Summary
Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.
Abstract
Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.
Introduction
Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteração do metabolismo secundário é um fenômeno interessante na qual glicólise é usado predominantemente para produção de energia e aeróbia respiração mitocondrial, que envolve o ciclo TCA e cadeia de transporte de elétrons, é ativador em mamíferos câncer células1,2. Nós mostramos recentemente que os níveis de lactato e a relação lactato/piruvato consequente (L/P) diminuiu durante o envelhecimento no organismo modelo Caenorhabditis elegans (c. elegans). Da mesma forma, achamos que os mamíferos tumor supressor p53 ortholog CEP-1 em c. elegans tem um papel importante nas alterações relacionadas com a idade do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais3.
Em ensaios biológicos, tais como a medição das concentrações de lactato e piruvato em células, a sensibilidade, precisão, tamanho da amostra e tempo de incubação de kits de ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram dramaticamente. Devido às inovações tecnológicas, agora somos capazes de analisar vários metabólitos e metabólitos intermediários sem a cultura em grande escala de c. elegans, que é difícil, dado o seu pequeno tamanho. Em geral, a sensibilidade de um ensaio colorimétrico é uma ordem de magnitude menor do que um ensaio fluorimétrica; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais adequada na configuração dos laboratórios comuns. Além disso, uma técnica de extração contendo precipitação de homogeneização e proteína é crucial para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato de células de c. elegans , porque este nematódeo é encerrado em um exoesqueleto chamado a cutícula, ao contrário de células de mamíferos cultivadas linhas4,5. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar as concentrações de lactato e piruvato usando kits de ensaio colorimetric comercial, incluindo dicas para extração de amostra de c. elegans.
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Protocol
1. sincronizada cultura de c. elegans
- Antes da semeadura, cultura de Escherichia coli (e. coli) estirpe OP50 durante a noite a 37 ° C em 300 mL de meio líquido de caldo de Luria-Bertani (LB). Armazenar o OP50 cultivadas a-4 ° C.
- Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave.
Nota: OP50 e c. elegans cepas estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis (Universidade de Minnesota, St. Paul, MN, EUA).
- Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave.
- Para tornar o ágar de nematoides crescimento médio (NGM), use 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar e 975 mL de água desionizada. Autoclave. Legal a 55 ° C, então sterilely adicionar, em ordem, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em EtOH e 25 mL de fosfato de potássio 1m pH 6.0 em 90-mm placas de Petri.
- Para 1m de potássio fosfato pH 6.0, use 108,3 g de KH2PO4 e 46,6 g de K2HPO4e adicionar água desionizada para 1 L. Autoclave6.
- Espalhou-se 1 a 2 mL da OP50 cultivadas em placas de ágar a NGM. Para fazer uma camada fina de OP50, Incube as placas durante a noite à temperatura ambiente antes de adicionar qualquer nematoides.
Nota: As NGM placas de ágar que inoculado OP50 podem ser armazenados à temperatura ambiente por 2-3 semanas. - Adicione pelo menos 100 minhocas em uma placa de ágar NGM com OP50 e cultura a 20 ° C até a fase adulta. Pelo menos três placas são necessárias.
- Para coletar os ovos no útero, transferir gravid hermafroditas das três NGM placas de ágar cada com 5 mL de tampão de S em um tubo cônico de 15 mL e lavar os vermes 3 vezes com 15 mL de tampão de S usando centrifugação a 300 x g durante 30 s, à temperatura ambiente.
- Para tornar o buffer de S, use 5,9 g de NaCl e 50 mL de 1m potássio fosfato pH 6.0, adicione 1 L com água desionizada. Autoclave6.
- Dissolver os vermes em uma solução de hipoclorito alcalino para axenization e isolamento de ovo a granel (0,5 mL de lixívia fresca ou equivalente: 5-6% de hipoclorito de sódio, 0,1 mL de NaOH de M 10, aproximadamente 4,5 mL de tampão de S)6, e defendemos a solução 10-15min no temperatura ambiente com a mistura por inversão.
Nota: Dentro de 15min, vermes adultos devem dissolver-se, deixando uma solução nebulosa de ovos libertados de suas carcaças (os ovos liberados devem ser confirmados usando um microscópio estereoscópico). Em vez de 0,1 mL de NaOH de 10 N, 0,2 mL de NaOH de N 5 também pode ser usado. - Após o tratamento de hipoclorito, lavar o sedimento de ovo 3 vezes com 15 mL de tampão de S e ressuspender em 5-6 mL de tampão de S. Chocar os ovos liberados durante uma incubação durante a noite a 20 ° C no buffer de S sem Escherichia coli para uma cultura da idade-síncrono de larvas L1.
- Para determinar o número aproximado de larvas L1, contar os vermes usando um microscópio estereoscópico em 10 µ l de tampão de S após resuspending as larvas de pelo menos 3 vezes e calcular a média. Em seguida, transferir as larvas L1 para cinco placas de ágar NGM com OP50 (1.500-3.000 vermes por placa usando um prato de Petri de 90 mm) e cultura a 20 ° C até que eles têm crescido a fase adulta jovem, quando começa a autopolinização e alguns ovos (normalmente depois de 3-d ays).
2. a extração da fração celular de c. elegans
- Recolha os jovens em fase adulta (animais de 5 dias de idade) vermes das cinco placas de ágar NGM com buffer de S (figura 1A).
- Para selecionar apenas os vermes vivos usando o método de sacarose6 para flutuação em sacarose 30% (p/v), misture os vermes suspendidos em 3-4 mL de tampão de S com um volume igual de sacarose gelada de 60% (p/v) em um tubo cônico de 15 mL. Girar o tubo a 1.500 x g durante 15 s a 4 ° C e remover o flutuante vermes em um tubo de fresco, deslocando-os para fora da parede do tubo com uma pipeta Pasteur.
- Lave os vermes 3 vezes com tampão de S por centrifugação a 1.500 x g por 30 s a 4 ° C. Verifique o volume molhado de vermes lavados após a centrifugação utilizando uma ponta de micropipeta de 1.000 µ l (figura 1B).
- Adicione os vermes lavados para um volume igual de gelada 10% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA; concentração final de 5%) para a precipitação de proteínas (Figura 1). Em vez de TCA, ácido perclórico (PCA) ou ácido metafosfórico pode ser usado.
- Homogeneizar os vermes com o dessensibilizador usando 40 golpes de um pilão em um homogeneizador de Teflon (Potter-Elvehjem moedor de tecido) com rotação de até 1.300 rpm no gelo.
- Transferir o homogeneizado em um microtubo de 1,5 mL fresco com uma pipeta Pasteur e proceda à sonicação usando um homogeneizador ultra-sônico por 3 min (3 tempos de 1 min), com um ciclo de trabalho de 20% no gelo.
- Clarificar o homogeneizado por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Neutralizar os sobrenadantes com 4 M de KOH (volume de 0,25 a 10% TCA) por 20 min no gelo e centrifugar 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante (como uma amostra de teste) pode ser armazenado a-80 ° C até os ensaios seguintes.
3. lactato ensaio usando um Kit de ensaio Colorimetric
- Medir a concentração de lactato nas amostras de teste usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). Realizar exames de frente e verso para as amostras de ensaio. Adicionar 5 ou 10 µ l das amostras de teste para uma placa de 96 poços e ajustar o volume de 50 µ l por alvéolo com lactato ensaio Buffer fornecido com o kit.
- Para a curva padrão de lactato, diluir 100 mM L (+)-lactato padrão de 1mm com lactato Buffer de ensaio. Adicionar 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µ l a 1 mm L (+)-lactato padrão, que é fornecido com o kit, em uma série de poços.
- Adicionar 50 µ l de reação Mix (contendo 46:2:2 de Buffer de ensaio de lactato, Mix de enzima lactato e lactato sonda em DMSO, anidro; todos os reagentes são fornecidos com o kit) ou Mix de controle de Background (contendo 48:2 de Buffer de ensaio de lactato e lactato sonda) em cada poço e incubar a temperatura ambiente por 30-60 min, enquanto as amostras são protegidas da luz.
- Medir a absorvância de cada poço a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas e subtrair o valor da absorvância do fundo controle Mix valor da absorvância da mistura da reação.
- Traça a curva padrão de lactato. Calcule as concentrações de lactato das amostras de teste a partir da curva padrão de lactato.
4. piruvato ensaio usando um Kit de ensaio Colorimetric
- Medir a concentração de piruvato nos sobrenadantes (amostras) usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). Realizar exames de frente e verso para as amostras de ensaio. Adicionar 10 µ l das amostras de teste e 90 µ l de reagente de trabalho (contendo 94:1 da enzima Mix e corante reagente, que são fornecidos com o kit) em uma placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por 30 min, enquanto as amostras são protegidas da luz.
- Medir a absorvância de cada poço a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.
- Traça a curva padrão de piruvato. Calcule as concentrações de piruvato das amostras de teste a partir da curva padrão de piruvato.
5. a proteína ensaio para normalização com teor de proteínas
- Medir a concentração de proteína nos sobrenadantes (amostras) usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). No entanto, esta etapa não é limitada a um kit de ensaio, e outras abordagens podem ser utilizadas para medir a concentração de proteína.
- Normalize os valores de concentrações de lactato e piruvato entre as amostras de teste usando cada concentração de proteínas totais.
Nota: Concentração de proteínas nas amostras de teste é suficientemente detectada mesmo após a precipitação de proteínas e é utilizada para a etapa de normalização entre as amostras.
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Representative Results
Usando os ensaios colorimétricos para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato, mostramos a precisão destes ensaios em comparação com os relatórios anteriores em c. elegans7,8. Aqui, o processo de precipitação de proteínas durante a extração da amostra foi a etapa mais crucial para gerar valores precisos. Para a precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., TCA, PCA, ou ácido metafosfórico) pode ser usado para preparar as amostras de teste (Figura 1). Em c. elegans, no entanto, foi necessário realizar a precipitação de proteínas durante a homogeneização dos vermes (tabela 1). Além de precisão, estes ensaios foram suficientemente sensíveis para medir as concentrações de lactato e piruvato em amostras pequenas e foram capazes de detectá-los em um curto período de tempo (o tempo de incubação reativa de ambos os ensaios é de pelo menos 30 min) ( Figura 2-3). Na verdade, apresentamos os dados em um recente relatório3. Assim, nós poderíamos detectar alterações metabólicas relacionadas com a idade, indicando aquele celular os níveis de lactato e a consequente relação de L/P diminuiu durante o envelhecimento, e também mostramos o metabolismo energético diferente em um mutante cep-1 3.
Figura 1 . Processo para a extração de metabólitos celulares. (A) 1.500-3.000 vermes foram colocados em uma placa de ágar NGM (prato de Petri de 90 mm). Extração de vermes em cinco placas era suficiente para os ensaios colorimétricos. (B) vermes recolhidos das cinco placas de 3.000 e 1.500 minhocas por placa são indicadas à esquerda e à direita do painel, respectivamente. Ambos os volumes molhados em cada tubo de 15 mL são < 0,5 mL, que eram suficientes para a deteção. Precipitação de proteínas (C) usando 10% TCA durante a homogeneização dos vermes. Adicionando os vermes em gelada 10% TCA em um homogeneizador tem de ser executadas antes que os vermes são homogeneizados. Caso contrário, piruvato e lactato celular não podem ser detectados em amostras do teste usando um kit de ensaio colorimetric (os dados são mostrados na tabela 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Padrões de pigmentação colorimétrica das normas lactato usando um kit de ensaio colorimetric. (A) poços da placa de 96 poços usada no ensaio colorimétrico e uma série de diluição do L (+)-padrão de lactato. Aumentando a concentração de lactato resultou em uma cor de rosa mais intensa. BG indica o plano de fundo de uma sonda de lactato contra a série de diluição. (B) lactato curva padrão para o ensaio colorimetric. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Padrões de pigmentação colorimétrica das normas piruvato usando um kit de ensaio colorimetric. (A) poços da placa de 96 poços, utilizando o ensaio colorimetric e série de diluição do padrão de piruvato. Aumento da concentração de piruvato resultou em aumentada leve coloração rosa. (B) piruvato curva de calibração para o ensaio colorimétrico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostras de teste | Lactato (mM) | Piruvato (mM) |
| Amostras de proteína-precipitado durante a homogeneização | 3,07 ± 0,94 | 0,22 ± 0,08 |
| Amostras de proteína-precipitado após homogeneização | ND | ND |
| Fração citosólica intacta após homogeneização e ultracentrifugação * | 1.12 | 0,06 |
Tabela 1. Efeitos da precipitação de proteínas em horários diferentes para a deteção de celular lactato e piruvato em 5 dias de idade animais do selvagem-tipo N2. Os dados indicam meios + desvio padrão (SD) de pelo menos três determinações. ND indica não detectado. A processo que extração foi realizado usando preliminarmente ultracentrifugação sem precipitação de proteínas.
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Discussion
Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes. Nós não detectar celular lactato e piruvato em amostras de teste que foram extraídas usando um homogenizador antes de precipitação de proteínas. Além disso, os níveis de lactato e o piruvato diminuíram drasticamente na fração citosólica separada usando ultracentrifugação em vez de precipitação de proteínas (tabela 1). Estas sugerem que a extração da amostra é crucial para detectar os metabolitos celulares em bioquímica metodologia usando um nemátodo c. elegans. Para a precipitação de proteínas, não só TCA mas também vários outros precipitants (PCA ou ácido metafosfórico) podem ser utilizados para a metodologia bioquímica7,9. De acordo com um relatório anterior, o uso do TCA resultou no desaparecimento de aproximadamente 12% de NADH na medição enzimática de lactato sanguíneo e piruvato. Portanto, os autores concluíram que 5% de ácido metafosfórico deve ser selecionada como a proteína precipitant para lactato e piruvato quando usando enzimática ensaios9. Ele sugere que o TCA parcialmente desnatura proteínas, incluindo muitas enzimas. No entanto, nós não tínhamos problemas em relação as proteína precipitants quando usando ensaios colorimétricos para detecção de piruvato e lactato celular.
Neste estudo, utilizamos kits de ensaio colorimetric comerciais para a determinação quantitativa do lactato e piruvato (Figura 2 eFigura 3 ). Suas sensibilidades e tamanhos de amostra foram superiores em comparação com o anterior ensaio kits7; Portanto, preparar as amostras de teste usando uma extração de escala menor e relatou as diferenças nas concentrações de lactato e piruvato celular em c. elegans3. Nós detectou uma diminuição relacionadas com a idade de lactato e consequente relação de L/P no selvagem-tipo c. elegans e achei que o p53/CEP-1 tem um papel importante na alteração do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais relacionadas com a idade 2 , 3. assim, a análise do metabolismo energético no nemátodo c. elegans vantajosamente procede devido a usar os kits de ensaio colorimetric melhorada, pelo menos em parte.
Como mostrado na Figura 3B, concentração de lactato abaixo de 2mm tendem a ser de fato maior neste ensaio colorimétrico (não o ensaio fluorométrica). Portanto, o ensaio fluorométrica pode ser apropriado para uma medição mais precisa de lactato. Os recursos destes kits de ensaio suportam ensaios colorimétricos e fluorométrica, para que o ensaio é selecionado em resposta ao aparelho no laboratório do usuário. É ainda mais caro do que usar os kits de ensaio colorimetric comercial presente para determinar quantitativamente a concentração de metabólitos celulares. No entanto, ensaios podem ser adequadamente realizados em laboratórios menores, utilizando instrumentos comuns e um leitor espectrofotométrico.
Até então, há relativamente poucos relatórios usando abordagens bioquímicas convencionais em um organismo modelo c. elegans, que geralmente é necessário a cultura em grande escala de worms, em comparação com estudos genéticos5. No entanto, o recente progresso notável de sistemas de ensaios biológicos (ex., melhoria da sensibilidade e estabilidade dos kits de ensaio) faz estudos utilizando o nemátodo c. elegans, que é pequeno e é composto por menos de 1.000 células, mais atraente e realizada facilmente em laboratório. De agora em diante, metabolómica eficaz análise utilizando espectrometria de massa (MS) e espectrometria de cromatografia de massa (GC/MS) pode ajudar a reduzir alguns problemas, tais como a cultura em grande escala, sensibilidade analítica e especificidade e vai ajudar a elucidar o papel do metabolismo celular em envelhecimento e humanos doenças, incluindo câncer10. Olhando para o futuro, metodologia mais fácil, tais como kits de ensaio colorimetric, seria eficaz como uma ferramenta de triagem antes mais precisos de análise instrumental.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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