Summary
Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.
Abstract
Lactato y piruvato son intermediarios clave de vías metabólicas de energía intracelular. Monitoreo de la relación lactato/piruvato en las células ayuda a determinar si existe un desequilibrio en el metabolismo de la energía relacionada con la edad entre la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis aeróbica. A continuación, os mostramos la utilización de kits de ensayo colorimétricos comerciales para lactato y piruvato en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Recientemente, la sensibilidad y la precisión de los kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado grandemente por la investigación y desarrollo llevado a cabo por los fabricantes de reactivos. Los mejores reactivos han permitido el uso de ensayos en pequeña escala con una placa de 96 pocillos en C. elegans. En general, un ensayo fluorimétrico es superior en sensibilidad para un ensayo colorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente para el uso en laboratorios comunes. Otra cuestión importante en estos ensayos para la determinación cuantitativa es la precipitación de la proteína de homogeneizado de C. elegans muestras. En nuestro método de precipitación de la proteína, precipitados comunes (por ej., ácido tricloroacético, ácido perclórico y ácido metafosfórico) se utilizan para la preparación de la muestra. Una muestra de ensayo libre de proteína es preparada agregando directamente Frío precipitado (concentración final de 5%) durante la homogeneización.
Introduction
Concentraciones de lactato y piruvato son consideradas ampliamente como productos intermedios del metabolismo energético y están relacionados con los Estados de la glicolisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y cadena de transporte de electrones en las células de organismos aerobios. Una serie de reacciones en la glicolisis se oxida glucosa a piruvato, que se encuentra en una encrucijada metabólica y puede convertir a los carbohidratos a través de la gluconeogénesis, a ácidos grasos y el metabolismo de la energía a través de acetil-CoA y al aminoácido alanina. El ciclo TCA se produce bajo la presencia de suficiente oxígeno disuelto y es fundamental para la conversión de glucosa a energía. Sobre todo, la alteración del metabolismo secundario es un fenómeno interesante en el que la glicolisis se utiliza predominante para la producción de energía y la respiración mitocondrial aeróbica, que implica la cadena de transporte de electrones y ciclo TCA, es regulada en el cáncer de mamífero células de1,2. Hemos demostrado recientemente que los niveles de lactato y la relación consiguiente lactato/piruvato (L/P) disminuyeron durante el envejecimiento en el organismo modelo Caenorhabditis elegans (C. elegans). Asimismo, encontramos que los mamíferos tumor supresor p53 ortholog CEP-1 en C. elegans tiene un papel importante en las alteraciones relacionadas con la edad del metabolismo energético mediante la activación de sus dianas transcripcionales3.
En ensayos biológicos, tales como la medición de las concentraciones de lactato y piruvato en las células, la sensibilidad, precisión, tamaño de la muestra y tiempo de incubación de kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado dramáticamente. Debido a las innovaciones tecnológicas, que ahora son capaces de analizar diversos metabolitos y metabolitos intermedios sin el cultivo a gran escala de C. elegans, que es difícil dado su pequeño tamaño. En general, la sensibilidad de un ensayo colorimétrico es un orden de magnitud más pequeño que el de un ensayo fluorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente en el entorno de los laboratorios comunes. Además, una técnica de extracción con precipitación de homogeneización y proteína es crucial para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato en las células de C. elegans porque este nematodo se encuentra dentro de un exoesqueleto llama la cutícula, a diferencia de las líneas de células de mamífero cultivadas4,5. Aquí, describimos un protocolo para analizar las concentraciones de lactato y piruvato usando kits de ensayo colorimétrico comercial incluyendo consejos para extracción de muestra de C. elegans.
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Protocol
1. sincronizada cultura de C. elegans
- Antes de sembrar, la cultura la Escherichia coli (e. coli) tensión OP50 durante la noche a 37 ° C en 300 mL de medio líquido de caldo Luria-Bertani (LB). Tienda OP50 cultivadas a-4 ° C.
- Para hacer el medio líquido caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1,5 mL de NaOH N 1 y añadir a 1 L con agua desionizada. Autoclave.
Nota: Las cepas OP50 y C. elegans están disponibles en el centro de genética de Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, St. Paul, MN, USA).
- Para hacer el medio líquido caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1,5 mL de NaOH N 1 y añadir a 1 L con agua desionizada. Autoclave.
- Para hacer agar de nematodos crecimiento medio (NGM), uso de 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de agar y 975 mL de agua desionizada. Autoclave. Enfriar a 55 ° C, luego sterilely agregar en orden, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de colesterol 5 mg/mL de EtOH y 25 mL de 1 M potasio Fosfato pH 6.0 en 90-mm placas de Petri.
- Para 1 M potasio Fosfato pH 6.0, utilice 108,3 g de KH2PO4 y 46,6 g de K2HPO4y añadir agua desionizada 1 L. Autoclave6.
- Extensión 1-2 mL de la OP50 cultivadas en las placas de agar NGM. Para hacer una capa delgada de OP50, incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente antes de agregar cualquier nematodos.
Nota: Las placas de agar NGM a que op50 inoculados pueden almacenarse temperatura ambiente durante 2-3 semanas. - Añadir por lo menos 100 gusanos sobre una placa de agar NGM OP50, y cultura a 20 ° C hasta la etapa adulta. Se requieren al menos tres platos.
- Para recoger huevos en el útero, transferir hermafroditas grávidos de las tres NGM agar placas cada uno con 5 mL de tampón de S en un tubo cónico de 15 mL y los gusanos 3 veces con 15 mL de búfer de S mediante centrifugación a 300 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
- Para realizar el almacenador intermediario S, 5,9 g de NaCl y 50 mL de 1 M potasio Fosfato pH 6.0, añadir a 1 L con agua desionizada. Autoclave6.
- Disolver los gusanos en una solución de hipoclorito alcalino para axenization y a granel aislamiento de huevo (0,5 mL de lejía fresca o equivalente: 5-6% hipoclorito de sodio, 0,1 mL de 10 M NaOH, aproximadamente 4,5 mL de tampón de S)6, y la solución por 10-15 min a temperatura ambiente con la mezcla por inversión.
Nota: Dentro de 15 minutos, deben disolver gusanos adultos, dejando una nebulosa solución de huevos liberados de sus cuerpos (los huevos liberados deben confirmarse mediante un microscopio estereoscópico). En lugar de 0,1 mL de NaOH N 10, también puede utilizarse 0,2 mL de 5 N NaOH. - Después del tratamiento de hipoclorito, lavar el pellet de huevo 3 veces con 15 mL de tampón de S y resuspender en 5-6 mL de tampón de S. Eclosionan los huevos liberados durante una incubación durante la noche a 20 º C en buffer de S sin e. coli de una cultura sincrónica a la edad de las larvas de fase L1.
- Para determinar el número aproximado de larvas de fase L1, cuenta los gusanos utilizando un microscopio estereoscópico en 10 μl de tampón de S después resuspender las larvas por lo menos 3 veces y calcular el promedio. A continuación, transferir las larvas de fase L1 a cinco placas de agar NGM con OP50 (1.500-3.000 lombrices por placa usando un plato de Petri de 90 mm) y de la cultura a 20 ° C hasta que han crecido a la etapa de adulto joven, cuando comienza la autofecundación y se ponen unos pocos huevos (normalmente después de 3 d ays).
2. extracción de la fracción celular de C. elegans
- Recoger a los jóvenes gusanos de etapa adulta (animales de 5 días de edad) de las cinco placas de agar NGM con tampón de S (figura 1A).
- Para seleccionar sólo gusanos de vida utilizando el método de sacarosa6 para la flotación en sacarosa al 30% (p/v), se mezclan los gusanos suspendidos en 3-4 mL de tampón de S con un volumen igual de helada de 60% (p/v) de sacarosa en un tubo cónico de 15 mL. Girar el tubo a 1.500 x g durante 15 s a 4 ° C y eliminar el flotante gusanos en un tubo fresco al mover la pared del tubo con una pipeta Pasteur.
- Los gusanos 3 veces con tampón de S de lavado por centrifugación a 1.500 x g durante 30 s a 4 ° C. Compruebe el volumen húmedo de gusanos lavados después de la centrifugación mediante una punta de micropipeta de 1000 μl (figura 1B).
- Añadir los gusanos lavados a un volumen igual de helada 10% (w/v) el ácido tricloroacético (TCA, concentración final de 5%) para la precipitación de la proteína (figura 1). En lugar de TCA, puede usarse ácido perclórico (PCA) o ácido metafosfórico.
- Homogeneizar los gusanos con el precipitado usando 40 movimientos de un mortero en un homogeneizador de teflón (Potter-Elvehjem amoladora de tejido) con rotación de hasta 1.300 RPM en el hielo.
- Transferir el homogeneizado en un microtubo de 1.5ml fresco con una pipeta Pasteur y someter a ultrasonidos usando un homogeneizador de ultrasonidos durante 3 minutos (3 veces de 1 min) con un ciclo de deber del 20% en el hielo.
- Aclarar el homogeneizado por centrifugación a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. Neutralizar los sobrenadantes con 4 M de KOH (0.25 volumen 10% TCA) por 20 min en hielo y centrifugar a 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. El sobrenadante (como una muestra de prueba) puede almacenarse a-80 ° C hasta los ensayos siguientes.
3. lactato análisis utilizando un Kit de análisis colorimétrico
- Medir la concentración de lactato en las muestras de prueba con el equipo de análisis colorimétrico (Tabla de materiales). Realizar exámenes duplex para las muestras de prueba. Añadir 5 o 10 μl de las muestras de prueba a una placa de 96 pocillos y ajustar el volumen a 50 μL por pozo con el tampón de ensayo lactato suministrado con el kit.
- Para la curva estándar de lactato, diluir 100 mM L (+)-lactato estándar a 1 mM con lactato tampón de ensayo. Agregar 0, 2, 4, 6, 8 y 10 μl de la 1 mM L (+)-lactato estándar, que se proporciona con el kit, en una serie de pozos.
- Añadir 50 μl de mezcla de reacción (contiene 46:2:2 de lactato tampón de ensayo, mezcla de enzima lactato y el lactato Probe en DMSO, anhidro; todos los reactivos son suministrados con el kit) o fondo Control Mix (contiene 48:2 de tampón de ensayo el lactato y el lactato Probe) en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 30-60 min., mientras que las muestras están protegidas de la luz.
- Medir la absorbancia de cada pocillo a 570 nm utilizando un lector de microplacas y restar la absorbancia de la mezcla de Control del fondo de la absorbancia de la mezcla de reacción.
- Trazar la curva estándar de lactato. Calcular las concentraciones de lactato de las muestras de prueba de la curva estándar de lactato.
4. piruvato análisis utilizando un Kit de análisis colorimétrico
- Medir la concentración de piruvato en los sobrenadantes (prueba de las muestras) usando un kit de análisis colorimétrico (Tabla de materiales). Realizar exámenes duplex para las muestras de prueba. Añadir 10 μl de las muestras de prueba y 90 μl del reactivo de trabajo (que contiene 94:1 de mezcla de enzima y tinte reactivo, que se proporcionan con el kit) en una placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras que las muestras están protegidas de la luz.
- Medir la absorbancia de cada pocillo a 570 nm utilizando un lector de microplacas.
- Trazar la curva estándar de piruvato. Calcular las concentraciones de piruvato de las muestras de prueba de la curva estándar de piruvato.
5. proteína análisis de normalización con el contenido de proteína
- Medir la concentración de proteína en los sobrenadantes (prueba de las muestras) usando un kit de análisis colorimétrico (Tabla de materiales). Sin embargo, este paso no está limitado a un kit de ensayo, y otros enfoques pueden ser utilizados para medir la concentración de proteína.
- Normalizar los valores de las concentraciones de lactato y piruvato entre las muestras de prueba con cada concentración de proteína total.
Nota: La concentración de proteína en las muestras de prueba suficientemente se detecta incluso después de la precipitación de la proteína y se utiliza para el paso de normalización entre las muestras.
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Representative Results
Usando el análisis colorimétricos para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato, demostró la exactitud de estos análisis en comparación con informes anteriores en la C. elegans7,8. Aquí, el proceso de precipitación de la proteína durante la extracción de la muestra fue el paso más crucial para generar valores precisos. Para la precipitación de la proteína, precipitados comunes (e.g., TCA, PCA, o ácido metafosfórico) puede usarse para preparar la prueba de las muestras (figura 1). En C. elegans, sin embargo, fue necesario realizar la precipitación de la proteína durante la homogeneización de los gusanos (tabla 1). Además de la exactitud, estos ensayos fueron suficientemente sensibles para medir las concentraciones de lactato y piruvato en muestras pequeñas y fueron capaces de detectar en un corto período de tiempo (el tiempo de incubación reactivos de ambos ensayos es al menos 30 minutos) ( Figura 2-3). En realidad, se presentan los datos en un reciente informe3. Así, podríamos detectar alteraciones metabólicas relacionadas con la edad que indica ese celular niveles del lactato y la consiguiente relación L/P disminuye durante el envejecimiento, y también mostramos metabolismo energético diferente en cep-1 mutante3.
Figura 1 . Proceso para la extracción de metabolitos celulares. (A) 1.500-3.000 lombrices fueron colocados en una placa de agar de la NGM (plato de Petri de 90 mm). Extracción de gusanos en cinco placas era suficiente para el análisis colorimétricos. (B) gusanos recogidos de las cinco placas de 3.000 y 1.500 lombrices por placa se indican en el lado izquierdo y derecho del panel, respectivamente. El volumen húmedo en cada tubo 15 mL es < 0,5 mL, que eran suficientes para la detección. Precipitación de la proteína c con 10% ácido Tricloroacético durante la homogeneización de los gusanos. Agregar los gusanos en helada 10% TCA en un homogeneizador deberá llevarse a cabo antes de que los gusanos están homogeneizados. De lo contrario, piruvato y lactato celular no pueden detectarse en muestras de prueba utilizando un kit de análisis colorimétrico (los datos se muestran en la tabla 1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Patrones de pigmentación colorimétrico de los niveles de lactato usando un kit de ensayo colorimétrico. (A) pocillos de la placa de 96 pocillos utilizado en el ensayo colorimétrico y una serie de diluciones de la L (+)-estándar de lactato. Aumento de la concentración de lactato dio lugar a un color rosa más intenso. BG indica el fondo de una sonda de lactato contra la serie de diluciones. (B) lactato curva estándar para el ensayo colorimétrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Patrones de pigmentación colorimétrico de los niveles de piruvato usando un kit de ensayo colorimétrico. (A) pocillos de la placa de 96 pozos utilizando el ensayo colorimétrico y la serie de diluciones del estándar de piruvato. Aumento de la concentración de piruvato resultó en aumento ligero color rosa. (B) curva estándar de piruvato para el ensayo colorimétrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestras de ensayo | Lactato (mM) | Piruvato (mM) |
| Muestras de proteína precipitada durante la homogeneización | ± 3,07 0,94 | ± 0.22 0.08 |
| Muestras de proteína precipitada después de la homogeneización | ND | ND |
| Fracción citosólica intacto después de la homogeneización y ultracentrifugación * | 1.12 | 0.06 |
Tabla 1. Efectos de la precipitación de proteínas en diferentes tiempos para la detección de celular lactato y piruvato en los 5 días de edad animales del tipo N2. Los datos indican medios + desviación estándar (SD) de al menos tres determinaciones. Indica que ND no detectado. La proceso de extracción se realizó preliminarmente mediante ultracentrifugación sin precipitación de proteínas.
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Discussion
Al utilizar estos kits de ensayo colorimétricos, el paso más crítico en la extracción de la muestra para detectar celular lactato y piruvato exactamente en C. elegans es el proceso de precipitación de la proteína durante la homogeneización (figura 1). No es estrictamente necesario utilizar un homogeneizador de teflón, como otros homogeneizadores (e.g., Dounce y Rectificadoras de tejido, o molinos de grano) son también adecuados para la extracción en pequeña escala de gusanos. No detectamos celular lactato y del piruvato en la prueba de las muestras que se obtuvieron utilizando un homogenizador antes de precipitación de la proteína. Además, los niveles de lactato y piruvato disminuyeron drásticamente en la fracción citosólica separada mediante ultracentrifugación en lugar de precipitación de la proteína (tabla 1). Éstos sugieren que la extracción de la muestra es crucial para detectar los metabolitos celulares en metodología bioquímica utilizando un nematodo C. elegans. Para la precipitación de la proteína, no sólo TCA pero también varios otros precipitados (PCA o ácido metafosfórico) pueden ser utilizados para la metodología bioquímica7,9. Según un informe anterior, el uso de TCA se tradujo en la desaparición de aproximadamente el 12% de NADH en la medición enzimática de sangre lactato y piruvato. Por lo tanto, los autores concluyeron que eso ácido metafosfórico al 5% deben seleccionarse como la proteína precipitante de lactato y piruvato cuando usando enzimática ensayos9. Sugiere que la TCA desnaturaliza parcialmente las proteínas incluyendo muchas enzimas. Sin embargo, tuvimos sin problemas sobre los precipitados de proteínas cuando se utiliza análisis colorimétricos para detección de piruvato y lactato celular.
En este estudio, se utilizaron kits de ensayo colorimétricos comerciales para la determinación cuantitativa de lactato y piruvato (figura 2 yfigura 3 ). Su sensibilidad y tamaño de las muestras fueron superior en comparación con el anterior ensayo kits7; por lo tanto, preparamos las muestras de prueba utilizando una menor extracción de escala y divulga las diferencias en las concentraciones de lactato y piruvato celulares en C. elegans3. Detectó una disminución relacionada con la edad de lactato y la consiguiente relación L/P en tipo C. elegans y encontró que la p53/CEP-1 tiene un papel importante en la alteración relacionada con la edad del metabolismo energético mediante la activación de sus dianas transcripcionales 2 , 3. por lo tanto, el análisis del metabolismo energético en el nematodo C. elegans procede ventajosamente por el uso de los kits de ensayo colorimétrico mejorado, al menos en parte.
Como se muestra en la figura 3B, la concentración de lactato por debajo de 2 mM tienden a ser de hecho más grande en este ensayo colorimétrico (no el ensayo fluorométrico). Por lo tanto, el análisis fluorométrico pueden ser adecuado para una medición más precisa de lactato. Las capacidades de estos kits de ensayo apoyan análisis colorimétricos y fluorométrico, para que el ensayo seleccionado en respuesta al aparato en el laboratorio del usuario. Es todavía más caro utilizar los kits de ensayo colorimétrico comercial actual para determinar cuantitativamente la concentración de metabolitos celulares. Sin embargo, los ensayos pueden realizarse adecuadamente en laboratorios más pequeños utilizando instrumentos comunes y un lector espectrofotométrico.
Hasta ahora, hay relativamente pocos informes utilizando métodos bioquímicos convencionales en un organismo modelo Caenorhabditis elegans, que normalmente se necesita el cultivo a gran escala de gusanos, en comparación con los estudios genéticos5. Sin embargo, los notables avances recientes de sistemas de ensayo biológico (ej., mejora de la sensibilidad y estabilidad de los kits de ensayo) hace estudios usando el nematodo C. elegans, que es pequeño y se compone de células menos de 1.000, más atractivo y fácilmente en el laboratorio. En adelante, análisis metabolómicos eficaz mediante espectrometría de masas (MS) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) puede ayudar a reducir ciertos problemas, como el cultivo a gran escala, sensibilidad analítica y especificidad y ayudará a dilucidar el papel del metabolismo celular en el envejecimiento y humanas enfermedades incluido el cáncer10. De cara al futuro, más fácil metodología, tales como kits de ensayo colorimétricos, sería efectivo como una herramienta de detección antes de los análisis instrumentales más precisos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación especial de Daito Bunka University a Sumino Yanase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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