Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57807
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Department of Health Science, School of Sports & Health Science, Daito Bunka University, 2Department of Molecular Life Science, School of Medicine, Tokai University, 3Department of Health Management, School of Health Study, Tokai University

Summary

Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.

Abstract

Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.

Introduction

Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котором гликолиз используется преимущественно для производства энергии и аэробных митохондриальное дыхание, который включает цикл ТСА и электрон-транспортной цепи, downregulated в млекопитающих рака клеток в1,2. Недавно мы показали, что уровень лактата и последующее лактата в пирувата (L/P) соотношение уменьшилось во время старения в организме модель Caenorhabditis elegans (C. elegans). Аналогичным образом мы обнаружили, что млекопитающих опухоли ortholog подавитель p53 ВИС-1 в C. elegans имеет важную роль в возрастных изменений метаболизма энергии путем активации его транскрипционный анализ цели3.

В биологических анализов, например измерения концентрации лактата и пирувата в клетках чувствительность, точность, размер выборки и время инкубации колориметрии/Флуориметрическое пробирного комплектов были улучшены резко. Благодаря технологическим новшествам теперь мы можем анализировать различные метаболиты и промежуточных метаболитов без крупномасштабных культуры C. elegans, который трудно, учитывая ее небольшие размеры. В общем чувствительность колориметрического анализа является на порядок меньше, чем Флуориметрическое анализа; Однако колориметрические подход больше подходит в установлении общих лабораториях. Кроме того метод извлечения, содержащие гомогенизации и белка осадков имеет решающее значение для количественного определения концентраций лактата и пирувата в C. elegans клетки, потому что этот нематода заключена в экзоскелет под названием кутикулы, в отличие от mammalian клетки культивировали линии4,5. Здесь мы описываем протокол для анализа концентрации лактата и пирувата, с помощью коммерческих колориметрического анализа комплектов, включая советы для извлечения образца из C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. синхронизированные культуры C. elegans

  1. Перед посевом, культура Escherichia coli (E. coli) штамма ОР50 на ночь при 37 ° C в 300 мл жидкой среды бульон Бертани Лурия (LB). Магазин искусственный ОР50-4 ° c.
    1. Чтобы сделать LB отвара жидкой среды, используйте 10 g Триптон, 5 г экстракта дрожжей, 10 г NaCl и 1,5 мл 1 N NaOH и добавить 1 Л деионизированной водой. Автоклав.
      Примечание: ОР50 и C. elegans штаммы доступны из центра генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, Сент-Пол, Миннесота, США).
  2. Чтобы сделать нематоды роста среднего (НГМ) агар, используйте 3 g NaCl, 2.5 g Пептон, 17 g агар и 975 мл деионизованной воды. Автоклав. Охладить до 55 ° C, а затем среду добавить в заказ, 1 мл 1 М MgSO4, 1 мл CaCl 1 M2, 1 мл 5 мг/мл холестерина в EtOH и 25 мл 1 М фосфат калия pH 6.0 в 90-мм Петри.
    1. 1 M калия фосфат pH 6.0 используйте 108.3 g KH2PO4 и 46,6 g K2HPO4и Добавьте деионизированной воды до 1 л автоклав6.
  3. Распространение 1-2 мл культивировали ОР50 на плитах агара NGM. Чтобы сделать тонкий слой ОР50, Инкубируйте пластины на ночь при комнатной температуре перед добавлением любой нематод.
    Примечание: NGM плиты агара привитых ОР50 может храниться при комнатной температуре на 2-3 недели.
  4. Добавьте по крайней мере 100 червей на NGM агар пластину с ОР50 и культуры при 20 ° C до стадии взрослого. Требуется по меньшей мере три пластины.
  5. Собирать яйца в утробе матери, передачи беременных гермафродитки из трех NGM плиты агара каждый с 5 мл буфера S в 15 мл Конические трубки и мыть червей 3 раза с 15 мл S буфера с помощью центрифугирования в 300 x g 30 s при комнатной температуре.
    1. Чтобы сделать S буфера, использовать 5,9 г NaCl и 50 мл 1 М калия фосфат pH 6.0, добавьте 1 Л деионизированной водой. Автоклав6.
  6. Распустить червей в щелочной гипохлорита раствор для axenization и сыпучие яйцо изоляции (0,5 мл свежего отбеливатель или эквивалент: 5-6% гипохлорита натрия, 0,1 мл 10 M NaOH, примерно 4,5 мл буфера S)6, и постоять 10-15 мин на решение комнатной температуре с перемешиванием, инвертирование.
    Примечание: В течение 15 мин, взрослых червей следует распустить, оставляя туманно решение яиц, освобожденных от их туши (освобожденных яйца должны быть подтверждены с помощью стереоскопического микроскопа). Вместо 0,1 мл 10 N NaOH 0,2 мл 5 N NaOH может также использоваться.
  7. После лечения гипохлорита мыть яйца гранулы 3 раза с 15 мл буфера S и Ресуспензируйте в 5-6 мл S буфера. Люк выпустила яйца во время ночи инкубации при 20 ° C в буфере S без E. coli возраст синхронных культуры L1 стадии личинок.
  8. Чтобы определить приблизительное количество L1 стадии личинки, граф червей с помощью стереоскопического микроскопа в 10 мкл буфера S после resuspending личинки по крайней мере 3 раза и вычислить среднее значение. Затем передавать L1 стадии личинки пяти NGM плиты агара с ОР50 (1500-3000 червей за пластины с помощью Петри 90 мм) и культура при 20 ° C до тех пор, пока они выросли на молодых взрослых сцену, когда начинается самооплодотворения и несколько яиц (обычно после 3 d Айс).

2. Добыча сотовой дроби от C. elegans

  1. Соберите молодой взрослый этап (5-дневных животных) червей из пяти NGM плиты агара с S буфера (рис. 1A).
    1. Чтобы выбрать только жизни червей с помощью метода сахарозы6 для флотации на 30% (w/v) сахарозы, смешайте приостановлено в 3-4 мл буфера S с равным объемом ледяной 60% (w/v) сахарозы в 15 мл Конические трубки червей. Спина трубки на 1500 x g 15 s при 4 ° C и удалить плавающей червей в свежий трубку, перемещая их за пределы стенки трубки с пипетка Пастера.
  2. Моют червей 3 раза с буфером S центрифугированием на 1500 x g за 30 сек при 4 ° C. Проверьте мокрой объем промывают червей после центрифугирования, используя кончик микропипеткой 1000 мкл (рис. 1B).
  3. Добавьте промытый червей равным объемом ледяной 10% (w/v) трихлоруксусной кислоты (TCA; конечной концентрации 5%) для белка осадков (рис. 1 c). Вместо того чтобы ТКА может использоваться хлорной кислоты (PCA) или metaphosphoric кислоту.
  4. Однородный червей с осадителя, используя 40 ударов пестика в тефлоновой гомогенизатора (Поттер-Elvehjem ткани мясорубку) с вращением на до 1300 об/мин на льду.
  5. Передача огневки в свежий Микропробирка 1.5 мл с пипетка Пастера и sonicate с помощью ультразвуковой гомогенизатор для 3 мин (3 раза по 1 мин) с 20% Рабочий цикл на льду.
  6. Уточнить огневки центрифугированием в 8000 x g 10 мин при 4 ° C. Нейтрализовать supernatants с 4 M Кох (0,25 объем до 10% TCA) за 20 минут на льду и центрифуги на 8000 x g 10 мин при 4 ° C. Супернатант (как образец теста) могут храниться при температуре-80 ° C до следующих анализов.

3. лактата Assay с помощью колориметрических Assay Kit

  1. Измерение концентрации лактата в образцы с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Осуществляют дуплекс экзамены для испытательных образцов. 5 или 10 мкл испытательных образцов на 96-луночных тарелку и отрегулировать громкость до 50 мкл в колодец с Assay Buffer лактат, комплект.
  2. Для стандартной кривой лактат, разбавляют 100 мм L (+)-лактат стандарт до 1 мм с лактата Assay Buffer. Добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл 1 мм L (+)-лактат стандарт, который предоставляется с комплектом, в ряд скважин.
  3. 50 мкл реакции Mix (содержащие 46:2:2 лактат Assay Buffer, микс фермента лактата и лактата зонд в ДМСО, безводный; все реагенты предоставляются в комплект) или фон управления Mix (содержащие 48:2 лактат Assay Buffer и лактата зонд) в каждой скважине и инкубации при комнатной температуре за 30-60 мин, в то время как образцы защищены от света.
  4. Измерение поглощения каждой скважины на 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов и вычесть поглощения фон управления Mix от поглощения смеси реакции.
  5. Участок лактат калибровочной кривой. Рассчитайте концентрации лактата испытательных образцов из лактата калибровочной кривой.

4. пируват Assay с помощью колориметрических Assay Kit

  1. Измерьте концентрацию пирувата в supernatants (пробы) с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Осуществляют дуплекс экзамены для испытательных образцов. Добавить 10 мкл испытательных образцов и 90 мкл рабочего реагента (содержащие 94:1 фермента смеси и краска реагента, которые предоставляются в комплект) в 96-луночных плиту и инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин, в то время как образцы защищены от света.
  2. Измерение оптической плотности каждой скважины на 570 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
  3. Участок пируват калибровочной кривой. Рассчитайте концентрации пируват испытательных образцов из пирувата калибровочной кривой.

5. белка Assay для нормализации с содержанием белка

  1. Измерьте концентрацию белка в supernatants (пробы) с помощью колориметрических пробирного kit (Таблица материалов). Однако этот шаг не ограничивается пробирного комплект, и другие подходы могут быть использованы для измерения концентрации белка.
  2. Нормализовать значения концентраций лактата и пирувата среди образцы с использованием каждого концентрации общего белка.
    Примечание: Концентрация белка в испытательных образцов обнаруживается достаточно даже после осадков белок и используется для нормализации шага среди образцов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью колориметрических анализов для количественного определения концентрации лактата и пирувата, мы показали точность этих анализов, по сравнению с предыдущими докладами в C. elegans7,,8. Здесь процесс белка осадков во время извлечения образца был наиболее важным шагом для создания точных значений. Для осадков белок, общие выделений (например., ТСА, СПС, или metaphosphoric кислоты) может использоваться для подготовки проб (рис. 1). В C. elegansоднако, это было необходимо для выполнения белка осадков во время гомогенизации червей (Таблица 1). В дополнение к точности, эти анализы были достаточно чувствительным для измерения концентрации лактата и пирувата в небольших образцов и были в состоянии обнаружить их в короткий период времени (время реактивной инкубации обоих анализов по крайней мере 30 мин) ( Рисунок 2-3). На самом деле мы представили данные в недавних докладе3. Таким образом мы могли обнаружить возрастных метаболических изменений, указывающее, что сотовые лактата уровни и последующее соотношение L/P снизились во время старения, и мы также показали различные энергии метаболизма в ВИС-1 мутант3.

Figure 1
Рисунок 1 . Процесс извлечения сотовых метаболитов. (A) 1500-3000 червей были помещены на плите агар NGM (90-мм Петри). Извлечение из червей на пяти плит было достаточно для колориметрических анализов. (B) червей, собранных из пяти плит 1500 и 3000 червей на пластину, указаны на левой и правой стороне панели, соответственно. Обе влажные томов в каждой тюбике 15 мл являются < 0,5 мл, которого было достаточно для обнаружения. (C) белок осадков с использованием 10% TCA во время гомогенизации червей. Добавление червей в ледяной 10% ТСА в гомогенизатор должна быть выполнена до гомогенизированный червей. В противном случае невозможно обнаружить сотовой лактата и пирувата в испытательных образцов с помощью колориметрических пробирного kit (данные приведены в таблице 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Колориметрические пигментации шаблоны лактат стандартов с помощью колориметрических пробирного kit. (A) скважин 96-луночных пластины, используемые в колориметрические пробирного и разбавления серии L (+)-лактат стандарт. Повышение концентрации лактата привели к более интенсивным розовым цветом. BG указывает на фоне лактат зонд против серии разрежения. (B) лактат калибровочной кривой для колориметрических assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Колориметрические пигментации шаблоны пируват стандартов с помощью колориметрических пробирного kit. (A) скважин 96-луночных пластины с использованием колориметрического анализа и разбавления серии пируват стандарта. Увеличение концентрации пируват привели к увеличению света розовой окраски. (B) пируват калибровочной кривой для колориметрических assay. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Тестирование образцов Лактат (мм) Пируват (мм)
Химически осажденный белки образцов во время гомогенизации 3.07 ± 0,94 0.22 ± 0,08
Химически осажденный белки образцов после гомогенизации ND ND
Нетронутыми цитозольной фракции после гомогенизации и ultracentrifugation 1.12 0,06

Таблица 1. Эффекты осадков белок на различные сроки для обнаружения клеточных лактата и пирувата в 5-дневных животных одичал тип N2. Данные указывают на средства + стандартное отклонение (SD) по меньшей мере три решения. ND указывает не обнаружено. * Процесс извлечения была выполнена, предварительно с помощью ultracentrifugation без осадков белок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать тефлон гомогенизатор, как другие гомогенизаторы (например., Dounce и конические ткани кофемолки, или бисерные мельницы) также подходят для мелкомасштабной добычи червей. Мы не обнаружить сотовой лактата и пирувата в испытательных образцов, которые были извлечены с использованием гомогенизатора перед осадков белок. Кроме того уровень лактата и пирувата резко сократился в цитозольной фракции разделяются с помощью ultracentrifugation вместо осадков белок (Таблица 1). Эти показывают, что пример извлечения имеет решающее значение для выявления сотовых метаболитов в биохимических методологии с использованием нематоду C. elegans. Для осадков белок не только ГТС, но также несколько других выделений (PCA или metaphosphoric кислоты) может использоваться для биохимических методологии7,9. По данным предыдущего доклада использование ТСА привело к исчезновению приблизительно 12% НАДН в ферментативных измерения крови лактата и пирувата. Таким образом авторы пришли к выводу, что metaphosphoric кислота 5% должен быть выбран как белка осадителя лактата и пирувата при использовании ферментных assays9. Это предполагает, что ТКА частично денатурирует протеины, включая многих ферментов. Однако мы не было проблем относительно осадок белка при использовании колориметрические анализов для выявления клеточных лактата и пирувата.

В этом исследовании мы использовали коммерческие колориметрического анализа комплекты для количественного определения лактата и пирувата (рис. 2 ирис. 3 ). Их чувства и размеры выборки были выше по сравнению с предыдущей пробирного наборы7; Таким образом мы подготовили образцы с использованием меньшего масштаба добычи и сообщил различия в клеточных концентрации лактата и пирувата в C. elegans3. Мы обнаружен возрастным снижением лактат и последующего коэффициент L/P в одичал тип C. elegans и обнаружил, что p53/CEP-1 имеет важную роль в возрастные изменения метаболизма энергии через активацию транскрипционный анализ целей 2 , 3. Таким образом, анализ энергетического метаболизма в нематоду C. elegans выгодно доходов за счет использования улучшение колориметрического анализа комплектов, по крайней мере в части.

Как показано на рисунке 3B, концентрация лактата ниже 2 мм, как правило, быть действительно больше в этом колориметрические assay (не флуориметрический проба). Таким образом флуориметрический assay может быть подходящим для более точного измерения лактата. Возможности этих комплектов пробирного поддерживают колориметрических и флуориметрический анализов, так что в ответ на прибор в лаборатории пользователя выбран assay. Это еще более дорого использовать настоящий коммерческих колориметрические пробирного наборы для количественно определить концентрацию сотовых метаболитов. Однако испытания могут выполняться надлежащим образом в небольших лабораториях с использованием общих инструментов и спектрофотометрические пластины читателя.

До сих пор есть относительно небольшое число отчетов с помощью обычных биохимических подходов в модельный организм C. elegans, которые обычно нужны крупномасштабные культуры червей, по сравнению с5генетические исследования. Однако недавние замечательный прогресс анализа биологических систем (например., повышение чувствительности и стабильности пробирного комплектов) делает исследования с использованием нематоду C. elegans, который является небольшой и состоит из менее чем 1000 ячеек, более привлекательные и легко в лаборатории. Отныне эффективное Метаболомные анализ с помощью масс-спектрометрия (МС) и газовая хроматография/масс-спектрометрии (ГХ/МС) может помочь уменьшить некоторые проблемы, например крупномасштабные культуры, Аналитическая чувствительность и специфичность и поможет прояснить роль клеточного метаболизма в старения и человеческих заболеваний, включая рак10. Заглядывая вперед, легче методологии, например наборы колориметрического анализа, будет эффективным как инструмент скрининга до более точных инструментальных анализов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была финансово поддержана специальный исследовательский грант от Дайто Бунка университета для Сумино Янасэ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit  BioVision #K607-100 colorimetric/fluorimetric
100 assays; Store at -20oC
EnzyChrom Pyruvate
Assay Kit		 BioAssay
Systems		 #EPYR-100 colorimetric/ fluorometric
100 assays; Store at -20oC
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225 colorimetric assay; store at
 room temperature
Trichloroacetic Acid Wako Pure Chemical #207-04955 store at room temperature
Teflon homogenizer  Iwaki/Pyrex #358034 (Wheaton) Instead of Iwaki/Pyrex,
available by Wheaton

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  2. Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
  3. Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
  4. Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. WormBook. , (2007).
  5. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
  6. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).
  7. Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
  8. Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
  9. Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
  10. Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).

Tags

Биохимия выпуск 140 Caenorhabditis elegans энергии метаболизма лактат пируват общих осадителя колориметрические пробирного
Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N.… More

Yanase, S., Yasuda, K., Ishii, N. Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (140), e57807, doi:10.3791/57807 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter