厚く、組織透過性が減少; 個 500 ミリメートルよりも薄いの多くから胞状卵胞が壊れており、失われた)。 - 郭清後に、予め温めておいた培 (手順 2.1 参照) 3.5 cm 料理にスライスした卵巣片を配置します。
- PBS (−) で加温で湿らせたろ紙上に単一の卵巣の場所 (手順 2.1 参照) と実体顕微鏡下のミクロトーム刃を使用して 4 枚にスライス。
3. 卵巣の組織培養
- 卵巣組織がなる細胞文化挿入時の卵巣組織をスライス培養培地ごとの約 0.5 μ L をドロップ マイクロ ピペットを使用して設定します。
- ピンセットを使用して細胞培養インサート培のドロップに各スライス標本を配置します。
- 37 ° C で 5% CO2の卵巣組織を文化します。
- 2 日ごとに予め温めておいた培で培養液を置き換えます。
注: 4 週齢 ICR マウスから卵巣部文化の媒体の変更のスケジュールは、図 1に提示されます。- LH サージを再現するには、100 mU/mL FSH と LH 12 時間ごとの 4 日 (図 1) を含む培地で培養 4 週齢 ICR マウス卵巣を扱います。
4. 顕微鏡培養卵巣の画像
- 組織が細胞培養チップに付着したとき 1 日目後培養の卵巣の画像を開始し、24 h 間隔時間の点の間の十分な卵胞成長を許可する共焦点または倒立顕微鏡解析を実行します。
注: 共焦点顕微鏡倒立顕微鏡全体培養卵巣内の卵胞を観察するために優れています。
5. タイムラプス イメージング培養卵巣の
-
レーザー強度とイメージング システム (表 1) のための露出時間などを含む、タイムラプス撮影条件を最適化します。
- 処置および制御グループとして使用のための単一のマウスからペア卵巣片を選択します。レーザーの強度と最高の画像 (表 1) を達成するために露光時間を変えます。
- 卵胞エリア 24 時間間隔でコントロールのサンプルの画像とタイムラプス イメージング サンプル (手順 6 を参照) を測定することにより各培養条件下で卵胞の成長を比較します。同時に、各卵巣セット排卵卵子の数をカウントし、最適なタイムラプス イメージング条件を選択します。
- (表 1) の一定の条件の下でタイムラプス イメージング システムを使用して 30 分間隔で画像をキャプチャします。
6. 卵胞成長解析
-
卵胞発育を分析するには、ImageJ ソフトウェア (http://resbweb.nih.gov/ij/) を使用してキャプチャされたイメージに包領域を測定します。
- 当初は、ツール ・ バーの「分析」の下で「スケールを設定」をクリックしてイメージ スケールを設定します。それぞれの「知られている距離」と「ピクセルの距離」、空白のフィールドにキャプチャしたイメージとピクセルの対応する番号の側面の長さを入力します。
- 「フリーハンド」ツール バーでをクリックし、明るいフィールドから取得されたイメージで卵胞の概要を説明します。
- ツール ・ バーの「分析」の下で「測定」をクリックします。
注: 他の測定データが必要な場合「設定測定」「分析」の下で、ツール ・ バーをクリックし、一覧で該当するボックスをチェックします。
7. トランスジェニック マウスを用いた卵胞発育の解析
- 生後 0 および 4 (P0、P4) トランスジェニック マウスを含む挿入遺伝子Oog1pro3.9とR26 H2B mCherr、文化に従って手順 1.1 – 3.2、そうでない点を除いて女性スライス、P0、P4 卵巣から卵巣を収集します。
- 含む 5% CO2 37 ° C で 2 日ごとインキュベーターで 3.5 cm 料理で新鮮な予め温めておいた培地で培養液を交換してください。
注: P0、P4 の卵巣の培地の LH の濃度は、LH サージは P0、P4 のマウスで発生しないために定数残ることができます。 - 培養の P4 卵巣 (表 1) でのみ AcGFP1 肯定的なプライマリ卵胞を可視化する顕微鏡を設定します。
注: のみ原始、プライマリ卵胞 P4 雌マウスの卵巣ではあります。 - 培養 P0 Oog1pro3.9の画像をキャプチャ/R26 H2B mCherryトランスジェニック マウス卵巣 30 分間隔で P4 卵巣 (5.2 を参照) に使用される設定を使用しています。
- トレースし、AcGFP1 と H2B mCHerry 信号を使用して卵胞の発育を分析します。
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Representative Results
図 1は、卵巣の組織培養中にメディアに変更するためのプロトコルを示します。このプログラム、4 週齢 ICR マウス卵巣培養され、共焦点顕微鏡 (図 2) を使用して 24 h 間隔で撮像されます。3 週間、卵巣組織の培養中最も幽門洞およびセカンダリの卵胞が卵胞閉鎖によって退化したし、いくつかあった排卵 (図 2Dおよび表 2)。ImageJ (図 3) を用いた包地域の分析、いくつかの卵胞は、(図 3Bおよび補足の映画 1) 各 LH サージ サイクル中にグループで開発。また、排卵は別培養卵巣で単一のマウスの右と左の卵巣からほぼ同時に発生しました。培養の卵巣からの排卵が主に LH サージ (図 3、および補助の 48 時間内で発生したマウス卵巣 (データは示されていない) 間の排卵と排卵卵子 (表 2) のタイミングが異なっていたに対し、映画 1)。しかし、すべて排卵卵子は排卵 (図 2Eおよび表 2) 後、最初の極体をリリース、開発中止で排卵卵子が受精することができるが 4 細胞期 (データは示されていない)。マウスの卵巣に、休止状態の原始卵胞が活性化するメカニズムを明らかにするには、 Oog1pro3.9とR26 H2B mCherry transgenes (を運ぶトランスジェニック マウスから培養組織における原始卵胞活性化を検出図 4図 5、および附則ムービー 2)。卵母細胞は原始卵胞の段階からOog1遺伝子の非常に低いレベルを表現し、タイムラプス イメージングは、高 AcGFP1 を表現するプライマリ卵胞から低 AcGFP1 表現の原始卵胞を識別します。P0 卵巣 (図 4A, B) で原始卵胞だけがあるに対し、P4 マウス卵巣に同時に原始、プライマリ卵胞があります。したがって、我々 は培養の P4 卵巣 (図 4C) にプライマリ卵胞のみを検出するタイムラプス撮影条件を最適化しました。その後、同じ条件 (図 4D – G) で 10 日間の培養 P0 卵巣の画像をキャプチャします。AcGFP1 はこれらのトランスジェニック マウスにおけるプライマリ卵胞のインデックスとして使用できます、AcGFP1 陽性プライマリ卵胞培養 P0 卵巣で検出後 30-40 h 文化 (図 4図 5A ~ F、および補助映画 2)。培養の卵巣、原始、プライマリ卵胞は顆粒膜細胞 (図 5B E) mCherry 陽性核によっても区別されていました。具体的には、mCherry 信号は包の形態を示し、(図 5B、EとH) 培養の卵巣の卵胞の段階の観察を許可します。したがって、この文化のシステムOog1pro3.9から卵巣を使用して/R26 H2B mCherryマウスは、セカンダリ卵胞の段階に原初からの初期の卵胞発育の過程を明らかにしました。これらのメソッドは、性腺刺激ホルモンに依存しない卵胞発育の調節機構の研究を促進します。
図 1:中の変更経過。培地 A には、5 %fbs、100 mU FSH 10 mU LH、100 U/mL ペニシリン、MEM α 100 mg/mL ストレプトマイシンが含まれています。培地 B では、5 %fbs、100 mU FSH 100 mU LH、100 U/mL ペニシリン、MEM α 100 mg/mL ストレプトマイシンを含まれています。培地 B は、すべて 4 LH サージを生成に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 培養の卵巣組織像。画像は、共焦点顕微鏡を用いた 24 時間間隔で捕獲されました。(A) 文化の日 1;(B) 文化の日 5;(C) 文化の日 10;(D) 文化の日 13;(E) (d); 正方形によって示される領域の拡大鏡画像D の卵母細胞は、B、C、および D. (F) 卵子排卵; 後極体を放出中の矢印で示される卵胞から排卵しました。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 培養卵巣における卵胞エリアの測定。(A) 像培養卵巣;点線は、ImageJ で測定領域を表します。(B) 3 週間後培養の卵巣濾胞エリア灰色の線は、100 mM LH (LH サージ) の追加から培養期間を表しています。行は、各卵胞培養の卵巣内で開発段階を示してください。スケール バー = 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色像 P0、P4 の卵巣とタイムラプス イメージングします。(A) H & E 染色 P0 卵巣;(B) H & E 染色 P4 卵巣;(C) 培養 10 時間後Oog1pro3.6トランスジェニック マウスから P4 卵巣のイメージ。矢印は、AcGFP1 陽性プライマリ卵胞を示しています。(D-G)Oog1pro3.9とR26 H2B mCherry; を発現するトランスジェニック マウスから P0 卵巣の画像D および F で緑と赤の信号は、それぞれ AcGFP1 と mCherry を表します。ホワイトは、E と G は、それぞれの D と F、AcGFP1 を表す信号します。D と E は、0.5 時間培養後培養卵巣のイメージです。F と G は 180 h 文化後卵巣を表示します。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:培養卵巣内の原始、プライマリ、およびセカンダリの卵胞の画像 oog1pro3.9/R26 H2B mCherry マウスします。(A-C)培養 P0 卵巣の原始卵胞の画像(D-F)P0 培養卵巣内のプライマリ卵胞の画像(G-H)培養 4 週齢マウス卵巣内のセカンダリの卵胞の画像。A、D および G は、それぞれ B と C、E と F と H と、私のイメージをマージします。グリーン、AcGFP1;赤、mCherry;スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 顕微鏡 | 対物レンズ | レーザー | 露出 (ms) | ゲイン | 時間間隔 | z スタック | その他 | 数字と映画 |
| CV1000 | X10 | 488 nm: 30, 561 nm: 20 | 488 nm: 700, 561 nm: 600 | 488 nm: 90, 561 nm: 20 | 30 分 | 5 mm | 図 4 C G、ムービー 1 と 2 | |
| BZ X700 | (コレクション カラー) X20 | 40% | 自動 | X4 | 30 分 | 10 mm | 3 x 3 のビニング | ムービー 3 |
| LSM710 | X10 | 488 nm: 6%, 564 nm: 5% | カメラの速度: 4 | 488 nm: 850, 564 nm: 850 | 24 h | 10 mm | デジタルを得る、488 nm: 2, 564 nm:1 | 図 2、3、5 |
表 1: タイムラプス イメージング条件。共焦点および明るいフィールド顕微鏡用タイムラプス イメージング条件。
| 卵巣ないです。 | 合計排卵卵子の数 | MII 卵子の数 |
| 1 | 7 | 2 |
| 2 | 19 | 9 |
| 3 | 14 | 6 |
| 4 | 7 | 3 |
| 5 | 12 | 4 |
| 6 | 15 | 6 |
| 7 | 25 | 11 |
| 8 | 13 | 3 |
| 9 | 11 | 7 |
| 10 | 19 | 8 |
| 11 | 18 | 4 |
| 12 | 7 | 1 |
表 2: 培養卵巣排卵卵子数。12 培養卵巣の排卵卵子の数MII は、排卵後最初の極体をリリース排卵卵子数を示します。
補足映画 1: 培養卵巣のコマ撮り映画。卵巣は、スライスされ、培養 3 週間 4 週間の古いマウスから採取しました。映画文化の期間にまたがる 0-200 の 10 フレーム/秒で h をクリックしてくださいここでこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補足映画 2: トランスジェニック マウスの培養 P0 卵巣のコマ撮り映画。グリーン、AcGFP1;赤、mCherry。映画文化の期間にまたがる 0-180 の 10 フレーム/秒で h をクリックしてくださいここでこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
補足映画 3:4 週間の古いマウスから培養卵巣のコマ撮りムービー。グリーン、AcGFP1;赤;mCherry;映画 10 フレーム/秒で 9-13 文化日の文化間にわたります。最初の画像で矢印の示す卵胞培養中の閉鎖が発生しました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
本研究ではマウス卵巣における卵胞発育を研究するための 2 つの新しい方法を開発しました。最初のメソッドは卵胞発育の解析に続いてスライスした卵巣成熟マウス組織の文化を含み、2 番目には段階では、性腺刺激ホルモンに依存しない初期の卵胞発育を視覚化する時間経過イメージ投射の使用が含まれます。以前は、卵胞開発8,9日白血病の抑制的な要因とプロゲステロンの効果を評価するために現在の卵巣組織培養法を用い, 濃度と卵胞の段階でその効果が異なることを示した.本研究では展示した卵巣組織卵胞動態, このモデルを用いて卵胞形成メカニズムの解析をさらに正当化をスライスしました。
以上 5 週齢のマウスの卵巣には、顕微鏡観察を妨げるコーパス黄体が含まれています。したがって、4 週齢マウス卵巣は卵胞発育と排卵の観察に適しているし、以降後半のプライマリ、セカンダリ、および幽門卵胞は、明視野顕微鏡を用いたを区別してより簡単に。私たちの方法は、成長因子および特異的治療卵巣 (図 3) 間の卵胞発育の識別可能な変化と文化、メディアで薬の効果の比較を提供しています。
卵母細胞における Cre または蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック マウスは以前研究18,,1920に記載されています。ただし、卵胞期分類は顆粒膜細胞図形、顆粒膜細胞層数を含む組織学的特性に依存し、, 莢膜細胞を形成するかどうか。したがって、原始、プライマリ卵胞の違いは、卵だけでの観測から限られるかもしれない。本明細書でR26 H2B mCherry transgenes11,17 Oog1pro3.9を含むトランスジェニック マウスを使用し、培養卵巣における二次卵胞の段階に原始から初期の卵胞発育を可視化します。Oog1 式原始卵胞期の卵母細胞で検出可能になるし、プライマリ卵胞が著明に増加しました。したがって、卵母細胞の AcGFP1 シグナル強度は卵胞期 (図 5) に関連付けられ、原初プライマリ卵胞遷移 (図 4、附則ムービー 2) を観察するために使用されました。細胞の核が染色R26 H2B mCherryトランスジェニック マウス (図 4、附則ムービー 2、および補足の映画 3) できるように観察卵胞顆粒膜細胞 (の数字によるとステージの赤図 5)。したがって、総称して現在の方法許可を原始からOog1pro3.9を使用して排卵する卵胞発育の解析/R26 H2B mCherryトランスジェニック マウス。さらに、アポトーシス細胞クロマチンが凝縮されたため卵胞の卵胞の mCherry 信号が通常卵胞 (附則ムービー 3) の方が強い。
微妙なニュアンスの方法論の中でスライスした組織の正しい厚さが厚すぎる卵巣スライスと損失があまりにも薄い卵巣スライスで大きいから胞状卵胞の細胞死と、培養に成功に必要です。卵胞の成長速度は遅いです。したがって、トレース、24 時間間隔で観測を介して各卵胞のプロセスを分析して簡単です。レーザー光源の強度、時間間隔、およびデジタル ゲインなどを設定する現在の共焦点顕微鏡顕微鏡モードに依存しているがコマ撮り画像を得る際に考慮する重要です。特に、強いレーザー強度と長い露出時間明確な画像をキャプチャするために必要な培養細胞に影響を与えることができます。したがって、光毒性を避けるためにこれらの設定の管理が重要です。4 週齢マウスのスライスした卵巣組織を培養することができます約 4 週間、原始、プライマリ卵胞はその後、現在残っているに対し彼らはもはや成長します。対照的に、約 10 日間、その中に原始、プライマリ卵胞開発プライマリまたはセカンダリの卵胞にそれぞれ P0、P4 の卵巣を培養することができます。ただし、培養の P0、P4 の卵巣内の卵胞から胞状卵胞に開発しません。したがって、卵巣の切除は全卵巣卵胞発育に関連する規制メカニズムの研究のさまざまな段階で必要です。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は博士直次郎南 (京都大学) がOog1pro3.9マウスを提供することをありがちましょう。本研究は、日本学術振興会 (科研費 # JP15H06275) と日東財団によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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