Misura di rigidità dei substrati in morbido Silicone per gli studi di Mechanobiology usando un microscopio a fluorescenza Widefield
Summary
Substrati con rigidità nella gamma kilopascal sono utili per studiare la risposta delle cellule a rigidità di micro-ambiente fisiologicamente rilevanti. Utilizzando solo un microscopio a fluorescenza widefield, il modulo di Young di gel di silicone morbido può essere determinato utilizzando un rientro con una sfera adatta.
Abstract
Tessuti molli del corpo umano in genere hanno rigidità nell’intervallo kilopascal (kPa). Di conseguenza, substrati flessibili in silicone e idrogel hanno dimostrati di essere utile substrati per la coltura delle cellule in un microambiente fisico che imita parzialmente condizioni in vivo . Qui, presentiamo un semplice protocollo per la caratterizzazione di moduli di Young dei substrati elastici lineare isotropici in genere utilizzati per gli studi mechanobiology. Il protocollo è costituito da un substrato morbido silicone su una piastra di Petri o in silicone rigido la preparazione, ricoprire la superficie superiore del substrato in silicone con perline fluorescenti, usando una sfera di scala millimetrata per far rientrare la superficie superiore (per gravità), il fluorescente di imaging perline sulla superficie frastagliata in silicone utilizzando un microscopio a fluorescenza e analizzando le immagini risultanti per calcolare il modulo di Young del substrato del silicone. Superficie superiore del substrato del giunto con una proteina della matrice extracellulare di moduli (oltre le perline fluorescenti) consente il substrato del silicone per poter essere facilmente utilizzate per placcatura delle cellule e gli studi successivi utilizzando gli esperimenti di microscopia di forza di trazione. L’uso di silicone rigido, invece di una capsula di Petri, come base di morbido silicone, consente di utilizzare mechanobiology studi che coinvolgono il tratto esterno. Un vantaggio specifico di questo protocollo è che un microscopio a fluorescenza widefield, che è comunemente disponibile in molti laboratori, sia le principali attrezzature necessarie per questa procedura. Dimostriamo questo protocollo misurando il modulo di Young di substrati di morbido silicone di diversi moduli elastici.
Introduction
Cellule in tessuti molli risiedono in un micro-ambiente in cui la rigidità è in kilopascal gamma1, contrariamente ai piatti di coltura del tessuto cui rigidità è diversi ordini di grandezza superiore. I primi esperimenti con cellule su substrati molli rivestite con proteine di matrice extracellulare ha mostrato che la rigidità del substrato influenza come cellule spostare e come aderiscano alla matrice extracellulare sotto2,3. Infatti, la rigidità del substrato influenza fondamentalmente il cellulare funzione4 in un modo simile a segnali biochimici pervasivi. Gel di poliacrilammide (rivestito con proteine della matrice extracellulare) sono (acqua-permeando) idrogel che sono stati ampiamente utilizzati come substrati di coltura di cella per mechanobiology studi5. Polidimetilsilossano (PDMS), il silicone più comune (polisilossano), è stato ampiamente usato come un silicone rigido con rigidità megapascal-gamma per micron-scala fabbricazione6. Più recentemente, in morbido silicone substrati con rigidità nella gamma kilopascal più fisiologicamente rilevanti sono state impiegate come substrati di coltura cellulare per mechanobiology studi7,8.
Diversi metodi sono stati utilizzati per misurare la rigidità di substrati flessibili, tra cui la microscopia a forza atomica, deformazione macroscopica di interi campioni su stretching, reologia e i rientri utilizzando sfere e sfericamente con punta microindentors9 . Mentre ogni tecnica ha i suoi vantaggi e svantaggi, rientro con una sfera è un metodo particolarmente semplice ma abbastanza preciso che richiede solo l’accesso a un microscopio a fluorescenza widefield. Rientro con una sfera metallica è stato utilizzato per misurare la rigidità degli idrogeli lavoro anteriore3,9,10. Primi lavori che hanno dimostrato l’importanza della rigidità del substrato al movimento cellulare utilizzarono questo metodo per determinare idrogel substrato rigidità3. Più recentemente, la microscopia confocale è stata utilizzata anche per un elegante caratterizzazione10.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione di un substrato morbido silicone, perline fluorescenti di accoppiamento (e una proteina della matrice extracellulare quali il collagene ho) solo per la superficie superiore, una sfera di rientro e il top con superficie di imaging di fase e fluorescenza di imaging, rispettivamente e infine analizzando le immagini per calcolare il modulo di Young del substrato del silicone. Il substrato di silicone morbido preparato in questo modo può essere prontamente utilizzato per gli esperimenti di microscopia di forza di trazione. L’uso di silicone rigido (anziché una capsula di Petri) come base per il silicone morbido consente inoltre studi mechanobiology utilizzando un tratto esterno. Nei casi giustificati, sono indicati anche considerazioni pratiche necessarie per evitare possibili complicazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre il metodo di rientro di sfera è facile da implementare, attenzione attenta deve essere pagata per la scelta del penetratore e lo spessore del campione in morbido silicone. L’equazione utilizzata per calcolare il modulo di Young è valida sotto una serie di condizioni11e questi sono in genere soddisfatti quando lo spessore del campione del silicone è > 10% del raggio penetratore e < ~ 13 x il raggio del penetratore. Abbiamo trovato che uno spessore del silicone di 5-10 volte il raggio del …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ringraziamo di generosamente permettendo l’uso di reometro Margaret Gardel. Riconosciamo il supporto dal NIH (1R15GM116082) che ha attivato questo lavoro.
Materials
| CY 52-276 A/B silicone elastomer kit | Dow Corning | CY 52-276 | Store at room temperature |
| Thermo Scientific Pierce EDC | Fisher Scientific | PI22980 | Store at -20°C |
| Thermo Scientific Pierce Sulfo-NHS crosslinker | Fisher Scientific | PI-24510 | Store at 4°C |
| Carboxyl fluorescent pink particles, 0.4-0.6 µm, 2 mL | Spherotech, Inc. | CFP-0558-2 | Store at 4°C, do not freeze |
| 1.0 mm Acid washed Zirconium beads | OPS Diagnostics LLC | BAWZ 1000-250-33 | |
| Deep UV chamber with ozone evacuator | Novascan Technologies, Inc. | PSD-UV4, OES-1000D | |
| Wide field fluorescence microscope | Leica Microsystems | DMi8 | |
| Collagen I, from rat tail | Corning | 354236 | Stock concentration = 4 mg/ml; store at 4°C |
| ImageJ-NIH | N/A | N/A | public-domain software |
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