Summary
Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.
Abstract
Laktat ve pyruvate hücre içi enerji metabolik yollar anahtar ara ürün vardır. Hücrelerdeki laktat/pyruvate oranı izleme yaşa bağlı enerji metabolizması mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon ve aerobik glikoliz arasında bir dengesizlik var olup olmadığını belirlemek için yardımcı olur. İşte, model organizma C. elegansticari Renkölçer tahlil kitleri için laktat ve pyruvate kullanımını göstermektedir. Son zamanlarda, duyarlılık ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri doğruluğunu büyük ölçüde araştırma ve geliştirme reaktif üreticileri tarafından yürütülen tarafından geliştirilmiştir. Geliştirilmiş reaktifler C. elegansbir 96-şey plaka ile küçük ölçekli deneyleri kullanımı etkinleştirdiniz. Genel olarak, bir fluorimetric tahlil kolorimetrik bir tahlil için duyarlılık içinde üstündür; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha laboratuarında ortak kullanım için uygundur. Başka bir önemli kantitatif tayin için bu deneyleri homojenize C. elegans protein yağış sorundur örnekleri. Bizim protein yağış yöntemindeki ortak precipitants (Örn., trichloroacetic asit, perklorik asit ve metaphosphoric asit) numune hazırlama için kullanılır. Bir tahlil protein ücretsiz örnek doğrudan homojenizasyon sırasında soğuk precipitant (% 5'lik son konsantrasyonu) ekleyerek hazırlanır.
Introduction
Laktat ve pyruvate konsantrasyonları glikoliz, tricarboxylic asit (TCA) ve elektron taşıma zinciri aerobik organizmalar hücrelerdeki Devletleri ile ilgili ve yaygın olarak enerji metabolizmasının ara ürün kabul edilmektedir. Glikoliz reaksiyonları bir dizi okside glikoz pyruvate, metabolik bir kavşakta yatıyor ve karbonhidrat gluconeogenesis, yağ asitleri ve enerji metabolizması acetyl-CoA aracılığıyla aracılığıyla ve amino asit alanin dönüştürülebilir için. TCA döngüsü yeterli çözünmüş oksijen varlığı altında oluşur ve enerji glikoz dönüştürmeye temelini oluşturur. Özellikle, ikincil İLETİMLERİNİZE ilginç bir fenomen glikoliz ağırlıklı olarak enerji üretimi için kullanılır ve TCA döngüsü ve elektron taşıma zinciri içerir, aerobik mitokondrial solunum downregulated memeli kanser hücreleri1,2. Biz son zamanlarda laktat seviyeleri ve bunun sonucunda laktat/pyruvate (L/P) oranı model organizma Caenorhabditis elegans (C. elegans) yaşlanma sırasında azalma gösterdi. Aynı şekilde, bulduk C. elegans içinde memeli tümör baskılayıcı p53 ortholog CEP-1 yaşa bağlı değişiklikler onun transkripsiyon hedefleri3aktivasyonu ile enerji metabolizmasının önemli bir role sahiptir.
Hücreleri, laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda ölçümü gibi biyolojik deneyleri, hassasiyet, doğruluk, örnek boyutu ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri kuluçka süresi önemli ölçüde yeniden geliştirilmiştir. Teknolojik yenilikler sayesinde artık zor olan kendi küçük boyutları verilen çeşitli metabolitleri ve ara metabolitleri C. elegans, büyük ölçekli kültür olmadan çözümlenecek edebiliyoruz. Genel olarak, Renkölçer Testin duyarlılığı bir büyüklük fluorimetric tahlil küçük olduğunu; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha ortak laboratuvarlar ayarında uygundur. Bu yuvarlak solucanlar bir exoskeleton eklenmiş olduğundan Ayrıca, homojenizasyon ve protein yağış içeren bir ayıklama tekniği C. elegans hücreleri laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda kantitatif tayini için çok önemlidir memeli kültürlü hücre hatları4,5aksine kütikül aradı. Burada, laktat ve pyruvate konsantrasyonları C. elegansörnek çıkarılması için ipuçları da dahil olmak üzere ticari Renkölçer tahlil kitleri kullanarak çözümlemek için bir protokol açıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans eşitlenmiş kültürü
- Tohum önce kültür Escherichia coli (e.coli) süzün OP50 gecede Luria-Bertani (LB) et suyu sıvı orta 300 ml 37 ° C'de. -4 ° C'de kültürlü OP50 depolamak
- LB suyu sıvı orta yapmak için tryptone 10 g, 5 g, maya özü, NaCl 10 g ve 1 N NaOH 1,5 mL kullanıp için 1 L deiyonize su ile ekleyebilirsiniz. Basınçlı kap.
Not: OP50 ve C. elegans suşları Caenorhabditis genetik Merkezi'nden (Minnesota Üniversitesi, St. Paul, MN, ABD) alınabilir.
- LB suyu sıvı orta yapmak için tryptone 10 g, 5 g, maya özü, NaCl 10 g ve 1 N NaOH 1,5 mL kullanıp için 1 L deiyonize su ile ekleyebilirsiniz. Basınçlı kap.
- Nematot büyüme orta (NGM) agar yapmak, NaCl, 3 g, pepton 2.5 g, agar 17 g ve 975 mL deiyonize su kullanın. Basınçlı kap. 55 ° c, sonra sterilely serin eklemek, sipariş, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL kolesterol alkol ve içinde 1 M potasyum fosfat pH 6.0 90 25 mL 1 mL-mm Petri yemekler.
- 1 M potasyum fosfat pH 6.0, KH2PO4 108.3 g ve K2HPO446.6 g kullanın ve deiyonize su 1 L. otoklav6' ya eklemek.
- 1-2 mL NGM agar plakaları kültürlü OP50 yayıldı. İnce bir tabaka halinde OP50 yapmak için herhangi bir nematodlar eklemeden önce gecede, oda sıcaklığında plakaları kuluçkaya.
Not: aşısını OP50 oda sıcaklığında 2-3 hafta boyunca saklanabilir NGM agar tabakları. - En az 100 solucanlar OP50 ve kültüre sahip bir NGM agar plaka üzerine 20 ° C'de yetişkin sahne kadar ekleyin. En az üç tabak gereklidir.
- Yumurta rahim içindetoplamak için aktarım üzerinden üç NGM agar pilakalar ve her 5 mL de bir 15 mL konik tüp arabellekte S gravid Hünsa ve solucanlar 3 kez 300 x g 30 de Santrifüjü kullanarak S arabellek 15 mL ile yıkayın s, oda sıcaklığında.
- S arabellek, NaCl 5.9 g ve 1 M potasyum fosfat pH 6.0 50 mL kullanın yapmak için 1 L deiyonize su ile ekleyin. Otoklav6.
- Axenization için bir alkali hipoklorit çözüm de solucan dağıtılması ve toplu yumurta yalıtım (0.5 mL taze çamaşır suyu veya eşdeğeri: % 5-6 sodyum hipoklorit, 10 M NaOH, S arabellek yaklaşık 4.5 mL 0.1 mL)6, ve çözüm için 10-15 dk stand ters çevirme tarafından karıştırma ile Oda sıcaklığında.
Not: 15 dk içinde yetişkin solucanlar, puslu bir çözüm (kurtarılmış yumurta stereoskopik mikroskop kullanarak onaylanması) onların leşleri kurtarılmış yumurta bırakarak dağıtılması. 10 N NaOH 0,1 mL yerine 5 N NaOH 0.2 mL de kullanılabilir. - Hipoklorit tedaviden sonra 3 kez ile S arabellek 15 mL yumurta Pelet yıkama ve 5-6 mL S arabellek resuspend. L1 sahne larva yaş zaman uyumlu bir kültür için E. coli olmadan S arabellekte 20 ° C'de gecede bir kuluçka sırasında serbest bırakılan yumurtalar çatlar.
- L1 sahne larvaları yaklaşık sayısını belirlemek için en az 3 kez larvalar resuspending sonra S arabellek 10 µL içinde bir stereoskopik mikroskop kullanarak solucanlar saymak ve ortalamasını hesaplamak. O zaman, beş NGM ağar kaplamalar (1500-3000 solucanlar başına 90 mm Petri kabına kullanarak plaka) OP50 ile L1 sahne larva transfer ve onlar-si olmak büyümek Genç Yetişkin Sahne Alanı'na, self-fertilization başlar ve birkaç yumurta (normalde 3 d sonra koyulur kadar 20 ° C'de kültür ays).
2. C. elegans üzerinden hücresel kesir çıkarımı
- Genç Yetişkin Sahne (5 bayat hayvanlar) beş NGM ağar kaplamalar S arabelleği (Şekil 1A) ile gelen solucanlar toplamak.
- Sadece yaşayan solucanlar için %30 (w/v) sükroz flotasyon sükroz Yöntem6 kullanarak seçmek için 3-4 ml S arabellek buz gibi %60 (w/v) sükroz 15 mL konik tüp içinde eşit bir birimdeki askıya solucanlar karıştırın. Tüp 1.500 x g 15 de spin s 4 ° C ve kayan kaldır Pasteur pipet ile tüp duvarından taşıyarak taze bir tüp solucanlar.
- Santrifüjü 1.500 x g 30, tarafından 3 kez ile S arabellek solucanlar yıkama s 4 ° C'de Islak hacim yıkanmış Worms 1.000 µL micropipette ucu (Şekil 1B) kullanarak Santrifüjü sonra kontrol edin.
- Yıkanmış solucanlar buz gibi % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA; % 5'lik son konsantrasyonu) eşit bir birime protein yağış (Şekil 1 c) ekleyin. Perklorik asit (PCA) veya metaphosphoric asit TCA yerine kullanılabilir.
- Solucanlar döndürme 1300 rpm buzda bir havaneli ile 40 vuruş bir Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem doku değirmeni) kullanarak precipitant ile homojenize.
- Pasteur pipet ile taze bir 1.5 mL microtube içine homogenate transfer ve solüsyon içeren bir ultrasonik homogenizer 3 dk (3 kez 1 min) % 20 iş hacmi ile buz üzerinde kullanarak temizleyicide.
- Santrifüjü 8.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından homogenate açıklamak Supernatants 4 M KOH ile nötralize (%0.25 10 birime TCA) buz ve 8.000 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika için 20 dakika Süpernatant (olarak test örneği)-80 ° C'de aşağıdaki deneyleri kadar saklanabilir.
3. laktat tahlil Renkölçer tahlil Kit kullanarak
- Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak test örneklerinde laktat konsantrasyonu ölçmek. Test örnekleri için çift yönlü sınav yerine getirir. 5 veya 10 µL test örnekleri bir 96-şey plakasına ekleyebilir ve laktat tahlil kit ile sağlanan arabellek ile iyi başına 50 µL birime ayarlayabilirsiniz.
- Laktat standart eğri için 100 mM L (+) seyreltik-laktat standart 1 mM için laktat tahlil arabelleği ile. 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 µL (+) 1 mm L Ekle-laktat kit ile wells bir dizi sağlanan standart,.
- Reaksiyon Mix (46:2:2 laktat tahlil arabellek, laktat enzim karışımı ve laktat Probe DMSO, susuz; tüm reaktifler kit ile sağlanan içinde içeren) veya arka plan denetimi (içeren 48:2 laktat tahlil arabellek ve laktat Probe) Mix 50 µL her kuyuya Ekle ve 30-60 dakika oda sıcaklığında örnekleri ışıktan korunan iken kuluçkaya.
- 570 her kuyuda absorbans ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm ve reaksiyon Mix absorbans arka plan denetimi karışımından absorbans çıkarın.
- Laktat standart eğri çizmek. Laktat standart eğri test örnekleri laktat konsantrasyonu hesaplayın.
4. pyruvate tahlil Renkölçer tahlil Kit kullanarak
- Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak supernatants (test örnekleri) pyruvate konsantrasyonu ölçmek. Test örnekleri için çift yönlü sınav yerine getirir. Test örnekleri 10 µL ve çalışma (94:1 enzim karışımı ve boya reaktifi kit ile sağlanan içeren) reaktif 90 µL 96-şey plaka ekleyip örnekleri ışıktan korunan iken, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- 570 her kuyuda absorbans ölçmek Mikroplaka Okuyucu kullanarak nm.
- Pyruvate standart eğri çizmek. Test örnekleri pyruvate standart eğri pyruvate konsantrasyonları hesaplayın.
5. protein tayini için normalleştirme Protein içerikli
- Renkölçer tahlil kiti (Tablo reçetesi) kullanarak supernatants (test örnekleri) protein konsantrasyonu ölçmek. Ancak, bu adım bir tahlil kiti için sınırlı değildir ve diğer yaklaşımlar protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanılabilir.
- Laktat ve pyruvate konsantrasyonları her toplam protein konsantrasyonu kullanarak test örnekleri arasında değerleri normalize.
Not: Test örneklerinde Protein konsantrasyonu yeterince bile protein yağış sonra algılanır ve normalleştirme adım örnekleri arasında için kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renkölçer deneyleri laktat ve pyruvate konsantrasyonları kantitatif tayin için biz C. elegans7,8önceki raporlar ile karşılaştırıldığında bu deneyleri doğruluğunu gösterdi. Burada, örnek çıkarma sırasında protein yağış süreç doğru değerleri oluşturmak için en önemli bir adım oldu. Protein yağış, ortak precipitants için (Örn., TCA, PCA, veya metaphosphoric asit) test örnekleri (Şekil 1) hazırlamak için kullanılabilir. C. elegansiçinde ancak, protein yağış sırasında homojenizasyon Worms (Tablo 1) yerine getirilmesi oldu. Doğruluk, ek olarak bu deneyleri küçük ölçekli örnekler laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda ölçmek için yeterince hassas olduğunu ve onları bir kısa sürede (reaktif kuluçka, her iki deneyleri zamanı en az 30 dk.) tespit edebildik ( Şekil 2-3). Aslında, verileri bir son raporu3' te sundu. Böylece, biz-ebil bulmak metabolik değişiklikler yaşa bağlı bu hücresel gösteren laktat seviyeleri ve bunun sonucunda L/P oranı yaşlanma sırasında azalmış ve ayrıca bir cep-1 mutant3' te farklı enerji metabolizması gösterdi.
Resim 1 . Hücresel metabolitleri çıkarma işlemlerinde. (A) 1500-3000 solucanlar NGM agar tabağa (90 mm Petri kabına) yerleştirildi. Çekme--dan beş tabak solucanlar Renkölçer deneyleri için yeterli idi. (B) solucanlar beş tabak tabak başına 3.000 ve 1.500 Worms toplanan sol ve sağ tarafında paneli, sırasıyla gösterilir. Her 15 mL tüp ıslak birimleri < 0.5 mL, hangi algılama için yeterli bulunmaktadır. (C) Protein yağış % 10 kullanarak TCA homojenizasyon solucanların sırasında. Solucanlar içine buz gibi % 10 ekleyerek bir homogenizer TCA solucanlar homojenize önce yapılması gerekiyor. Aksi takdirde, hücresel laktat ve pyruvate Renkölçer tahlil kiti (veri Tablo 1' de gösterildiği) kullanarak test örneklerinde tespit edilemez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Renkölçer pigmentasyon desenleri laktat standartların . bir Renkölçer tahlil kit kullanarak (A) kuyu Renkölçer tahlil ve L (+) seyreltme dizi kullanılan 96-şey plaka yapımı-laktat standart. Laktat konsantrasyonu artan daha yoğun bir pembe renkte sonuçlandı. BG seyreltme serisi karşı laktat soruşturması arka plan gösterir. (B) laktat Renkölçer tahlil için standart eğri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Renkölçer pigmentasyon desenleri pyruvate standartların . bir Renkölçer tahlil kit kullanarak (A) kuyu Renkölçer tahlil ve pyruvate Standart seyreltme dizi kullanarak 96-şey plaka yapımı. Pyruvate konsantrasyonu artan artan hafif pembe boyama sonuçlandı. (B) pyruvate Renkölçer tahlil için standart eğri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Test örnekleri | Laktat (mM) | Pyruvate (mM) |
| Protein çöktürülmüş örnekleri homojenizasyon sırasında | 3.07 ± 0,94 | 0.22 ± 0,08 |
| Homojenizasyon sonra protein çöktürülmüş örnekleri | ND | ND |
| Homojenizasyon ve ultrasantrifüj * sonra sağlam sitozolik kesir | 1.12 | 0,06 |
Tablo 1. Etkileri hücresel laktat ve pyruvate 5 bayat hayvanlar vahşi tipi N2, algılamak için farklı zamanlamaları protein yağış. Verileri belirtmek anlamına gelir + en az üç tayin olan standart sapma (SD). ND değil algılanan gösterir. * Ayıklama işlemi buradan ultrasantrifüj protein yağış olmadan kullanarak gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu Renkölçer tahlil kitleri kullanarak zaman hücresel laktat algılamak için örnek çıkarma en kritik adımda ve pyruvate C. elegans içinde doğru homojenizasyon (Şekil 1) sırasında protein yağış işlemidir. Teflon homogenizer, diğer homogenizers kullanmak kesinlikle gerekli değildir (Örn., Dounce ve konik doku öğütücüler veya boncuk fabrikaları) da solucanlar küçük ölçekli çıkarılması uygundur. Biz hücresel laktat ve pyruvate homogenizer protein yağış önce kullanarak elde test örneklerinde algılamadı. Ayrıca, laktat ve pyruvate seviyeleri önemli ölçüde azalma ultrasantrifüj protein yağış (Tablo 1) yerine kullanarak ayrılmış sitozolik kesir. Bunlar örnek çıkarma hücresel metabolitleri biyokimyasal yöntemini kullanarak bir yuvarlak solucanlar C. elegansalgılamak çok önemli olduğunu göstermektedir. Protein yağış için sadece TCA ama aynı zamanda birkaç diğer precipitants (PCA veya metaphosphoric asit) biyokimyasal metodoloji7,9' a yararlı olabilir. Bir önceki rapora göre yaklaşık % 12'si NADH kan laktat ve pyruvate enzimatik ölçüm kaybolması TCA kullanımıyla sonuçlanan. Bu nedenle, yazarlar enzimatik kullanarak9deneyleri zaman o %5 metaphosphoric asit protein laktat ve pyruvate için precipitant olarak seçilmesi gerekir sonucuna vardı. Bu TCA kısmen de dahil olmak üzere birçok enzimler protein denatures öneriyor. Ancak, biz Renkölçer deneyleri hücresel laktat ve pyruvate algılamak için kullanırken protein precipitants ile ilgili herhangi bir sorun vardı.
Bu çalışmada, ticari Renkölçer tahlil kitleri laktat ve pyruvate (Şekil 2 veŞekil 3 ) kantitatif belirlenmesi için kullanılır. Onların hassasiyetleri ve örneklerin boyutu ile karşılaştırıldığında önceki tahlil kitleri7üstün vardı; Bu nedenle, daha küçük bir ölçek çıkarma kullanarak test örnekleri hazırlanan ve C. elegans3hücresel laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda farklılıkları bildirdi. Biz vahşi-türü C. elegans içinde laktat ve bunun neticesi olan L/P oranı yaşla ilgili bir azalma tespit ve p53/CEP-1 yaş ile ilgili değişiklik transkripsiyon hedeflerine etkinleştirmesi üzerinden enerji metabolizmasının önemli bir role sahiptir bulundu 2 , 3. böylece, yuvarlak solucanlar C. elegans enerji metabolizması analizinde avantajlı geliştirilmiş Renkölçer tahlil kitleri, en azından bölümünde nedeniyle kullanarak devam eder.
Şekil 3B' de gösterildiği gibi bu Renkölçer tahlil (Fluorometrik tahlil) gerçekten de daha büyük olma eğilimindedir laktat konsantrasyonu 2 mM aşağıda. Bu nedenle, Fluorometrik tahlil laktat daha doğru bir ölçüm için uygun olabilir. Tahlil Laboratuvar Cihaz kullanıcının yanıt olarak seçili olmamasını kolorimetrik ve Fluorometrik deneyleri, bu tahlil kitleri yeteneklerini destekler. Mevcut ticari Renkölçer tahlil kitleri kantitatif hücresel metabolitleri konsantrasyonu belirlemek için kullanmak üzere hala daha pahalıdır. Ancak, denemeler yeterince yaygın aletleri ve spektrofotometrik plaka okuyucu kullanarak daha küçük laboratuvarlarda gerçekleştirilir.
Şimdiye kadar orada görece az sayıda raporlar bir model organizma hangi genellikle solucanlar, genetik çalışmalar5ile karşılaştırıldığında büyük ölçekli kültür gerekir C. elegans, konvansiyonel biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak. Ancak, son kayda değer ilerleme biyolojik tahlil sistemleri (Örn., duyarlılık ve kararlılık tahlil kitleri geliştirilmesi) küçük ve daha az 1.000 hücrelerin oluşur C. elegans, yuvarlak solucanlar kullanılarak çalışmalar yapar çekici ve kolayca laboratuvarda çaldınız. Bundan böyle, kütle spektrometresi (MS) ve gaz kromatografi/kütle spektrometresi (GC/MS) kullanarak etkili metabolomic analiz büyük ölçekli kültür, analitik duyarlılık ve özgüllük, gibi bazı sorunları azaltmaya yardımcı olabilir ve aydınlatmak için yardımcı olacaktır hücresel yaşlanma ve insan hastalıkları kanser10dahil metabolizmasında rolü. İleriye baktığımızda, daha kolay metodolojisi, Renkölçer tahlil kitleri gibi daha kesin enstrümantal analizler önce bir tarama aracı olarak etkili olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser mali Sumino Yanase için bir özel araştırma hibe Daito Bunka Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
