Summary
Descriviamo un estrazione modificate su piccola scala e analisi colorimetriche del lattato e del piruvato nel nematode elegans del c. Quando si utilizzano i corredi di analisi commerciale, lo sviluppo tecnico della loro sensibilità e la precisione è importante. Precipitazione della proteina nell'estrazione è la fase più critica per la determinazione quantitativa dei metaboliti intracellulari.
Abstract
Lattato e piruvato sono intermedi chiave delle vie metaboliche di energia intracellulare. Monitoraggio del rapporto lattato/piruvato in cellule aiuta a determinare se vi è uno squilibrio nel metabolismo energetico senile tra fosforilazione ossidativa mitocondriale e glicolisi aerobica. Qui, ci mostra l'utilizzo di kit di analisi colorimetrica commerciale per lattato e piruvato nell'organismo modello di c. elegans. Recentemente, la sensibilità e la precisione dei kit colorimetrico/fluorimetrica dosaggio sono stati migliorati notevolmente dalla ricerca e sviluppo condotti da produttore di reagente. I reagenti migliorati hanno permesso l'uso di dosaggi in piccola scala con una piastra a 96 pozzetti in c. elegans. In generale, un'analisi fluorimetrica è superiore nella sensibilità a un saggio colorimetrico; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto per l'uso nei comuni laboratori. Un'altra questione importante in queste analisi per la determinazione quantitativa è precipitazione della proteina di omogeneizzato di c. elegans campioni. Nel nostro metodo di precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., acido tricloroacetico, acido perclorico e acido metafosforico) vengono utilizzati per la preparazione del campione. Un campione di analisi senza proteine è preparato aggiungendo direttamente freddo precipitante (concentrazione finale del 5%) durante l'omogeneizzazione.
Introduction
Le concentrazioni di lattato e piruvato sono ampiamente considerate come prodotti intermedi del metabolismo energetico e sono correlate agli Stati di glicolisi, ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA) e catena di trasporto degli elettroni nelle cellule degli organismi aerobici. Una serie di reazioni nella glicolisi ossidare il glucosio a piruvato, che si trova a un bivio metabolico e può essere convertito per carboidrati attraverso gluconeogenesi, acidi grassi e metabolismo energetico attraverso acetil-CoA e l'aminoacido alanina. Ciclo del TCA si verifica in presenza di sufficiente ossigeno disciolto ed è fondamentale per la conversione del glucosio in energia. Soprattutto, l'alterazione del metabolismo secondario è un fenomeno interessante in cui la glicolisi è usata principalmente per la produzione di energia e la respirazione mitocondriale aerobica, che coinvolge il ciclo del TCA e la catena di trasporto degli elettroni, è downregulated in mammiferi cancro cellule1,2. Abbiamo mostrato recentemente che i livelli di lattato e il rapporto lattato/piruvato conseguente (L/P) è diminuito durante l'invecchiamento dell'organismo modello Caenorhabditis elegans (c. elegans). Allo stesso modo, abbiamo trovato che il mammifero tumore soppressore p53 ortholog CEP-1 c. elegans ha un ruolo importante nelle alterazioni del metabolismo energetico attraverso l'attivazione dei suoi bersagli trascrizionali3età-correlate.
In saggi biologici, come la misurazione delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule, sono stati migliorati drammaticamente la sensibilità, precisione, dimensione del campione e tempo di incubazione di kit di saggio colorimetrico/fluorimetrico. A causa di innovazioni tecnologiche, siamo ora in grado di analizzare vari metaboliti e metaboliti intermedi senza la cultura su larga scala di c. elegans, che è difficile date le sue piccole dimensioni. In generale, la sensibilità di un saggio colorimetrico è un ordine di grandezza più piccolo di quello di un'analisi fluorimetrica; Tuttavia, l'approccio colorimetrico è più adatto nella cornice di laboratori comuni. Inoltre, una tecnica di estrazione contenente la precipitazione della proteina e di omogeneizzazione è cruciale per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato in cellule di c. elegans , perché questo nematode è racchiuso in un esoscheletro chiamato la cuticola, a differenza di linee cellulari di mammifero coltivate4,5. Qui, descriviamo un protocollo per analizzare le concentrazioni di lattato e piruvato usando i kit di analisi colorimetrica commerciali compresi suggerimenti per l'estrazione del campione da c. elegans.
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Protocol
1. sincronizzata cultura di c. elegans
- Prima della semina, cultura dell' Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo OP50 durante la notte a 37 ° C in 300 mL di terreno liquido di brodo di Luria-Bertani (LB). Conservare il OP50 coltivate-4 ° C.
- Per rendere il mezzo liquido di brodo LB, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di Estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 mL di NaOH N 1 e aggiungere a 1 L con acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave.
Nota: Ceppi OP50 e c. elegans sono disponibili dal centro di genetica della Caenorhabditis (Università del Minnesota, St. Paul, MN, USA).
- Per rendere il mezzo liquido di brodo LB, utilizzare 10 g di triptone, 5 g di Estratto di lievito, 10 g di NaCl e 1,5 mL di NaOH N 1 e aggiungere a 1 L con acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave.
- Per rendere agar medio (NGM) crescita del nematode, utilizzare 3 g di NaCl, 2,5 g di peptone, 17 g di agar e 975 mL di acqua deionizzata. Sterilizzare in autoclave. Raffreddare a 55 ° C, quindi sterilmente aggiungere, in ordine, 1 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL di EtOH e 25 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0 in 90-mm piastre di Petri.
- Per 1 M potassio fosfato pH 6.0, utilizzare 108,3 g di KH2PO4 e 46,6 g di K2HPO4e aggiungere acqua deionizzata a 1 Autoclave L.6.
- Spread 1-2 mL della OP50 coltivate su piastre di agar NGM. Per rendere un sottile strato di OP50, incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente prima di aggiungere qualsiasi nematodi.
Nota: Le piastre di agar NGM a che OP50 inoculato può essere conservato temperatura ambiente per 2-3 settimane. - Aggiungere almeno 100 vermi su una piastra di agar NGM con OP50 e cultura a 20 ° C fino allo stadio adulto. Almeno tre piastre sono necessari.
- Per raccogliere le uova nell'utero, trasferire gravid ermafroditi dalle tre NGM agar piastre ciascuna con 5 mL di buffer di S in una provetta conica da 15 mL e lavare i vermi 3 volte con 15 mL di buffer di S mediante centrifugazione a 300 x g per 30 s a temperatura ambiente.
- Per rendere S buffer, utilizzare 5,9 g di NaCl e 50 mL di 1 M potassio fosfato pH 6.0, aggiungere 1 L con acqua deionizzata. Autoclave6.
- Sciogliere i vermi in una soluzione di ipoclorito alcalino per axenization e uovo isolamento di massa (0,5 mL di candeggina fresco o equivalente: 5-6% ipoclorito di sodio, 0,1 mL di NaOH 10 M, circa 4,5 mL di buffer di S)6, e riposare la soluzione per 10-15 min a temperatura ambiente con miscelazione invertendo.
Nota: Entro 15 min, vermi adulti dovrebbero sciogliere, lasciando una soluzione nebuloso di uova liberati dalle loro carcasse (le uova liberate devono essere confermate usando un microscopio stereoscopico). Invece di 0,1 mL di NaOH 10 N, 0,2 mL di NaOH N 5 può anche essere utilizzato. - Dopo il trattamento di ipoclorito, lavare la pallina di uovo 3 volte con 15 mL di buffer di S e risospendere in 5-6 mL di buffer di S. Si schiudono le uova rilasciate durante un'incubazione overnight a 20 ° C nel buffer di S senza Escherichia coli per una cultura età-sincrono di larve della fase L1.
- Per determinare il numero approssimativo di larve della fase L1, contare i vermi utilizzando un microscopio stereoscopico a 10 µ l di tampone di S dopo risospendere le larve almeno 3 volte e calcolare la media. Quindi, trasferire le larve della fase L1 a cinque piastre di agar NGM con OP50 (1.500-3.000 worm al piatto utilizzando una capsula di Petri di 90 mm) e della coltura a 20 ° C fino a quando non sono cresciuti alla fase adulta giovane, quando comincia l'autofecondazione e poche uova (in genere dopo 3 d AYS).
2. estrazione della frazione cellulare da c. elegans
- Raccogliere i giovani vermi fase adulta (5-giorno-vecchio animali) dalle cinque piastre di agar NGM con buffer di S (Figura 1A).
- Per selezionare solo viti senza fine viventi che usando il saccarosio metodo6 per flottazione il saccarosio 30% (p/v), mescolare i vermi sospesi in 3-4 mL di buffer di S con un volume uguale di saccarosio ghiacciata di 60% (p/v) in una provetta conica da 15 mL. Girare il tubo a 1.500 x g per 15 s a 4 ° C e rimuovere il galleggiante vermi in una nuova provetta spostandoli fuori la parete del tubo con una pipetta Pasteur.
- Lavare i vermi 3 volte con tampone di S mediante centrifugazione a 1.500 x g per 30 s a 4 ° C. Controllare il volume bagnato di vermi lavati dopo centrifugazione utilizzando una punta di una micropipetta di 1.000 µ l (Figura 1B).
- Aggiungere i vermi lavati per un volume uguale di gelida 10% (p/v) l'acido tricloroacetico (TCA; concentrazione finale del 5%) per precipitazione della proteina (Figura 1). Invece di TCA, acido perclorico (PCA) o acido metafosforico può essere utilizzato.
- Omogeneizzare i vermi con il precipitante con 40 colpi di un pestello in un omogeneizzatore di Teflon (Potter-Chazen smerigliatrice di tessuto) con rotazione fino a 1.300 giri/min su ghiaccio.
- Trasferire l'omogeneizzato in una fresca microprovetta 1,5 mL con una pipetta Pasteur e sottoporre ad ultrasuoni utilizzando un omogeneizzatore ad ultrasuoni per 3 minuti (3 volte di 1 min) con un 20% duty cycle su ghiaccio.
- Chiarire l'omogeneizzato mediante centrifugazione a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Neutralizzare i surnatanti con 4M KOH (0,25 volume 10% TCA) per 20 min in ghiaccio e centrifugare a 8.000 x g per 10 min a 4 ° C. Il surnatante (come un esempio di test) si possa depositare a-80 ° C fino a quando i seguenti saggi.
3. lattato Dosaggio utilizzando un Kit di analisi colorimetrica
- Misurare la concentrazione di lattato nei campioni di prova utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 5 o 10 µ l dei campioni in una piastra a 96 pozzetti e regolare il volume a 50 µ l per pozzetto con il lattato Assay Buffer fornito con il kit.
- Per la curva standard di lattato, diluire 100 mM L (+)-lattato Standard a 1 mM con tampone del lattato. Aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µ l della mM 1 L (+)-lattato Standard, che viene fornito con il kit, in una serie di pozzi.
- Aggiungere 50 µ l di miscela di reazione (contenente 46:2:2 di tampone del lattato, Mix di enzima lattato e lattato sonda in DMSO, anidro; tutti i reagenti sono forniti con il kit) o sfondo controllo Mix (contenente 48,2 del tampone del lattato e del lattato Probe) in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30-60 min, mentre i campioni sono protetti dalla luce.
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre e sottrarre l'assorbanza del controllo Mix sfondo dall'assorbanza della miscela di reazione.
- Tracciare la curva standard di lattato. Calcolare le concentrazioni di lattato dei campioni dalla curva standard del lattato.
4. piruvato analisi usando un Kit di analisi colorimetrica
- Misurare la concentrazione di piruvato nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Effettuare l'esame duplex per i campioni di prova. Aggiungere 10 µ l di campioni e 90 µ l di reagente di lavoro (contenente 94:1 enzima Mix e il reagente colorante, che sono forniti con il kit) in una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, mentre i campioni sono protetti dalla luce.
- Misurare l'assorbanza di ciascun pozzetto a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
- Tracciare la curva standard del piruvato. Calcolare le concentrazioni di piruvato dei campioni dalla curva standard del piruvato.
5. protein Assay per normalizzazione con contenuto proteico
- Misurare la concentrazione di proteina nei surnatanti (campioni) utilizzando un kit di analisi colorimetrica (Tabella materiali). Tuttavia, questo passaggio non è limitato a un kit di dosaggio, e altri approcci possono essere utilizzati per misurare la concentrazione di proteina.
- Normalizzare i valori delle concentrazioni di lattato e piruvato fra i campioni di prova usando ogni concentrazione di proteine totali.
Nota: Concentrazione nella proteina nei campioni di prova sufficientemente viene rilevato anche dopo la precipitazione della proteina ed è utilizzata per il passo di normalizzazione tra i campioni.
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Representative Results
Utilizzando l'analisi colorimetriche per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di lattato e piruvato, abbiamo mostrato la precisione di questi saggi rispetto ai rapporti precedenti in c. elegans7,8. Qui, il processo di precipitazione della proteina durante l'estrazione del campione è stato il passaggio più importante per generare valori accurati. Per precipitazione della proteina, precipitanti comune (ad es., TCA, PCA, o acido metafosforico) può essere utilizzato per preparare i campioni di prova (Figura 1). In c. elegans, tuttavia, era necessario eseguire precipitazione della proteina durante l'omogeneizzazione dei vermi (tabella 1). Oltre alla precisione, questi saggi erano sufficientemente sensibili per misurare le concentrazioni di lattato e piruvato nei campioni su piccola scala e sono stati in grado di individuarli in un breve periodo di tempo (il tempo di incubazione reattiva di entrambi i test è almeno 30 min) ( Figura 2-3). In realtà, abbiamo presentato i dati in un recente rapporto3. Così, potremmo rilevare alterazioni metaboliche senile che indica quel cellulare livelli del lattato e il conseguente rapporto di L/P è diminuito durante l'invecchiamento, e abbiamo anche mostrato il metabolismo energetico diverso in un mutante di cep-1 3.
Figura 1 . Processo per l'estrazione di metaboliti cellulari. (A) 1.500-3.000 viti senza fine sono stati collocati su una piastra di agar NGM (piatto di Petri di 90 mm). Estrazione da worms su cinque piastre era sufficiente per le analisi colorimetriche. (B) Worms raccolti da cinque tavole di vermi 1.500 e 3.000 per ciascuna piastra sono indicati a sinistra e a destra del pannello, rispettivamente. Entrambi i volumi bagnati in ogni provetta 15 mL sono < 0,5 mL, che erano sufficienti per il rilevamento. Precipitazione della proteina (C) utilizzando 10% TCA durante l'omogeneizzazione dei vermi. Aggiungendo i vermi in ghiacciata 10% TCA in un omogeneizzatore deve essere eseguita prima che i vermi sono omogeneizzati. In caso contrario, piruvato e lattato cellulare non può essere rilevati in campioni di prova utilizzando un kit di analisi colorimetrica (dati sono mostrati in tabella 1). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Modelli di pigmentazione colorimetrico delle norme lattato utilizzando un kit di analisi colorimetrica. (A) pozzetti della piastra 96 pozzetti utilizzato in analisi colorimetrica e una serie di diluizioni della L (+)-lattato standard. L'aumento della concentrazione di lattato ha provocato un più intenso colore rosa. BG indica lo sfondo di una sonda di lattato contro la serie di diluizione. (B) lattato curva standard per l'analisi colorimetrica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Modelli di pigmentazione colorimetrico standard piruvato utilizzando un kit di analisi colorimetrica. (A) pozzetti della piastra 96 pozzetti mediante saggio colorimetrico e serie di diluizioni di piruvato standard. Aumento della concentrazione del piruvato ha provocato una maggiore colorazione rosa chiaro. (B) curva standard di piruvato per il saggio colorimetrico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Campioni di prova | Lattato (mM) | Piruvato (mM) |
| Campioni di proteina-precipitata durante l'omogeneizzazione | 3,07 ± 0,94 | 0.22 ± 0,08 |
| Campioni di proteina-precipitata dopo omogeneizzazione | ND | ND |
| Frazione citosolica intatto dopo omogeneizzazione e ultracentrifugazione * | 1.12 | 0,06 |
Tabella 1. Effetti della precipitazione della proteina su tempi diversi per la rilevazione di cellulare lattato e piruvato negli animali 5-giorno-vecchio di selvaggio-tipo N2. I dati indicano mezzi + deviazione standard (SD) di almeno tre determinazioni. ND indica non rilevati. * Il processo di estrazione è stato effettuato preliminarmente usando ultracentrifugazione senza precipitazione della proteina.
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Discussion
Quando si utilizzano questi kit di analisi colorimetrica, la fase più critica nell'estrazione del campione per rilevare cellulare del lattato e del piruvato con precisione in c. elegans è il processo di precipitazione della proteina durante l'omogeneizzazione (Figura 1). Non è strettamente necessario utilizzare un omogeneizzatore di Teflon, come altri omogeneizzatori (ad es., lisata e conico smerigliatrici del tessuto, o mulini del branello) sono adatti anche per l'estrazione artigianale di vermi. Non abbiamo rilevato cellulare lattato e piruvato in campioni di prova che sono stati estratti utilizzando un omogeneizzatore prima precipitazione della proteina. Inoltre, i livelli del piruvato e del lattato è diminuito drasticamente nella frazione citosolica separata usando ultracentrifugazione invece di precipitazione della proteina (tabella 1). Questi suggeriscono che l'estrazione del campione è fondamentale per rilevare i metaboliti cellulari in biochimica metodologia utilizzando un nematode c. elegans. Per precipitazione della proteina, non solo TCA ma anche diversi altri precipitanti (PCA o acido metafosforico) possono essere utilizzati per la metodologia biochimica7,9. Secondo un precedente rapporto, l'uso del TCA ha provocato la scomparsa di circa il 12% del NADH nella misurazione enzimatica del lattato e del piruvato. Di conseguenza, gli autori hanno concluso che l'acido metafosforico 5% deve essere selezionata come la proteina precipitante per piruvato e del lattato quando usando enzimatica saggi9. Essa suggerisce che TCA parzialmente denatura le proteine tra cui molti enzimi. Tuttavia, abbiamo non avuto nessun problema per quanto riguarda la proteina precipitanti quando utilizzando saggi colorimetrici per rilevare piruvato e lattato cellulare.
In questo studio, abbiamo utilizzato il kit commerciale saggio colorimetrico per la determinazione quantitativa del lattato e del piruvato (Figura 2 eFigura 3 ). Loro sensibilità e le dimensioni del campione erano superiori rispetto al precedente test kit7; Pertanto, abbiamo preparato i campioni di prova utilizzando un'estrazione di scala più piccola e segnalato le differenze nelle concentrazioni di lattato e piruvato cellulare in c. elegans3. Abbiamo rilevato una diminuzione relativa all'età in lattato e conseguente rapporto di L/P nel selvaggio-tipo di c. elegans e abbiamo trovato che la p53/CEP-1 ha un ruolo importante nell'alterazione del metabolismo energetico attraverso l'attivazione dei suoi bersagli trascrizionali senile 2 , 3. così, l'analisi del metabolismo energetico nel nematode c. elegans vantaggiosamente procede a causa utilizzando i kit di analisi colorimetrica migliorata, almeno in parte.
Come illustrato in Figura 3B, concentrazione inferiore a 2 mM di lattato tendono ad essere effettivamente più grande in questo saggio colorimetrico (non l'analisi fluorometrica). Di conseguenza, l'analisi fluorometrica può essere adatto per una più accurata misurazione del lattato. Le funzionalità di questi corredi di analisi supportano sia colorimetrici che fluorometriche saggi, affinché il dosaggio è selezionato in risposta all'apparecchio nel laboratorio dell'utente. È ancora più costoso utilizzare i kit di analisi colorimetrica commerciali presenti per determinare quantitativamente la concentrazione dei metaboliti cellulari. Tuttavia, prove possono essere adeguatamente eseguite nei laboratori più piccoli utilizzando strumenti comuni e un lettore spettrofotometrico.
Finora, ci sono relativamente pochi rapporti utilizzando approcci convenzionali biochimici in un organismo modello di c. elegans, che in genere hanno bisogno della cultura su larga scala di vermi, rispetto a studi genetici5. Tuttavia, i recenti notevoli progressi dei sistemi di saggio biologico (ad es., miglioramento della sensibilità e stabilità del kit di saggio) fa studi utilizzando il nematode c. elegans, che è piccolo e più è costituito da meno di 1.000 cellule, attraente ed effettuato facilmente in laboratorio. D'ora in poi, analisi metabolomica efficace mediante spettrometria di massa (MS) e gas cromatografia/spettrometria di massa (GC/MS) può contribuire a ridurre alcuni problemi, come cultura su larga scala, la sensibilità analitica e la specificità e contribuirà a chiarire il ruolo del metabolismo cellulare nell'invecchiamento e umane malattie tra cui cancro10. Guardando al futuro, metodologia più facile, come kit di analisi colorimetrica, sarebbe efficace come uno strumento di screening prima dell'analisi strumentale più precise.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente da una sovvenzione speciale di ricerca da Daito Bunka University a Sumino Yanase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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