Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Abstract

Lactaat en pyruvaat zijn belangrijke tussenproducten van intracellulaire energie metabolische routes. Toezicht op de lactaat/pyruvaat ratio in cellen helpt om te bepalen of er een onbalans in de leeftijdsgebonden energiemetabolisme tussen Mitochondriale oxidatieve fosforylatie en aërobe glycolyse. Hier, laten we het gebruik van commerciële colorimetrische bepaling kits voor lactaat en pyruvaat in de model-organisme C. elegans. Onlangs, de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de colorimetrische/fluorimetrische assay kits zijn verbeterd sterk door onderzoek en ontwikkeling olv reagens fabrikanten. De verbeterde reagentia hebt ingeschakeld op het gebruik van kleinschalige tests met een 96-wells-plaat in C. elegans. In het algemeen, is een fluorimetrische assay superieur in gevoeligheid aan een colorimetrische bepaling; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt voor het gebruik in gemeenschappelijke laboratoria. Een ander belangrijk punt in deze tests voor kwantitatieve bepaling is eiwit precipitatie van gehomogeniseerde C. elegans monsters. In onze eiwit neerslag methode, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., trichloorazijnzuur, perchloorzuur en metaphosphoric zuur) worden gebruikt voor de bereiding van de monsters. Een eiwit-gratis test sample wordt bereid door koude neerslaande (eindconcentratie van 5%) tijdens de homogenisering direct toe te voegen.

Introduction

Lactaat en pyruvaat concentraties worden algemeen beschouwd als tussenproducten van de energie-stofwisseling en zijn gerelateerd aan de Staten van de glycolyse, tricarboxylic acid (TCA) cyclus en elektronentransport keten in de cellen van aerobe organismen. Een reeks reacties in de glycolyse oxideren glucose om pyruvaat, die ligt op een kruispunt van metabole en kan worden geconverteerd naar koolhydraten via gluconeogenese, vetzuren en energiemetabolisme door acetyl-CoA en het aminozuur alanine. De TCA cyclus gebeurt onder de aanwezigheid van voldoende opgeloste zuurstof en is essentieel voor de omzetting van glucose naar energie. Vooral de wijziging van de secundaire metabolisme is een interessant fenomeen waarin glycolyse voornamelijk voor de energieproductie gebruikt wordt en aërobe mitochondriale ademhaling, waarbij de TCA cyclus en het elektronentransport keten, werden in zoogdieren kanker cellen1,2. We toonden onlangs dat de niveaus van lactaat en de daaruit voortvloeiende lactaat/pyruvaat (L/P)-ratio tijdens veroudering in de model-organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans daalde). We vonden ook dat de zoogdieren tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 in C. elegans een belangrijke rol in de leeftijd-gerelateerde veranderingen van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen3 heeft.

In biologische testen, zoals het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in cellen, zijn de gevoeligheid, de nauwkeurigheid, de steekproefgrootte, en de incubatietijd van colorimetrische/fluorimetrische assay kits verbeterd drastisch. Als gevolg van technologische innovaties zijn we nu in staat om te analyseren verschillende metabolieten en intermediaire metabolieten zonder de grootschalige cultuur van C. elegans, dat is moeilijk gezien de kleine omvang. In het algemeen, is de gevoeligheid van een colorimetrische bepaling een orde van grootte kleiner dan die van een fluorimetrische assay; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt in de instelling van gemeenschappelijke laboratoria. Bovendien, een techniek van de extractie met homogenisering en eiwit neerslag is van cruciaal belang voor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van lactaat en pyruvaat in C. elegans cellen omdat deze nematode is ingesloten in een exoskelet genaamd de cuticle, in tegenstelling tot zoogdieren gekweekte cel lijnen4,5. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van lactaat en pyruvaat concentraties werken met commerciële colorimetrische bepaling kits inclusief tips voor monster extractie van C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. gesynchroniseerde cultuur van C. elegans

  1. Vóór het zaaien stam cultuur de Escherichia coli (E. coli) OP50 's nachts bij 37 ° C in 300 mL Luria Bertani (LB) Bouillon vloeibare voedingsbodem. Winkel de gekweekte OP50 bij-4 ° C.
    1. Maken van LB Bouillon opgietvloeistof, 10 g trypton, gistextract 5 g, 10 g NaCl en 1,5 mL 1 N NaOH gebruiken, en toevoegen aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf.
      Opmerking: OP50 en C. elegans stammen zijn beschikbaar vanaf de Caenorhabditis genetica Center (Universiteit van Minnesota, St. Paul, MN, USA).
  2. Nematode groei medium (NGM) agar, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 17 g agar, en gebruiken 975 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf. Cool tot 55 ° C, dan sterilely toevoegen, in orde, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in EtOH, en 25 mL van de 1 M kalium fosfaat pH 6.0 in 90-mm petrischalen.
    1. Voor 1 M kalium fosfaat pH 6.0, gebruik 108.3 KH2PO4 g en 46.6 g. van K2HPO4en Voeg gedeïoniseerd water toe tot 1 L. Autoclave6.
  3. 1-2 mL van de gekweekte OP50 op de platen van de agar NGM verspreid. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur voordat u eventuele nematoden toevoegt om een dun laagje OP50.
    Opmerking: De NGM agar platen die geënte OP50 kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor 2-3 weken.
  4. Voeg ten minste 100 wormen op een NGM agar bord met OP50, en cultuur bij 20 ° C tot het volwassen stadium. Ten minste drie platen zijn vereist.
  5. Verzamelen eieren in utero, overdracht van gravid hermafrodieten aan de drie NGM agar platen elke met 5 mL S buffer in een conische buis 15 mL, en wassen van de wormen 3 keer met 15 mL S buffer met behulp van centrifugeren bij 300 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    1. Om S buffer, 5,9 g NaCl en 50 mL 1 M kalium fosfaat pH 6.0 gebruiken, voegt u aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf6.
  6. Los van de wormen in een alkalische hypochlorietoplossing voor axenization en bulk ei isolatie (0,5 mL verse bleekmiddel of equivalent: 5-6% natriumhypochloriet, 0,1 mL van 10 M NaOH, ongeveer 4.5 mL S buffer)6, en de oplossing gedurende 10-15 minuten op staan kamertemperatuur onder omzwenken door omkeren.
    Opmerking: Binnen 15 min, volwassen wormen moeten ontbinden, waardoor een wazige oplossing van eieren bevrijd van hun karkassen (de bevrijde eieren moeten worden bevestigd met behulp van een stereoscopische Microscoop). In plaats van 0,1 mL van 10 N NaOH, kan 0.2 mL 5 N NaOH ook worden gebruikt.
  7. Na behandeling van hypochloriet, wassen van de ei-pellet 3 keer met 15 mL S buffer en resuspendeer in 5-6 mL S buffer. De vrijgegeven eieren tijdens een overnachting broedtijd bij 20 ° C in S buffer zonder E. coli voor een leeftijd-synchrone cultuur van L1 fase larven uitkomen.
  8. Om te bepalen van het geschatte aantal L1 fase larven, de wormen een stereoscopische Microscoop met 10 µL van S buffer na resuspending van de larven ten minste 3 keer tellen en het gemiddelde berekenen. Vervolgens overdracht van de larven van de fase L1 aan vijf NGM agar platen met OP50 (1500-3000 wormen per plaat met behulp van een petrischaal 90-mm) en cultuur bij 20 ° C, totdat ze zijn uitgegroeid tot de jonge volwassen stadium, wanneer de self-fertilization begint en een paar eieren worden gelegd (gewoonlijk na 3 d ays).

2. extractie van cellulaire fractie van C. elegans

  1. Het verzamelen van de jonge volwassen stadium (5-dagen oude dieren) uit de vijf NGM agar platen met S buffer (figuur 1A wormen).
    1. Schakel alleen levende wormen met behulp van de methode van sacharose6 voor flotatie op 30% (g/v) sacharose, meng de wormen geschorst in 3-4 mL S buffer met een gelijk volume van ijskoude 60% (m/v) sacharose in een conische buis 15 mL. Draai de buis bij 1.500 x g gedurende 15 s bij 4 ° C en verwijderen de drijvende wormen in een verse buis door ze te verplaatsen uit de wand van de buis met een pipet van Pasteur.
  2. Wassen van de wormen 3 keer met S buffer door centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 30 s bij 4 ° C. Check de natte hoeveelheid gewassen wormen na centrifugeren gebruik een 1.000 µL micropipet tip (figuur 1B).
  3. Voeg de gewassen wormen op een gelijk volume van ijskoude 10% (m/v)-Trichloorazijnzuur (TCA; eindconcentratie van 5%) voor eiwit neerslag (Figuur 1 c). In plaats van TCA, kan perchloorzuur (PCA) of metaphosphoric-zuur worden gebruikt.
  4. Meng de wormen met de neerslaande 40 slagen van een stamper met een Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem weefsel grinder) met rotatie van maximaal 1300 toeren per minuut op ijs.
  5. Het homogenaat overboeken naar een verse 1.5-mL microtube met een pipet van Pasteur, en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een ultrasoon homogenizer gedurende 3 minuten (3 keer voor 1 min) met een taakcyclus van 20% op ijs.
  6. Verduidelijking van het homogenaat door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Neutraliseren het supernatant met 4 M KOH (0,25 volume 10% TCA) voor 20 min op ijs en centrifuge op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Het supernatant (als een test sample) kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot en met de volgende tests.

3. lactaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit

  1. Het meten van de concentratie van lactaat in de monsters met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. 5 of 10 µL van de proefstukken benadert toevoegen aan een 96-wells-plaat en het volume naar 50 µL per putje met de lactaat Assay Buffer die bij de kit geleverd.
  2. Voor de standaard curve van lactaat, Verdun 100 mM L (+)-lactaat standaard tot 1 mM met lactaat Assay Buffer. Toevoegen van 0, 2, 4, 6, 8 en 10 µL van de 1 mM L (+)-lactaat standaard, die bij de kit wordt geleverd in een reeks van putten.
  3. Voeg 50 µL van reactie Mix (met 46:2:2 van lactaat Assay Buffer, lactaat enzym Mix en lactaat Probe in DMSO, watervrij; alle gebruikte reagentia zijn voorzien van de kit) of de achtergrond controle Mix (met 48:2 van lactaat Assay Buffer en lactaat Probe) in elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten, terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.
  4. Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm met behulp van een microplate-lezer en aftrekken van de extinctie van de achtergrond controle Mix van de extinctie van de Mix.
  5. De lactaat standaard curve uitzetten. Bereken de lactaat concentratie van de analysemonsters uit de lactaat standaard curve.

4. pyruvaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit

  1. Het meten van de concentratie van pyruvaat in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. Voeg 10 µL van de proefstukken benadert en 90 µL van werken reagens (met 94:1 van enzym Mix en kleurstof reagens, die zijn voorzien van de kit) in een 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.
  2. Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm microplate lezer gebruikt.
  3. De standaard curve van pyruvaat uitzetten. Bereken de pyruvaat concentraties van de analysemonsters uit de standaard curve van pyruvaat.

5. eiwitten Assay voor normalisatie met eiwitgehalte

  1. Het meten van de eiwitconcentratie in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Echter, deze stap is niet beperkt tot een assay kit, en andere benaderingen kunnen worden gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie.
  2. Normaliseren van de waarden van lactaat en pyruvaat concentraties tussen de proefstukken benadert met behulp van elke eiwitconcentratie totaal.
    Opmerking: Eiwitconcentratie van de analysemonsters voldoende zelfs na eiwit neerslag wordt gedetecteerd en wordt gebruikt voor de normalisatie stap onder monsters.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de colorimetrische testen voor de kwantitatieve bepaling van de concentraties lactaat en pyruvaat, toonden we de juistheid van deze tests vergeleken met vorige verslagen in C. elegans7,8. Hier, was het proces van eiwit neerslag tijdens de extractie van het monster de meest cruciale stap voor het genereren van nauwkeurige waarden. Bij eiwit precipitatie, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., TCA, PCA, of metaphosphoric zuur) kan worden gebruikt voor het bereiden van de proefstukken benadert (Figuur 1). In C. elegans, echter bleek het noodzakelijk om uit te voeren van eiwit neerslag tijdens de homogenisering van de wormen (tabel 1). Naast nauwkeurigheid, deze testen waren voldoende gevoelig zijn voor het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in kleinschalige monsters en waren in staat om hen te ontdekken in een korte periode van tijd (de reactieve incubatietijd van beide tests is minstens 30 min) ( Figuur 2-3). Eigenlijk, presenteerden we de gegevens in een recent rapport3. Dus, we kunnen detecteren leeftijdsgebonden metabole veranderingen die aangeeft dat mobiele lactaat niveaus en de daaruit voortvloeiende L/P ratio daalde tijdens veroudering en we toonden ook verschillende energie-stofwisseling in een mutant van cep-1 3.

Figure 1
Figuur 1 . Proces voor de winning van cellulaire metabolieten. (A) 1500-3000 wormen werden geplaatst op een NGM agarplaat (90 mm petrischaal). Extractie van wormen op vijf platen was voldoende voor de colorimetrische testen. (B) wormen verzameld uit de vijf platen van 3.000 en 1.500 wormen per plaat zijn aangegeven op de linker- en rechterkant van het deelvenster, respectievelijk. Beide de NAT volumes in elke buis 15 mL zijn < 0,5 mL, die voldoende zijn voor de detectie. (C) eiwit neerslag met behulp van 10% TCA tijdens de homogenisering van de wormen. Het toevoegen van de wormen in ijskoude 10% moet TCA in een homogenizer worden uitgevoerd voordat de wormen worden gehomogeniseerd. Anders kunnen niet cellulaire lactaat en pyruvaat worden gedetecteerd in de monsters met behulp van een colorimetrische assay kit (de gegevens worden weergegeven in tabel 1). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Colorimetrische pigmentatie patronen van de lactaat normen met behulp van een colorimetrische assay kit. (A) de putjes van de 96-wells-plaat gebruikt in de colorimetrische bepaling en een verdunningsreeks van het L (+)-lactaat standaard. Verhoging van de lactaat concentratie resulteerde in een meer intense roze kleur. BG geeft aan de achtergrond van een lactaat sonde tegen de verdunningsreeks. (B) lactaat standaard curve voor de colorimetrische bepaling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . Colorimetrische pigmentatie patronen van de pyruvaat-normen met behulp van een colorimetrische assay kit. (A) putjes van de 96-wells-plaat met behulp van de colorimetrische bepaling en verdunningsreeks van pyruvaat standaard. Verhoging van de concentratie van pyruvaat resulteerde in toegenomen licht roze kleuren. (B) pyruvaat standaard curve voor de colorimetrische bepaling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Proefmonsters Lactaat (mM) Pyruvaat (mM)
Eiwit-neergeslagen monsters tijdens homogenisering 3.07 ± 0.94 0,22 ± 0.08
Eiwit-neergeslagen monsters na homogenisering ND ND
Intact cytosolische breuk na homogenisering en ultracentrifugatie 1.12 0,06

Tabel 1. Gevolgen van eiwit neerslag op verschillende tijdsinstellingen voor de detectie van cellulaire lactaat en pyruvaat in 5 dagen oude dieren van wild-type N2. Gegevens blijkt middelen + standaarddeviatie (SD) van ten minste drie bepalingen. ND geeft niet gedetecteerd. * Het extractieproces werd uitgevoerd preliminair met ultracentrifugatie zonder eiwit neerslag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bij gebruik van deze colorimetrische bepaling kits, is de meest kritische stap in monster extractie te detecteren van cellulaire lactaat en pyruvaat nauwkeurig in C. elegans het proces van eiwit neerslag tijdens homogenisering (Figuur 1). Het is niet strikt noodzakelijk is om het gebruik van een Teflon-homogenizer, als andere homogeniseerders (bijv., Dounce en tapered weefsel slijpmachines, of kraal molens) zijn ook geschikt voor de kleinschalige winning van wormen. We did niet speurder cellulaire lactaat en pyruvaat van analysemonsters die werden opgehaald met behulp van een homogenizer voor eiwit neerslag. Bovendien zowel lactaat en pyruvaat niveaus daalde drastisch in de cytosolische fractie gescheiden met ultracentrifugatie in plaats van eiwit neerslag (tabel 1). Deze suggereren dat de extractie van het monster cruciaal is voor het detecteren van de cellulaire metabolieten in biochemische methodologie met behulp van een nematode C. elegans. Bij eiwit precipitatie, niet alleen de TCA maar ook verschillende andere neerslagmiddelen (PCA of metaphosphoric zuur) kunnen worden gebruikt om de biochemische methodologie7,9. Volgens een vorige rapport, het gebruik van TCA geleid tot de verdwijning van ongeveer 12% van NADH in de enzymatische meting van bloed lactaat en pyruvaat. Dus, de auteurs concludeerden dat 5% metaphosphoric zuur moet worden geselecteerd als de precipitant voor zowel lactaat en pyruvaat eiwit wanneer9met behulp van enzymatische onderzoek. Het suggereert dat TCA gedeeltelijk denatureert eiwitten met inbegrip van vele enzymen. We hadden echter geen problemen met betrekking tot de eiwit-neerslagmiddelen bij het gebruik van de colorimetrische testen te detecteren cellulaire lactaat en pyruvaat.

In deze studie gebruikten we commerciële colorimetrische bepaling kits voor de kwantitatieve bepaling van lactaat en pyruvaat (Figuur 2 enFiguur 3 ). Hun gevoeligheden en de omvang van de steekproeven waren superieur in vergelijking met de vorige test kits7; Daarom we bereid de monsters met behulp van een kleinere schaal extractie en de verschillen in de cellulaire lactaat en pyruvaat concentraties in C. elegans3gemeld. We ontdekt een leeftijd gerelateerde afname van lactaat en de daarop volgende L/P-verhouding in wild-type C. elegans en vond dat de p53/CEP-1 een belangrijke rol in de leeftijdsgebonden wijziging van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen heeft 2 , 3. dus, de analyse van de energie-stofwisseling in nematode C. elegans voordelig opbrengst als gevolg van met behulp van de verbeterde colorimetrische bepaling kits, ten minste in deel.

Zoals blijkt uit figuur 3B, lactaat concentratie minder dan 2 mM zijn vaak inderdaad groter in deze colorimetrische bepaling (niet de fluorimetrische assay). De fluorimetrische bepaling kan dus geschikt voor een meer nauwkeurige meting van lactaat. De mogelijkheden van deze kits assay steun colorimetrische zowel fluorimetrische testen, zodat de bepaling in reactie op het toestel in het laboratorium van de gebruiker is geselecteerd. Het is nog steeds duurder met de huidige commerciële colorimetrische bepaling kits te bepalen kwantitatief de concentratie van cellulaire metabolieten. Proeven kunnen echter worden adequaat uitgevoerd in kleinere laboratoria met behulp van gemeenschappelijke instrumenten en een spectrofotometrische afleesapparaat.

Tot nu toe zijn er relatief weinig rapporten met behulp van conventionele biochemische benaderingen in een modelorganisme C. elegans, die over het algemeen hoeft de grootschalige cultuur van wormen, in vergelijking met genetische studies5. Echter, de recente opmerkelijke vooruitgang van biologische bepaling systemen (bv., verbetering van de gevoeligheid en de stabiliteit van assay kits) maakt studies met de nematode C. elegans, die is klein en bestaat uit minder dan 1000 cellen, meer aantrekkelijk en gemakkelijk in het laboratorium uitgevoerd. Voortaan, effectieve metabolomic analyse met behulp van spectrometrie van de massa (MS) en gaschromatografie/massaspectrometrie (GC/MS) kan helpen om bepaalde problemen, zoals grootschalige cultuur, analytische gevoeligheid en specificiteit, en zal helpen ophelderen de rol van cellulaire metabolisme in verouderings- en menselijke ziekten waaronder kanker10. Vooruitblikkend, zou gemakkelijker methodologie, zoals colorimetrische bepaling kits, het effectief als een instrument voor screening voorafgaand aan nauwkeuriger instrumentele analyses uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd financieel ondersteund door een speciale subsidie van het onderzoek van de Daito Bunka universiteit naar Sumino Yanase.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

Tags

Biochemie kwestie 140 Caenorhabditis elegans energiemetabolisme lactaat pyruvaat gemeenschappelijke precipitant colorimetrische bepaling
Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.… More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter