Summary

ホスホロチオエートを使用して RNA の結合蛋白質の新規飽和突然変異誘発方法: シングル ステップの特性

Published: August 21, 2018
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Summary

特定の RNA シーケンスを結合するタンパク質は、遺伝子発現の重要な役割を果たします。これらの結合部位の詳細な特性解析は遺伝子の規則の私達の理解にとって重要です。ここでは、RNA タンパク質結合部位の飽和突然変異導入のシングル ステップ アプローチを説明しています。このアプローチは、RNA のすべての蛋白質の結合サイトに関するものです。

Abstract

遺伝子の規則は開発の重要な役割を果たしています。多数の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の発現を制御する高い特異性とそのターゲット シーケンスをバインドします。これらの調節タンパク質 (転写) DNA のレベルでまたは RNA (mRNA スプライシング、起こる、mRNA の輸送、腐食および翻訳) のレベルでの遺伝子発現を制御します。制御配列の同定は、オンまたはオフの遺伝子への切り替えだけでなく、また下流遺伝子の特定規制蛋白質によって規制されているを理解するのに役立ちます。ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

Introduction

遺伝子は、生物学で重要な役割を果たしています。遺伝子の転写、mRNA のスプライシング、3′ 端形成、RNA 輸出、翻訳、mRNA の局在、崩壊、翻訳後修飾/安定性など両方の DNA と RNA 結合タンパク質は、遺伝子の重要な役割を再生レベルに調整できます。規制。一方、分子遺伝学的解析では、規制を多くの蛋白質を識別した、それらのごく一部のみが細胞機能の結合サイトの生体内完全に特徴づけられています。系統解析と突然変異は、DNA または RNA 蛋白質の相互作用を特徴付けるに補足のアプローチを提供しています。

RNA 結合蛋白質性分を含む発達のプロセスで重要です。セックス致死 (SXL)ショウジョウバエ蛋白質またはマスター セックス スイッチ蛋白質が存在しない、男性が女性にプレゼント。ウリジン豊富なシーケンスまたは体細胞1,2 の下流 mRNA ターゲット (トランスセックス致死男性固有の lethal2) で特定のスプライス部位に隣接するピリミジンの広大を認識します。 ,3,4。さらに、それは起こるサイトの初歩的な増強物(e(r)) 謄本5,6にウリジン リッチ起こるエンハンサー シーケンスに結合して切り替えを調整します。SXL 可能性が調節することを残る女性の生殖で追加のターゲット識別1,7,8,9,1011,12,13

通常、結合部位の特性変異原性, たとえば、削除や単一または複数のヌクレオチドの置換します。野生型 RNA 配列を基準にして各変異体の結合サイトが分析され、その結合親和性を決定するタンパク質濃度の一連を使用して (Kdまたは平衡解離定数); 興味の蛋白質のKdは 50 %rna 結合を取得するために必要な蛋白です。詳細な突然変異のこの労働集約的なプロセスを含む多数の突然変異体の生成・解析-3 つの野生型ヌクレオチド結合部位の各位置のため。従って、RNA に蛋白質の結合サイトの高速、簡単、安価な飽和突然変異導入の代替アプローチの必要性があります。

ここでは、RNA でタンパク質結合部位の飽和突然変異導入を可能にするワンステップ アプローチについて述べる。次の潜伏蛋白連結分数の各ホスホロチオエート ヌクレオチドと独立した Rna の合成と分離結合サイト内で非野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピングが含まれます。非野生型ヌクレオチドからの干渉は、蛋白結合率の特恵除外の結果します。これはホスホロチオエート (ホスホロチオエート変異または PTM) を含むリン酸ジエステル結合のヨウ素の化学選択的な胸の谷間、次ゲル電気泳動によって監視されます。このシングル ステップ飽和突然変異誘発方法は、RNA、タンパク質結合部位の評価に適用されます。

Protocol

注:図 1ホスホロチオエート変異の概要し、プロセスの主な手順の概要を示します。 1. 突然変異体のライブラリの生成 — 野生型ヌクレオチドと DNA テンプレートをドーピング T7 プライマーを合成 (5′-GTAATACGACTCACTATAG-3′) DNA のシンセサイザーに化学合成によって。 タンパク質の結合部位に対応する DNA シンセサイザーに化学合成によるド?…

Representative Results

ドーピングを使用して飽和突然変異導入の原理: 野生型および他のヌクレオチドの適切なモル比、1 つの位置だけの分析対象とする場合、すべての 4 つのヌクレオチドの等量混合物を使用します。ただし、同時に複数のポジションを分析、野生型のヌクレオチドに非野生型の比率が調整必要があります、すなわち、減?…

Discussion

変異は蛋白質の結合サイトを特徴付けるため長い間使用されています。まず、一連の変異型を構築し、結合の結合親和性に及ぼす影響を分析するアッセイで個別にテストできます。複数のステップ変異体を構築する一連の各変異体の反応をバインディングの実行など、標準的なアプローチに関連するかどうかは面倒で時間がかかるかどうか、およびことができない標準的な突然変異手法では?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は過去の資金調達のための健康の国民の協会のおかげで、マイケル ・ r. グリーンのオリゴヌクレオチドを合成をありがちましょう。

Materials

Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

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Cite This Article
Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

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