Summary
우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.
Abstract
젖 산 염 그리고 pyruvate는 세포내 에너지 대사 경로의 핵심 중간체. 셀에 젖/pyruvate 비율 모니터링 연령과 관련 된 에너지 대사 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 및 호 기성 분해 사이에서 불균형이 있는지 여부를 확인 도움이 됩니다. 여기, 우리는 모델 유기 체 C. 선 충에 젖 산 염 그리고 pyruvate에 대 한 상업 색도계 분석 실험 키트 활용을 보여줍니다. 최근, 감도 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 정확도 개선 되었습니다 크게 연구 및 개발 시 약 제조 업체에 의해 실시. 향상 된 시 약은 C. 선 충에서 96 잘 접시와 함께 소규모 분석 실험의 사용을 활성화 했습니다. 일반적으로, fluorimetric 분석 결과 우수한 감도 색도계 분석 결과; 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실에서 사용에 대 한 더 적합 합니다. 양적 결정에 대 한 이러한 분석에 또 다른 중요 한 문제는 무 균된 C. 선 충 의 단백질 강 수 샘플. 우리의 단백질 강 수 방법에서는, 일반적인 침 (예., trichloroacetic 산과 염소 산 및 metaphosphoric 산) 샘플 준비를 위해 사용 됩니다. 분석 결과 단백질 무료 샘플 직접 균질 동안 차가운 비례적 (최종 농도 5%)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다.
Introduction
젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 에너지 대사의 중간체로 널리 그리고 분해, tricarboxylic 산 (TCA) 사이클, 에어로빅 생물의 세포에서 전자 전송 체인의 상태를 관련이 있습니다. 분해 반응의 시리즈 포도 당 변화 기로에 놓여 있으며 gluconeogenesis, 지방산 및 아 세 틸 coa, 통해 에너지 대사를 통해 탄수화물과 아미노산 알라닌 개조 될 수 있다 pyruvate에 산화. TCA 주기 충분 한 용 존된 산소의 존재에서 발생 하 고 포도 당 에너지 변환에 대 한 근본 이다. 특히, 보조 대사의 변경 분해 에너지 생산을 위한 주로 사용 되는 흥미로운 현상을 이며 TCA 주기 및 전자 전송 체인을 포함, 에어로빅 미토 콘 드리 아 호흡 downregulated 포유류 암에서 세포1,2. 우리는 최근 젖 산 수준 및 필연적인 젖/pyruvate (L/P) 비율은 감소 모델 유기 체 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 노화 동안 보였다. 마찬가지로, 우리는 C. 선 충 에 포유류 종양 억제기 p53 ortholog CEP-1는 transcriptional 대상3의 활성화를 통해 에너지 대사의 연령 관련 변경에 중요 한 역할은 발견.
셀, 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 측정 등 생물학 분석 실험에 감도, 정확도, 샘플 크기 및 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 부 화 시간이 개선 되었습니다 극적으로. 기술 혁신으로 인하여 우리 지금 분석 다양 한 대사 산물 및 중간 대사 산물의 C. 선 충, 대규모 문화 없이 작은 크기를 주어 어려운 수 있다. 일반적으로 색도계 분석 실험의 감도 fluorimetric 분석 결과;의 그것 보다는 더 작은 크기 순서 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실의 설정에 더 적합 합니다. 이 선 충이 류는 외 골격에 묶여 있기 때문에 또한, 균질 및 단백질 강 수를 포함 하는 추출 기법 선 충 C. 셀에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정 결정적 이다 포유류 배양된 세포 라인4,5와 달리 표 피를 라고합니다. C. 선 충에서 샘플 추출에 대 한 팁을 포함 하 여 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 분석 하는 프로토콜을 설명 합니다.
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Protocol
1. C. 선 충 의 동기화 된 문화
- 시드, 전에 문화 대장균 (대장균) 변형 OP50 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 국물 액체 매체의 300 mL에 37 ° C에서. -4 ° c.에 교양된 OP50 저장
- LB 국물 액체 매체, tryptone의 10 g, 효 모 추출 물 5g, NaCl의 10 g 1 N NaOH의 1.5 mL를 사용 하 여와 이온 물 1 L에 추가. 오토 클레이 브.
참고: OP50 및 C. 선 충 종자는 꼬마 유전학 센터 (미네소타의 대학, 세인트 폴, 미네소타, 미국)에서 사용할 수 있습니다.
- LB 국물 액체 매체, tryptone의 10 g, 효 모 추출 물 5g, NaCl의 10 g 1 N NaOH의 1.5 mL를 사용 하 여와 이온 물 1 L에 추가. 오토 클레이 브.
- 선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 하 게, NaCl의 3 세대, 펩의 2.5 g, 한 천의 17 g 및 이온된 수의 975 mL을 사용 합니다. 오토 클레이 브. 55 ° C, 다음 sterilely 멋진 추가, 순서, 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 5mg/mL EtOH, 및 25 mL 1 M 칼륨 인산 염 pH 90에서 6.0의 콜레스테롤의 1 mL-mm 페 트리 접시.
- 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0에 대 한 KH2포4 108.3 g와 K2HPO4, 46.6 g 사용 하 고 1 L. 압력솥6이온된 수를 추가 합니다.
- 1-2 mL NGM 한 천 배지에서 배양된 OP50의 확산. OP50의 얇은 층을 하려면 어떤 nematodes을 추가 하기 전에 실 온에서 하룻밤 번호판을 품 어.
참고:는 NGM agar 접시 접종된 OP50는 2-3 주 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다. - 성인 단계까지 20 ° C에서 OP50, 및 문화 NGM 천 배지에 적어도 100 벌레를 추가 합니다. 적어도 3 개의 격판덮개는 필요 합니다.
- Utero에서달걀 수집, 전송 3 NGM 한 천 격판덮개에서 각 15 mL 원뿔 튜브에 S 버퍼의 5 mL와 함께 광고에 나온 벗 것을 3 번 30 300 x g 에서 원심 분리를 사용 하 여 S 버퍼의 15 mL와 함께 벌레를 씻어 실 온에서 s.
- NaCl의 5.9 g 50 mL의 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0 사용 하 여 S 버퍼 수 있도록, 이온 물 1 L를 추가 합니다. 압력솥6.
- Axenization에 대 한 알칼리 성 차 아 염소 산 용액에 벌레를 해산 하 고 그 절연을 대량 (신선한 표 백제 또는 동급의 0.5 mL: 5-6% 염소, 10 M NaOH, S 버퍼의 약 4.5 mL의 0.1 mL)6, 10-15 분에 솔루션을 서 반전에 의해 혼합과 룸 온도입니다.
참고: 15 분 이내 어른 벌레 해야 디졸브, 계란 (해방된 계란은 입체 현미경으로 확인 되어야 한다) 그들의 시체에서 해방의 흐릿한 솔루션을 떠나. 10 N NaOH의 0.1 mL, 대신 5 N NaOH의 0.2 mL도 사용할 수 있습니다. - 차 아 염소 산 처리 후 3 번 S 버퍼의 15 mL와 함께 계란 펠 릿을 세척 하 고 S 버퍼의 5-6 ml에서 resuspend. L1 무대 애벌레의 동기 나이 문화에 대 한 대장균 없이 S 버퍼에 20 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 나온된 계란을 부 화 한다.
- L1 무대 애벌레의 대략적인 수를 확인 하려면 resuspending 애벌레 적어도 3 번 후 S 버퍼의 10 µ L에 입체 현미경을 사용 하 여 웜 세 고 평균을 계산. OP50 (1500-3000 벌레 당 90 mm 페 트리 접시를 사용 하 여 접시), 5 NGM 한 천 배지를 L1 무대 애벌레를 전송 그리고 그들은 젊은 성인 단계는 self-fertilization 시작 하 고 몇 알 (일반적으로 3 d 후 레이아웃 성장해 왔습니다 때까지 20 ° C에서 문화 ays)입니다.
2. C. 선 충 에서 셀룰러 분수의 추출
- 젊은 성인 단계 (5-하루-오래 된 동물) S 버퍼 (그림 1A)와 5 NGM 한 천 배지에서 벌레를 수집 합니다.
- 30% (w/v) 자당에 부양에 대 한 자당 방법6 을 사용 하 여 살아있는 벌레만을 선택, 15 mL 원뿔 튜브에 얼음 처럼 차가운 60% (w/v) 자당의 동등한 양으로 S 버퍼의 3-4 mL에 벌레를 혼합 한다. 1500 x g 15에서 튜브를 회전 s 4 ° C 및 부동 제거에 파스퇴르 피 펫과 튜브의 벽에서 이동 하 여 신선한 튜브로 벌레.
- 1500 x g 30에 원심 분리에 의해 3 번 S 버퍼와 벌레를 씻어 4 ° c.에 s 1000 µ L micropipette 팁 (그림 1B)를 사용 하 여 원심 분리 후 세척된 벌레의 젖은 볼륨을 확인 합니다.
- 단백질 강 수 (그림 1C)에 대 한 차가운 10% (w/v) trichloroacetic 산 (TCA, 5%의 최종 농도)의 동일한 볼륨을 씻어 벌레를 추가 합니다. TCA, 대신과 염소 산 (PCA) 또는 metaphosphoric 산 사용할 수 있습니다.
- 얼음에 1300 rpm 까지의 회전 테 플 론 균질 화기 (포터 Elvehjem 조직 분쇄기)에 유 봉의 40 스트로크를 사용 하 여 비례적으로 벌레를 균질.
- 파스퇴르 피 펫과 신선한 1.5 mL microtube에는 homogenate를 전송 하 고 3 분 (3 시간 1 분) 20% 듀티 사이클 얼음에 대 한 초음파 균질 화기를 사용 하 여 sonicate.
- 4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여는 homogenate를 명확히 4 m 코 supernatants 중화 (0.25 볼륨 10 %TCA), 얼음에 4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리기 20 분 (테스트 샘플)로 상쾌한 다음 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
3. 젖 산 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여
- 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 테스트 샘플에 있는 젖 산의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 테스트 샘플의 5 또는 10 µ L 96 잘 접시에 추가 하 고 젖이 나올 시험 버퍼 키트와 함께 제공 잘 당 50 µ L 볼륨을 조정 합니다.
- 젖 산 표준 곡선에 대 한 희석 100 m m L (+)-젖이 나올 표준 1 mm 젖이 나올 시험 버퍼. 0, 2, 4, 6, 8, 및 10 µ L 1 m m L의 (+)를 추가-젖이 나올 표준, 우물의 시리즈에는 키트와 함께 제공 되는.
- 각 잘에 반응 믹스 (젖이 나올 시험 버퍼, DMSO, 무수; 모든 시 약 키트와 함께 제공 됩니다에서 프로브 젖이 나올 젖이 나올 효소 혼합 46:2:2 포함) 또는 배경 제어 믹스 (프로브 젖이 나올 젖이 나올 시험 버퍼의 48:2 포함)의 50 µ L를 추가 그리고 샘플은 빛 으로부터 보호 하는 동안 30-60 분 동안 실내 온도에 품 어.
- 각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여 배경 제어 혼합 반응 혼합의 흡 광도에서 흡 광도 뺍니다.
- 젖 산 표준 곡선을 플롯. 젖 산 표준 곡선에서 테스트 샘플의 젖 산 농도 계산 합니다.
4. pyruvate 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여
- 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에 pyruvate의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 96 잘 접시에 테스트 샘플의 10 µ L 및 작업 시 약 (효소 혼합 및 염료 시 약 키트와 함께 제공 되는 94:1를 포함 하는)의 90 µ L을 추가 하 고 샘플 빛 으로부터 보호 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어.
- 각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.
- Pyruvate 표준 곡선을 플롯. Pyruvate 표준 곡선에서 테스트 샘플의 pyruvate 농도 계산 합니다.
5. 단백질 단백질 콘텐츠 정규화에 대 한 분석 결과
- 색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에서 단백질 농도 측정 합니다. 그러나,이 단계는 분석 결과 키트에 국한 되지 않습니다 그리고 다른 접근 단백질 농도 측정 하기 위하여 이용 될 수 있다.
- 각 총 단백질 농도 사용 하 여 테스트 샘플 중 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 값을 정상화.
참고: 테스트 샘플에 있는 단백질 농도 단백질 강 수 후에 충분히 감지 되 고 샘플 중 정규화 단계에 대 한 활용.
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Representative Results
젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정에 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 선 충 C.7,8이전 보고서와 비교 분석 하는 이러한 실험의 정확도 보였다. 여기, 샘플 추출 하는 동안 단백질 강 수 과정은 정확한 값을 생성 하는 가장 중요 한 단계. 단백질 강 수, 일반적인 침에 대 한 (예., TCA, PCA, 또는 metaphosphoric 산) 테스트 샘플 (그림 1)를 준비 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, C. 선 충에 벌레 (표 1)의 균질 동안 단백질 강 수를 수행 하는 데 필요한 했다. 정확도, 뿐만 아니라 이러한 분석 충분히 민감한 소규모 샘플에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 측정 하 고 (두 분석 실험의 반응 외피에 적어도 30 분) 시간의 짧은 기간에 그들을 감지할 수 ( 그림 2-3). 사실, 우리는 최근 보고서3에 데이터를 제시. 따라서, 우리는 나이 관련 대사 변경 그 휴대를 나타내는 젖이 나올 수준 및 필연적인 L/P 비율 노화, 동안 감소 하 고 우리 또한 cep 1 돌연변이3다른 에너지 대사를 보여주었다 검출할 수 있었다.
그림 1 . 세포 대사 산물의 추출 과정. (A) 1500-3000 웜 NGM 천 배지 (90 mm 페 트리 접시)에 배치 했다. 5 접시에 벌레에서 추출이 했다 색도계 분석 실험에 대 한 충분 한. (B) 웜 접시 당 3000와 1500 벌레의 5 판에서 수집한 각각 왼쪽과 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 모두 젖은 볼륨 각 15 mL 튜브에는 < 0.5 mL, 검색에 대 한 충분 한 했다입니다. (C) 단백질 강 수 10%를 사용 하 여 벌레의 균질 동안 TCA. 얼음 처럼 차가운 10%로 벌레를 추가 TCA는 균질 화기에 벌레는 무 균 하기 전에 수행할 수 있다. 그렇지 않으면, 셀룰러 젖 산 염 그리고 pyruvate (데이터는 표 1에 나와 있다) 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 테스트 샘플에서 감지할 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 젖 산 표준 색도계 염색 패턴 . 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 (A) 색도계 분석 실험 및 L (+)의 희석 시리즈에 사용 된 96 잘 접시의 우물-젖 산 표준. 더 강렬한 핑크 색상 결과 젖 산 농도 증가. BG 희석 시리즈에 대 한 젖 프로브의 배경을 나타냅니다. (B) 젖 색도계 분석 결과 대 한 표준 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . Pyruvate 표준 색도계 염색 패턴 . 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 (A)의 색도계 분석 결과, 표준 pyruvate의 희석 시리즈를 사용 하 여 96 잘 접시의 우물 증가 빛 분홍색 착 색 결과 pyruvate 농도의 증가. (B) pyruvate 색도계 분석 결과 대 한 표준 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 테스트 샘플 | 젖 (mM) | Pyruvate (mM) |
| 균질 동안 단백질을 시 켰 던 샘플 | 3.07 ± 0.94 | 0.22 ± 0.08 |
| 균질 후 단백질을 시 켰 던 샘플 | ND | ND |
| 균질과 ultracentrifugation * 후 그대로 cytosolic 분수 | 1.12 | 0.06 |
표 1. 세포 젖 산 및 야생-타입 n 2의 5-하루-오래 된 동물에 pyruvate의 검출을 위한 다른 타이밍에 단백질 강 수의 효과. 데이터는 의미 + 3 개 이상 결정의 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. ND를 발견 하지 나타냅니다. * 추출 과정 예비 단백질 강 수 없이 ultracentrifugation을 사용 하 여 수행 되었다.
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Discussion
이러한 색도계 분석 실험 키트를 활용 하면 샘플 추출 세포 젖 산을 감지 하는 가장 중요 한 단계 및 pyruvate C. 선 충 에 정확 하 게 균질 (그림 1) 동안 단백질 강 수 과정입니다. 그것은 엄격 하 게 다른 균질으로 테 플 론 균질 화기를 사용 하는 데 필요한 (예., Dounce 및 조직 그 라인 더, 또는 비드 밀 테이퍼)는 또한 벌레의 소규모 추출에 적합. 우리 검색 하지 못했습니다 셀룰러 젖 산 염 그리고 pyruvate 단백질 강 수 전에 균질 화기를 사용 하 여 추출 된 테스트 샘플에. 게다가, 젖 산 염 그리고 pyruvate 레벨 단백질 강 수 (표 1) 대신 ultracentrifugation를 사용 하 여 분리 cytosolic 분수에 크게 감소 합니다. 이러한 샘플 추출 중요 한 생 화 학적 방법론 C. 선 충선 충 류를 사용 하 여 세포 대사를 감지 하는 것이 좋습니다. 단백질 강 수에 대 한 생 화 학적 방법론7,9TCA 뿐만 아니라 또한 여러 다른 침 PCA (metaphosphoric 산)를 활용할 수 있습니다. 이전 보고서에 따르면 TCA 사용 하 여 혈액 젖 산 염 그리고 pyruvate의 효소 측정에서 NADH의 약 12%의 실종 귀착되는. 따라서, 저자 결론 그 5 %metaphosphoric 산 성 젖 산 염 그리고 pyruvate에 대 한 precipitant 단백질9분석 실험 효소를 사용 하 여 때를 선택 해야 합니다. 그것은 TCA 부분적으로 많은 효소를 포함 하는 단백질을 변성 나왔다. 그러나, 우리는 단백질 침에 관한 아무런 문제가 색도계 분석 실험을 사용 하 여 셀룰러 젖 산 염 그리고 pyruvate를 감지 했다.
이 연구에서 우리는 젖 산 염 그리고 pyruvate (그림 2 및그림 3 )의 양적 결정에 대 한 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용. 그들의 감도 샘플 크기 이전 시험 키트7;에 비해 우수 했다 따라서, 우리는 작은 규모 추출을 사용 하 여 테스트 샘플을 준비 하 고 C. 선 충3세포 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도에 차이 보고. 우리는 야생-타입 C. 선 충 에 나이 관련 젖 산 및 필연적인 L/P 비율 감소를 감지 하 고 p53/CEP-1에는 나이 관련 된 transcriptional 대상의 활성화를 통해 에너지 대사의 중요 한 역할은 발견 2 , 3. 따라서, 선 충 류 선 충 C. 신진 대사 에너지의 분석은 advantageously 때문에 적어도 부분에서 향상 된 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 진행.
그림 3B에서 같이, 2mm 아래 젖 산 농도 실제로이 색도계 분석 결과 (하지 fluorometric 분석 결과)에 큰 경향이 있다. 따라서, fluorometric 분석 결과 젖 산의 더 정확한 측정에 적합 수 있습니다. 이러한 분석 결과 키트의 기능 지원 색도계 및 fluorometric 분석 실험, 분석 결과 사용자의 실험실에서 기기에 대 한 응답에서 선택 되도록. 그것은 현재 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 양적 세포 대사 산물의 농도 결정을 아직 더 비싸다입니다. 그러나, 재판 일반적인 악기와 spectrophotometric 플레이트 리더를 사용 하 여 더 작은 실험실에서 적절 하 게 수행할 수 있습니다.
지금까지, 모델 생물 C. 선 충, 일반적으로 웜, 유전자 연구5와 비교의 대규모 문화 필요에 기존의 생화학 적인 접근을 사용 하 여 상대적으로 적은 보고서 있습니다. 그러나, 생물 학적 분석 결과 시스템의 최근 놀라운 진행 (예., 감도 분석 키트의 안정성의 개선) C. 선 충, 작은 이며 이루어져 미만 1000, 더 선 충 류를 사용 하 여 연구 매력적인 그리고 실험실에서 쉽게. 이제부터, 질량 분석 (MS)와 가스 크로마토그래피/질량 분석 (GC/MS)를 사용 하 여 효과적인 metabolomic 분석 대규모 문화, 분석 감도, 특이성, 등 특정 문제를 줄이기 위해 도울 수 하 고 명료 하 게 하는 데 도움이 됩니다. 암10를 포함 하 여 에이징 및 인간 질병에 세포질 물질 대사의 역할. 앞 색도계 분석 실험 키트 등 쉽게 방법론, 더 정확 하 게 경 음악 분석에 앞서 심사 도구로 효과적인 것입니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품 Sumino 지금에 다이토 문화 대학에서 특별 한 연구 보조금에 의해 재정적으로 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
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