Summary
変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ キットを利用するときの感度と精度の技術の開発が重要です。抽出の蛋白質の沈殿物は、細胞内の代謝物の定量法の最も重要なステップです。
Abstract
乳酸とピルビン酸は、細胞内のエネルギー代謝の鍵中間体です。細胞における乳酸/ピルビン酸比の変化は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化と好気性解糖作用の間の加齢に伴うエネルギー代謝に不均衡があるかどうかを判断するのに役立ちます。ここでは、線虫モデル有機体の乳酸とピルビン酸の商業の比色アッセイ キットの使用率を表示します。最近、感度と比色/蛍光アッセイ キットの精度が大幅に改善されました研究試薬メーカーによる開発によって。改良された試薬は、線虫の 96 ウェル プレートでの小規模な試金の使用を有効にしています。一般的に、蛍光アッセイは感度よりも優れて比色試金;ただし、比色定量のアプローチは一般的な研究室での使用に適した。定量のためのこれらの試金のもう一つの重要な問題は、均質化のc. の elegansの蛋白質の沈殿物のサンプル。私たちのタンパク質の沈殿法、一般的な沈殿の (e.g。、トリクロロ酢酸、過塩素酸およびメタリン酸) サンプル調製に使用。無料の蛋白質の試金のサンプルは、均質化の中に直接冷たい鉛塩法 (最終濃度 5%) を追加することによって準備されます。
Introduction
乳酸とピルビン酸の濃度は、エネルギー代謝の中間体として広くみなされ、解糖作用、トリカルボン酸 (TCA) サイクル、および好気性生物の細胞における電子輸送チェーンの状態に関連しています。一連の解糖系の反応は、グルコース代謝の岐路にあると糖新生、脂肪酸、アセチル coa、を介してエネルギー代謝を炭水化物とアミノ酸のアラニンに変換できるピルビン酸に酸化します。TCA サイクルは、糖のエネルギーへの変換のために基本的十分な溶存酸素の存在下で発生します。特に、二次代謝の変化は、エネルギー生産のため主に解糖系が使用されている興味深い現象と TCA サイクルと電子輸送鎖を含む、好気性のミトコンドリア呼吸はダウンレギュ レート哺乳類の癌細胞の1,2を実行します。我々 は最近モデル有機体線虫(C. elegans) の時効中における血中乳酸値とそれに伴う乳酸/ピルビン酸 (L/P) 比が減少したことを示した。同様に、 c. の elegansの哺乳類腫瘍のサプレッサー p53 オーソログ CEP 1 では、その転写制御ターゲット3の活性化を介してエネルギー代謝の加齢に伴う変化の重要な役割がわかった。
細胞の乳酸とピルビン酸濃度の測定などの生物学的アッセイでは、感度、精度、サンプル サイズ、および比色/蛍光アッセイ キットのインキュベーション時間が劇的に改善されています。技術革新のおかげで、我々 はその小さなサイズを与えられた困難であるさまざまな代謝産物や線虫の大規模な文化なし中間代謝物を分析することができるされます。一般に、比色定量法の感度は蛍光アッセイ; より小さい大きさの順序ただし、比色方法は、一般的な実験室の設定でより適しています。この線虫が外骨格に囲まれているのでさらに、均質化および蛋白質の沈殿物を含む抽出法は線虫の細胞に乳酸とピルビン酸濃度の定量のために重要哺乳類培養細胞ライン4、5とは異なり、キューティクルと呼ばれます。ここでは、線虫からサンプル抽出のためのヒントを含む商業比色アッセイ キットを使用して乳酸とピルビン酸の濃度を分析するプロトコルについて述べる。
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Protocol
1. 同期c. の elegans文化
- 播種前、に文化エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) 一晩 300 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) スープ液体培地で 37 ° C で OP50 を歪します。-4 ° C で培養 OP50 ストア
- LB スープ液体培地を作るため、1 N NaOH の 1.5 mL の塩化ナトリウム 10 g、酵母エキス 5 g トリプトン 10 g を使用して脱イオン水で 1 L に追加。オートクレーブ。
注: OP50 と線虫の系統、線虫の遺伝学センター (ミネソタ大学、セントポール、ミネソタ州、米国) から。
- LB スープ液体培地を作るため、1 N NaOH の 1.5 mL の塩化ナトリウム 10 g、酵母エキス 5 g トリプトン 10 g を使用して脱イオン水で 1 L に追加。オートクレーブ。
- 線虫の成長媒体 (NGM) 寒天培地をするためには、塩化ナトリウム 3 g、ペプトンの 2.5 g、17 g の寒天を 975 mL の脱イオン水を使用します。オートクレーブ。55 ° C にし、薬液をクールな追加、順序、1 M MgSO4の 1 mL、1 mL の 1 M CaCl2、1 mL のエタノールと 1 M カリウム リン酸塩 pH 6.0 の 90 の 25 mL で 5 mg/mL コレステロール-mm シャーレ。
- 1 M のリン酸のカリウム pH 6.0、KH2PO4 108.3 g と K2HPO4、46.6 g を使用し、脱イオン水を 1 l. オートクレーブ6に追加します。
- 1-2 mL の培養 OP50 NGM 寒天プレート上を します。OP50 の薄層をするためには、すべての線虫を追加する前に室温で一晩版を孵化させなさい。
注: NGM 寒天接種 OP50 は、2-3 週間室温で保管することができます。 - 大人の段階まで、20 ° C で OP50 と文化 NGM 寒天プレート上に少なくとも 100 ワームを追加します。少なくとも 3 つのプレートが必要です。
- 子宮内で卵を収集、3 NGM 寒天培地の版から各 5 mL の 15 mL の円錐管に S バッファーと妊娠の両性具有を転送し、15 mL の 30 300 × gで遠心分離を用いた S バッファーで 3 回ワームを洗って室温で s。
- S バッファーを NaCl の 5.9 g と 50 mL 1 M カリウム リン酸塩 pH 6.0 の使用をするためには、脱イオン水で 1 L に追加します。オートクレーブ6。
- Axenization のアルカリ性の次亜塩素酸溶液中ワームを溶解し、卵分離を一括 (新鮮な漂白剤またはそれと同等の 0.5 mL: 5 ~ 6% ナトリウム次亜塩素酸 10 M NaOH、S バッファーの約 4.5 mL の 0.1 mL)6、そしてソリューションの略で 10-15 分反転による混合常温。
注: 15 分以内で成虫を解散すべき、(解放された卵は、実体顕微鏡を使用して確認する必要があります) その死体から解放された卵のぼんやりとしたソリューションを残してします。10 N NaOH の 0.1 mL のではなく、5 N NaOH の 0.2 mL を使用もできます。 - 次亜塩素酸治療後 S バッファーの 15 mL で 3 回卵ペレットを洗浄し、5-6 mL の S バッファーで再懸濁します。L1 期幼虫時代同期の文化のためのエシェリヒア属大腸菌なし S バッファーに 20 ° C で一晩培養中にリリースされた卵を孵化します。
- L1 期幼虫のおおよその数を調べるには、3 回以上の幼虫を再後 S バッファーの 10 μ L の実体顕微鏡を使用してワームをカウントし、平均を計算します。その後、転送 L1 期幼虫で OP50 (1,500-3,000 ワームは 1 皿 90 mm シャーレを使用して)、NGM 寒天プレートに 5 と、自家受精を開始、いくつかの卵は (通常 3 d の後置かれるとき、彼らは若い大人の段階に成長しているまで、20 ° C で培養ays)。
線虫の細胞画分の抽出
- 若い大人の段階 (5 日古い動物) S バッファー (図 1 a) と 5 NGM 寒天からワームを収集します。
- 30% (w/v) ショ糖に浮選のショ糖方法6を使用して生きているワームのみを選択すると、15 mL の円錐管に冷たい 60% (w/v) ショ糖の等量と S バッファーの 3-4 mL に懸ワームを混ぜます。スピンで 1,500 × g 15 管パスツール ピペット管の壁の外に移動によって新鮮なチューブにワーム、4 ° C および浮動削除で s。
- 30 1,500 × gで遠心分離によって S バッファーで 3 回ワームを洗って 4 ° C で s1,000 μ L ピペット チップ (図 1 b) を使用して遠心分離後洗浄ワームのウェットのボリュームを確認します。
- 蛋白質の沈殿物 (図 1) の氷冷 10% (w/v) トリクロロ酢酸 (TCA; 5% の最終的な集中) の等量を洗浄のワームを追加します。TCA、代わりに、過塩素酸 (PCA) やメタリン酸を使用できます。
- テフロン ホモジナイザー (ポッター エルベジェム組織グラインダー) で杵の 40 ストロークを使用して鉛塩法でワームを均質化、氷の上まで 1,300 rpm で回転。
- 磨砕液をパスツール ピペットで新鮮な 1.5 mL のマイクロ チューブに転送し、氷の上 20% のデューティ サイクル (1 分) に 3 回 3 分間超音波ホモジナイザーを用いた超音波照射します。
- 磨砕液を 4 ° C で 10 分間 8,000 × gで遠心分離によって明らかにします。4 つの m 島清を中和する (0.25 ボリューム 10 %tca) 氷と 8,000 の x gで 4 ° C で 10 分間遠心する上で 20 分間(テスト サンプル) として清次アッセイまで-80 ° C で保存できます。
3. 乳酸比色アッセイ キットを使用して試金
- 乳酸比色アッセイ キット (資材表) を使用して試料の濃度を測定します。テスト サンプルの二重検査を実施します。96 ウェル プレートにテスト サンプルの 5 または 10 μ L を追加し、キットに付属の乳酸アッセイ バッファーのウェルあたり 50 μ L にボリュームを調整します。
- 乳酸標準曲線の希釈 100 mM L (+)-乳酸標準 1 mm 乳酸アッセイバッファーで。追加 0、2、4、6、8、および 10 の μ L 1 mM L (+)-標準乳酸、井戸のシリーズにキットで提供されています。
- 各ウェルに反応混合物 (乳酸アッセイバッファー、DMSO、無水; すべての試薬はキットに付属のプローブ乳酸乳酸酵素ミックスの 46:2:2 を含む) またはバック グラウンド コントロール ミックス (アッセイバッファーの乳酸し、乳酸プローブの 48:2 を含む) の 50 μ L を追加します。サンプルは、光から保護されている間、30-60 分間室温でインキュベートします。
- 570 で各ウェルの吸光度を測定 nm マイクロ プレート リーダーを使用し、反応混合物の吸光度からバック グラウンド コントロール ミックスの吸光度を差し引きます。
- 乳酸標準曲線をプロットします。乳酸標準曲線から試料の乳酸濃度を計算します。
4. ピルビン酸アッセイ比色アッセイ キットを使用して
- 培養上清 (テスト サンプル) 比色アッセイ キット (資材表) を使用してのピルビン酸の濃度を測定します。テスト サンプルの二重検査を実施します。96 ウェル プレートにテスト サンプルの 10 μ L と作業試薬 (酵素ミックスと色素試薬、キットに付属の 94:1 を含む) の 90 μ L を追加し、サンプルは、光から保護されている間、30 分間室温でインキュベートします。
- 570 で各ウェルの吸光度を測定マイクロ プレート リーダーを使用して nm。
- ピルビン酸の標準曲線をプロットします。ピルビン酸標準曲線から試料のピルビン酸濃度を計算します。
5 蛋白質の試金蛋白質含有量の正規化のため
- 培養上清 (テスト サンプル) 比色アッセイ キット (資材表) を使用しての蛋白濃度を測定します。しかし、この手順、アッセイ キットに限定されない、タンパク質濃度を測定する他の方法を利用できます。
- 各総蛋白濃度を使用して試料の中で乳酸やピルビン酸濃度の値を正規化します。
注: テスト サンプルの蛋白質の集中が十分に蛋白質の沈殿物の後でさえも検出され、サンプル間の正規化ステップに利用されます。
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Representative Results
乳酸とピルビン酸濃度の定量比色試金を使用して、これらの試金はc. の elegans7,8以前のレポートと比較して精度を示した。ここでは、サンプル抽出中に蛋白質の沈殿物のプロセスは、正確な値を生成する最も重要なステップだった。蛋白質の沈殿物、一般的な沈殿のため (e.g。、TCA、PCA やメタリン酸) テスト サンプル (図 1) を準備する使用ことができます。ただし、線虫、ワーム (表 1) の均一化処理中の蛋白質の沈殿物を行うことが必要でした。精度に加えてこれらの試は小規模なサンプルの乳酸とピルビン酸の濃度を測定するため十分に敏感だったし、(両方のアッセイの反応インキュベーション時間は少なくとも 30 分間) の時間の短い期間でそれらを検出することができた ( 図 2-3)。実際には、我々 は最近レポート3のデータを提示しました。したがって、加齢に伴う代謝変化その携帯を示す乳酸レベルと高齢化、減少した結果 L/P 比cep 1変異3でまた異なるエネルギー代謝を示した検出でした。
図 1.細胞内代謝の抽出プロセス。(A) 1,500-3,000 のワームは、NGM 寒天プレート (90 mm シャーレ) に置かれました。5 つのプレート上でワームからの抽出は、比色試金のため十分でした。(B) プレートごと 3,000 および 1,500 のワームの 5 つのプレートから収集されたワームは、パネルの左右にそれぞれ示されます。各 15 mL チューブの両方ウェット ボリュームが < 0.5 mL、検出のために十分だったです。(C) 蛋白質の沈殿物の 10% を使用してワームの均質化中 TCA。圧力式ホモジナイザーで TCA 氷冷 10% にワームを追加するワームが均質化する前に実行するあります。それ以外の場合、細胞の乳酸とピルビン酸は、(データは表 1に示す) 比色アッセイ キットを使用してテスト サンプルで検出できません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.乳酸標準比色色素沈着パターン.を比色アッセイ キットを使用しての(A) 比色試金および L (+) の希釈系列で使用される 96 ウェル プレートの井戸-乳酸標準。乳酸濃度を増加させるより強いピンク色になりました。BG は、希釈系列に対する乳酸プローブの背景を示しています。(B) 乳酸比色試金のための標準的な曲線。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.ピルビン酸標準比色色素沈着パターン.を比色アッセイ キットを使用しての(A) 比色試金およびピルビン酸標準希釈系列を用いた 96-well 版の井戸。ピルビン酸濃度の増加は、増加軽いピンク着色で起因しました。(B) ピルビン酸比色試金のための標準的な曲線。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| テスト サンプル | 乳酸 (mM) | ピルビン酸 (mM) |
| 均質化の中にタンパク質沈殿サンプル | 3.07 ± 0.94 | 0.22 ± 0.08 |
| 均質化後のサンプルのタンパク質沈殿 | ND | ND |
| 均質化と超遠心法 * の後そのまま内局 | 1.12 | 0.06 |
表 1.細胞の乳酸と野生型の N2 の 5 日古い動物のピルビン酸の検出のための異なるタイミングで蛋白質の沈殿物の影響。データは、平均 + 標準偏差 (SD) の少なくとも 3 つの決定を示します。ND は検出されなかったことを示します。* 抽出プロセスは、予め蛋白質の沈殿物なし超遠心法を用いて行った。
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Discussion
これらの比色アッセイ キットを利用して、細胞の乳酸を検出するサンプル抽出の最も重要なステップと正確にc. の elegansのピルビン酸は均質化 (図 1) の間に蛋白質の沈殿物の処理にです。厳密に他ホモジナイザーとしてテフロン ホモジナイザーを使用する必要はありません (e.g。、Dounce 組織グラインダー、またはビード ミルズをテーパーと) ワームの小規模の抽出にも適しています。ない蛋白質の沈殿物前にホモジナイザーを使用して抽出した試料で細胞の乳酸とピルビン酸を検出我々 でした。さらに、乳酸とピルビン酸のレベルは蛋白質の沈殿物 (表 1) ではなく超遠心法を用いて分離細胞質画分に大幅に減少しました。これらは、サンプル抽出が線虫C. elegansを用いた生化学的手法で細胞の代謝物を検出する重要な示唆されました。蛋白質の沈殿物のためだけでなく、TCA、またいくつかの沈殿 (PCA やメタリン酸) 生化学的方法論7,9に利用できます。以前の報告によると TCA の使用は血中乳酸とピルビン酸の酵素的測定における NADH の約 12% の消失につながった。したがって、著者らは結論9の試金の酵素を使用してとき、乳酸とピルビン酸の沈殿のタンパク質として、5% メタリン酸を選択必要があります。TCA は、部分的に多くの酵素を含む蛋白質を変化させることが示唆された.しかし、問題はなかったタンパク質沈殿に関する比色試金を使用して細胞の乳酸やピルビン酸を検出する場合。
この研究では、乳酸とピルビン酸 (図 2および 図 3) 定量法の商業の比色アッセイ キットを使用しました。その感性やサンプル サイズは以前アッセイ キット7; と比較して優れていたしたがって、小さい規模の抽出法を用いた試料を作製し、 c. の elegans3細胞の乳酸とピルビン酸の濃度の違いを報告しました。我々 は野生型線虫の乳酸と結果 L/P 比の加齢に伴う減少を検出され、p53/セップ-1 では、その転写制御ターゲットの活性化を介してエネルギー代謝の加齢に伴う変化の重要な役割が検出2,3。 したがって、線虫のエネルギー代謝の解析が有利の部分で、少なくとも改善比色アッセイ キットの使用により進みます。
図 3Bに示すとおり、2 mM 以下の乳酸濃度はこの比色定量法 (蛍光アッセイではない) に実際に大きい傾向があります。したがって、蛍光アッセイは、乳酸のより正確な測定に適して可能性があります。これらのアッセイ キットの機能は、ユーザーの研究室ではアプライアンスへの応答の試金を選択するよう、比色、蛍光アッセイをサポートします。定量的細胞代謝産物の濃度を決定する存在の商業の比色アッセイ キットを使用するよりも高価です。ただし、一般的な楽器と吸光光度プレート リーダーを使用してより小さい実験室試験を適切に実行できます。
これまで、モデル生物の線虫みみずの遺伝学的研究5と比較して大規模な文化を必要とする従来の生化学的アプローチを使用して比較的少数の報告があります。ただし、生物学的アッセイ系の最近の顕著な進歩 (e.g、感度とアッセイ キットの安定性の向上)線虫、小さな未満 1000 個の細胞から成っているよりは、線虫を用いた研究は、。魅力的な簡単に研究室で行われます。今後は、効果的なメタボローム解析質量分析法 (MS) とガスクロマトグラフィー/質量分析法 (GC/MS) を使用して大規模な文化、感度、特異性などの特定の問題を軽減することができ、解明するのに役立ちますがん10を含む病気は高齢化、人間の細胞の代謝の役割。今後は、比色アッセイ キットなど、簡単に方法論はより正確な機器分析前のスクリーニング ツールとして有効でしょう。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、角野ヤナセに大東文化大学から特別研究助成によって支えられた財政的に。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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