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Biochemistry

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

doi: 10.3791/57832 Published: August 2, 2018

Summary

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

Abstract

인간 게놈 4 bestrophin paralogs를, 즉 BEST1, BEST2, BEST3, 및 BEST4 인코딩합니다. BEST1, BEST1 유전자에 의해 부호화는 캘리포니아2 +-Cl- 채널 (CaCC) 주로 망막 안료 상피 (RPE) 표시를 활성화. BEST1의 생리 및 병 적인 의미 BEST1 유전자에서 200 개 이상의 독특한 돌연변이 최고의 vitelliform 등 적어도 5 망막 퇴행 성 장애의 스펙트럼에 유전자 연결 되었다는 사실에 의해 강조 표시 됩니다. 황 반 영양 장애 (최고의 질병) 따라서, bestrophin 채널을 단일 분자 수준에서의 물리학을 이해 엄청난 의미를 보유 하고있다. 그러나, 순화 된 포유류 이온 채널을 얻는 것은 종종 어려운 작업입니다. 여기, 우리는 BacMam 잠재 유전자 전달 시스템 및 친 화력과 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 정화와 포유류 bestrophin 단백질의 표현에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 순화 된 단백질 지질 bilayers에 결정학 electrophysiological 녹음 등 후속 기능 및 구조 분석에 활용 될 가능성이 있다. 중요 한 것은,이 파이프라인 함수 및 다른 이온 채널의 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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Bestrophins은 박테리아에서 인 간에1다양 한 종족을 통해 보존 하는 이온 채널의 가족 이다. 인간에서는, BEST1 유전자, 염색체 11q12.3에 있는 막 단백질 Bestrophin-1 (BEST1) 주로 눈2,3 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 basolateral 막에 표현 되 인코딩 ,4. 585 아미노산의 첫 번째 ~ 350 높은 종 중 보존 하 고는 막 횡단 영역을 포함, 구성 BEST1 인간1,,56CaCC 역할을 합니다. 또한, 닭에 BEST1 homologs와 Klebsiella 균 으로 작동 homopentamers7,8, 진화를 통해 환경 보호의 높은 수준을 제안.

인간에서는, 200 개 이상의 돌연변이 BEST1 유전자에서 임상 bestrophinopathies1,9라는 망막 변성 질환의 그룹에 연결 되었습니다. 5 특정 bestrophinopathies 보고 되었습니다, 등 최고의 질병, 성인-발병 vitelliform 영양 장애, 상 염색체 지배적인 vitreoretinochoroidopathy, 상 염색체 열성 bestrophinopathy, 망막 화3,4 ,,1011,12,,1314. 이러한 질병 감소 시력 및 심지어 실명으로 이어질 현재 치료할 수 없습니다. 치료 트리 트 먼 트 및 잠재적으로 맞춤된 의학을 개발 하기 위하여 어떻게 이러한 BEST1 질병 유발 돌연변이 영향 BEST1 채널15의 구조와 기능 이해에 중대 하다. 이러한 목적을 위해 연구원 순화 bestrophin (와일드 타입이 돌연변이) 채널 시험관에서 분석5,8실시를 해야 합니다.

첫 번째 주요 단계는 포유류 세포에 높은 종에서 bestrophin 채널의 표현 이다. F HEK293 세포 (BacMam 시스템)의 잠재 변환 heterologously 막 단백질16,17를 표현 하는 강력한 방법으로,이 프로토콜의 강력한 표현에는 최적화 된 BacMam 벡터 (pEG BacMam)을 활용 하 여는 이 경우에 포유류 bestrophin 체 단백질18, 대상. 이 벡터는 G-단백질 결합 수용 체, 핵 수용 체, 그리고 다른 이온 채널18를 포함 하 여 다양 한 막 단백질의 표정을 위해 사용 되었습니다. 또한 생산된 단백질 결정학18적합 증거가 있다. HEK293 F 세포에서 식의 높은 수준, 단백질 수 다음 정화 크로마토그래피;를 사용 하 여 특히, bestrophins, 경우 선호도 크기 배제 크로마토그래피 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 bestrophin 채널에 대 한 미세 조정, 일단 순화 된 단백질의 기능 및 평면 지질 bilayer와 엑스레이 결정학, 각각5,8통해 구조에 대 한 다음 분석할 수 있습니다. 이러한 기술을 bestrophins 및 다른 이온 채널의 기능 및 구조 조사에 대 한 강력한 파이프라인을 제공합니다.

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Protocol

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1. 생산 BacMam 식 Baculoviruses

  1. BacMam 벡터 GFP 10 다음 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 인식 순서18 못에 원하는 포유류 bestrophin 단백질의 코딩 시퀀스를 삽입 그의 태그는 단백질의 C-말단에 x.
  2. 접착제 HEK293 세포19,20,21,,2223에 식 플라스 미드를 transfect 정도. 10 배 또는 20 배 확대, 488 nm 여기 소스와 510 nm 방출 필터 (그림 1A) 형광 현미경 GFP 융해 단백질의 식을 확인 합니다.
    참고: 고분자에 기초를 둔 transfection HEK293 세포의 35 m m 음식에 대 한 플라스 미드 DNA의 1 μ g 정기적으로 수행 됩니다.
  3. 앞에서 설명한16,17Sf9 곤충 세포에서 baculoviruses를 생성 합니다.
    참고: 통로 3 (P3) 바이러스, 단백질 생산을 위한 F HEK293 세포를 감염 하는 데 사용 됩니다, 4 ° C에서 1 달 동안 저장할 수 있습니다.
  4. 플 라크 형성 분석 결과16,17여 P3 바이러스 titer (전염 성 단위)를 결정 합니다.
    참고: 관심사의 단백질 GFP와 태그는로 감염 단위를 확인 하기 위한 빠른 방법 바이러스의 직렬 희석 Sf9 세포를 감염 하 고 48 h 후 형광 세포의 수를 계산 하는.

2. 단백질 표정

  1. 8% CO2와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 HEK293 F 식 매체와 현 탁 액 문화에서 HEK293 F 세포를 유지 합니다. 일회용 문화 플라스 크를 2-2.5 시간 더 큰 문화 볼륨 보다 135 rpm에서 궤도 플랫폼에 문화를 회전을 사용 합니다.
    참고: 구절 5와 30 사이 때 세포를 감염 하 고 셀 문화 후드 아래이 작업을 수행할 수 것이 좋습니다.
  2. 바이러스 성 감염, 전에 24 시간 세포 배양의 15 μ 약 수에 Trypan 블루의 15 μ를 추가 하 고 셀 밀도 및 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 생존 확인. 각 매체의 500 mL와 함께 미리 37 ° c.에 따뜻하게 하는 2 x 2 L 플라스 크에 106 셀/mL x 0.6 셀 희석
    참고: 죽은 세포는 얼룩이 블루 여 Trypan 블루. 원하는 세포 생존 능력은 > 95%.
  3. 감염의 날, 셀 밀도 생존 (2.2 단계)를 확인 합니다.
    참고:의 높은 세포 생존 능력 > 95%는 효율적인 감염 및 단백질 식을 위해 필수적 이다. 예상된 셀 밀도 ~1.0 x 106 셀/mL (성장된 하룻밤 106 셀/mL 세포 배양 x 0.6의 2 x 500 mL에서). 셀의 예상된 총 수는 ~1.0 x 109.
  4. P3 baculoviruses 5의 감염 (MOI)의 다양성에 있는 셀에 추가 합니다. 바이러스 예방의 금액을 확인 하려면 다음 식을 사용 하 여:
    Equation
  5. 24 h에 대 한 8% CO2 습도 37 ° C 배양 기에서 135 rpm에서 궤도 플랫폼에서 세포를 흔들어.
  6. 10mm 나트륨 낙 산 염의 세포 배양에 추가 하 고 48 h에 대 한 배양을 계속.
    참고: 일부 단백질에 대 한 감소 셀 문화 온도 30 ° C를 후 식 및 안정성 나트륨 낙 산 염 또한 향상 시킬 수 있습니다.
  7. 10 배 또는 20 배 확대, 488 nm 여기 소스 및 510 nm 방출 필터 형광 현미경, 백분율 및 직접 단백질 (bestrophin-GFP-10xHis) 수익률 (그림 1B)를 대표 하는 녹색 셀의 밝기를 확인 합니다.
    참고: 녹색 세포의 비율에 의해 계산 됩니다: (녹색 셀/총 셀) x 100. 좋은 단백질 표정 수준 강한 녹색 형광 현미경으로 표시 됩니다.
  8. 20 분 제거는 상쾌한 4 ° C에서 1000 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확 하 고 다시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) ~ 80 mL의 최종 볼륨을 가진 셀 펠 릿을 일시 중단. 분할 2 x 50 mL 원뿔 튜브 및 20 분에 4 ° C에서 1000 x g에서 원심 분리기에 세포 현 탁 액 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장

3. 단백질 정화

  1. 그렇게 그들은 녹여 10-15 분 동안 실 온에서 교 반 물 욕조에 셀 펠 릿을 포함 하는 원뿔 튜브를 품 어. 다시 0.1-1.0에 가수분해 억제제 (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin와 phenylmethylsulfonyl 불)와 보완의 버퍼는 (표 1) (예를 들어, 버퍼의 20 mL 펠 릿 셀의 10 g) (w/v) 볼륨 x 2에 셀 중단 m m. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 동종 세포 현 탁 액을 얻기 위해 광범위 하 게.
  2. 고압 균질 화기를 사용 하 여 셀 lyse 셀 서 스 펜 션의 총에 대 한 7-10 MPa에서 균질 화기를 통해 실행 3-4 회 완전 한 균질 화를 달성 하기 위해. 얼음 2-3 분 라운드 사이 세포 lysate 유지.
  3. 세포 lysate를 세제 [예를 들어, 2 %w / v 솔 급 n-라우릴-β-D-Maltopyranoside (DDM)]를 추가 합니다. 막 단백질을 추출 하 20 ° C에서 1 시간에 대 한 동요와 함께 품 어.
    참고: 세제의 종류는 각 단백질 대상18,24에 대 한 최적화가 필요 합니다.
  4. 1 시간에 4 ° C에서 ultracentrifuge에 150000 x g에서 원심.
    참고: 다음 단계를 모두 4 ° c.에 수행 됩니다.
  5. 5 mL의 트랩 Ni2 +-NTA 선호도 열 통해 미리 버퍼 (표 1) equilibrated 흐름과 명확한 세포 lysate를 수집 합니다.
    참고: 원심, 후 명확한 세포 lysate 것입니다 수에 끼워 넣으면 하단에 펠 릿 및 위에 흐린 층 사이. 10 mL 전송 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 명확한 lysate를 수집 하 고 다음 지난 1 mL 피펫으로 전환할 lysate의 몇 밀리 리터. Ni2 + 열;을 방해할 수 있는 펠 릿을 방지 그러나, 최상위 계층의 작은 금액을 괜 찮 아 요 또는 1.5 μ m 필터 밖으로 필터링 할 수 있습니다.
  6. 세척 후에 버퍼 C의 40 mL는 버퍼 B의 25 mL로 열 (테이블 2 3, 각각).
    참고:이 휴식을 취하는, 총 정화 12 h까지 걸릴 수 있습니다 그리고 단백질 하룻밤 열에 연결 하는 동안 안정적으로 유지 수 있는 좋은 장소입니다.
  7. 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 열을 연결 하 고 단백질의 버퍼 D 13 mL와 열에서 (표 3) 분류와 함께 elute. UV 흡수도 판독에 따르면 단백질 농축 분수를 수집 합니다.
    참고:: 는 FPLC 조건은 다음과 같습니다: 1.0 mL 분수 크기, 0.3 MPa, 그리고 0.5 mL/min의 유량을 설정 사전 열 압력 경보.
  8. Microvolume 분 광 광도 계에 eluted 단백질 제품 농도 측정 합니다. 280에서 흡 광도 읽고 nm.
  9. (선택 사항) GFP 10xHis 태그를 제거 하려면 대량 비율 1:1 TEV 프로 테아 제를 추가 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어.
    참고: 태그 되거나 함수 또는 순화 된 채널의 구조에는 영향을 미치지 수 있습니다. 볼륨 및 3.7-3.8 단계에서 수집 된 단백질의 농도에서 TEV 금액을 계산 합니다. 예를 들어, 경우 차입 제품의 10 mL를 수집 하 고 총 단백질 0.1 mg/mL에서 측정 된 질량은 10 x 0.1 = 1 밀리 그램, 그리고 1 mg TEV의 소화에 대 한 사용 됩니다.
  10. (50 또는 100 kDa) 15 mL를 원심으로 단백질을 집중 (FPLC에 2 mL 샘플 로드 루프)에 대 한 400-500 μ의 최종 볼륨을 4 ° C에서 4000 x g에서 회전에 의해 필터 단위.
    참고: 농도 centrifuging 시간 집중력과 단백질의 크기에 따라 다릅니다. -집중을 방지 하는 수 있습니다 단백질 강 수, 처음에 10 분 동안 회전 다음 나머지 볼륨을 관찰 원인과 예상 후속 스핀에 대 한 시간 (예: 2-5 분), 최종 볼륨을 얻을. 피펫으로 필터의 아래쪽을 뽑아 단백질 분산 회전 사이.
  11. 새로운 1.5 mL 튜브 집중된 제품에서 어떤 침전 또는 거품 제거 집중된 단백질을 전송 합니다. 에 스핀 > 12000 x g 4 ° C와 수집 새로운 1.5 mL 튜브에 상쾌한에 5-10 분.
  12. 크기-배제 열 버퍼 E (표 5)와 함께 미리 equilibrated 1 mL 주사기와 라운드 팁 바늘 FPLC 시스템에 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 최종 제품을 로드 합니다.
    참고:: 는 FPLC 조건은 다음과 같습니다: 0.5 mL 분수 크기, 2.50 mpa 설정 사전 열 압력 경보, 버퍼 E의 30 mL로 설정 흐름 볼륨 (표 5), 0.5 mL/min 흐름 속도 설정.
  13. Note 품행 단백질 (그림 2A) 단일 피크로 실행 하 고 수집 단백질 fraction(s)에 해당 하는 피크 (그림 2A).
  14. 4 mL 또는 0.5 mL 원심 필터 단위 (3.10 단계 에서처럼 동일한 분자량 컷오프)와 스핀에서 5-10 μ g/μ의 최종 농도에 4 ° C에서 4000 x g 단백질을 집중 한다. 분 광 광도 계를 사용 하 여 최종 제품 농도 (3.8 단계)을 확인 하.
    참고: 원심 분리 시간이 다릅니다, 최종 제품 볼륨 정화 실험 사이 다 수 있습니다. 일반적으로, 원심 분리는 10-20 분 걸립니다. 피펫으로 필터의 아래쪽을 뽑아 단백질 분산 회전 사이 하는 것이 좋습니다.
  15. 새로운 1.5 mL 튜브에 집중된 단백질을 전송. centrifuging 여 어떤 침전 제거 > 12000 x g 4 ° c.에 5-10 분 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송. -80 ° C에서 10 μ aliquots 스토리지를 만들고 저장 한 2-5 μ 작은 약 수 9 V/cm (그림 2B)에 4-15% 그라데이션 SDS 페이지 젤에서 실행.
  16. 질량 분석8여 순화 된 단백질의 id를 확인 합니다.
    참고: 함수 분석 생체 외에서 그리고 순화 된 단백질의 구조는 평면 지질 bilayer와 엑스레이 결정학, 각각5,8통해 수행할 수 있습니다.

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Representative Results

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뚜렷이 페 접착제 HEK293 세포 (그림 1A)의 형광 강도 서 스 펜 션 F HEK293 세포 (그림 1B)에 예상된 단백질 표정 수준에 대 한 좋은 지표입니다. 대상 단백질은 잘 표현 또는 과도 transfection 후 HEK293 세포에서 잘못 지역화, 것이 좋습니다 고려 식 구조를 수정 하는 (., GFP 태그의 위치를 변경 또는 돌연변이/잘림 에 대상 단백질). 작은 HEK293 F 현 탁 액 문화 (예를 들어, 25 mL 문화)는 단백질 표정, 중 감염 나 배양 온도 되었습니다 이전 경험에서 가장 중요 한 조건을 최적화 하는 데 사용 됩니다.

성공적인 정화 단일 주요 피크 크기 배제 크로마토그래피 (그림 2A)와 변성된 SDS 페이지 젤 (그림 2B)에 단일 지배적인 밴드 예상된 차입 볼륨에 표시 됩니다. 여러 봉우리 크기 배제 크로마토그래피에 나타납니다, 그것은 각 피크를 수집 하 고 있는 피크 포함 기능 채널 pentamers 결정 하기 위한 기본 젤을 실행 하는 것이 중요. 그것은 그 두 개의 단백질 구조 사이 식 수준으로 표시 되는 수확의 때에 형광 강도, 여 않습니다 하지 nesessarily 연관 최종 수확량 정화 중 다르게 동작 하는 각 단백질 구조 주목 한다. 품행 bestrophin 단백질에 대 한 최종 정제 제품의 200-500 µ g HEK293 F 현 탁 액 셀의 1 L에서 일반적으로 얻을 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 포유류 bestrophin 단백질의 표정. GFP 태그 포유류 bestrophin의 미세한 이미지 표현 (A) 접착제 HEK293 세포에서 플라스 미드 transfection, 및 (B)에 HEK293F 셀 잠재 감염. 왼쪽 녹색 형광; = 오른쪽 = 밝은 필드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 포유류 bestrophin 단백질의 정화. (GFP 태그 단백질 A) 선호도 정화 크기 제외 젤 여과 열 하나의 주요 피크로 도망. 파선 사이의 분수 수집 했다. (B) 최종 단백질 제품 사다리 (왼쪽된 열)를 가진 SDS-PAGE 젤에 달렸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

시 약 MW 1 L 당 금액 최종
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
글리세롤 92.09 50 mL 5% (v/v)
이미 68.1 1.3616 g 20 mM
MgCl2 203 0.20331 g 1mm
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 2.5 mL 200 m m 재고 0.5 m m

표 1: 단백질 정화 버퍼 (물의 Resuspension 버퍼)

시 약 MW 1 L 당 금액 최종
HEPES 238.3 11.9 g 50 mM
NaCl 58.44 17.529 g 300 mM
글리세롤 92.09 50 mL 5% (v/v)
이미 68.1 2.7232 g 40 m m
MgCl2 203 1.01655 g 5 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0.5 mL 200 m m 재고 0.1 m m
DDM (anagrade) 510.6 0.5 g 0.05% (w/v)

표 2: 단백질 정화 버퍼 B (먼저 씻어 버퍼)

시 약 MW 1 L 당 금액 최종
HEPES 238.3 5.95 g 25 m m
NaCl 58.44 29.2 g 500 mM
글리세롤 92.09 50 mL 5% (v/v)
이미 68.1 5.1 g 75 m m
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0.5 mL 200 m m 재고 0.1 m m
DDM (anagrade) 510.6 0.5 g 0.05% (w/v)

표 3: 단백질 정화 버퍼 C (두 번째 버퍼 세척)

시 약 MW 1 L 당 금액 최종
HEPES 238.3 7.74 g 32.5 m m
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
글리세롤 92.09 25 mL 2.5% (v/v)
이미 68.1 17.02 g 250 m m
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0.5 mL 200 m m 재고 0.1 m m
DDM (anagrade) 510.6 0.5 g 0.05% (w/v)

표 4: 단백질 정화 버퍼 D (차입 버퍼)

시 약 MW 1 L 당 금액 최종
HEPES 238.3 9.53 g 40 m m
NaCl 58.44 11.686 g 200 mM
tris(2-carboxyethyl) phosphine 287 0.5 mL 200 m m 재고 0.1 m m
DDM (anagrade) 510.6 0.5 g 0.05% (w/v)

표 5: 단백질 정화 버퍼 E (젤 여과 버퍼)

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Discussion

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이 프로토콜 표현과 미래 생체 외에서 분석에 사용할 포유류 bestrophin 이온 채널의 정화에 대 한 유용한 파이프라인을 설명 합니다. FPLC 장치는 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 필요, 주사기 펌프는 친화성 크로마토그래피 바인딩 하 고, 세척, 하 고, 방출 하는 등의 모든 단계에 대 한 충분 한 이다. 푸시 솔루션 (주사기)에 열을 통해 주사기 펌프를 사용할 때는 열에 공기 방울을 밀어 피하기 위해 봄 측면 아래에 배치 필수적 이다. 친화성 크로마토그래피 후 단백질의 순도, 후속 실험에 대 한 충분 한 이미 경우 FPLC 장치 되지 않을 수 있습니다 필요한 모든 있도록 크기 배제 크로마토그래피를 생략할 수 있습니다.

PBacMam 플라스 미드에서 baculoviruses를 만들기 위해 약 2 주 걸립니다, 효율을 품행 단백질 homologs에 대 한 초기 화면 실시 될 수 있습니다 정도 transfected HEK293 세포를 수확 하 여 (., 60 mm 접시에서)와 테스트는 어떻게 표현 관심사의 단백질 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 (FSEC)18,24세제 (예를 들어, DDM) 동작 (GFP 태그). 그것은 가장 생산적인 transfected HEK293 세포 및 좋은 monodispersity FSEC 안정성에서 강한 형광을 표시 하는 단백질 구조에 초점.

단백질 정화의 수율을 높이기 위한 몇 가지 권장 사항을 확인 하 고 있습니다. 첫째, TEV 소화 조건 각 단백질에 대 한 최적화 될 필요가 있습니다. 이것은 단백질 TEV 대량 비율 (예:, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1시 10분)의 범위를 테스트 하 고 (예를 들어, 0.5 h, 1 시간, 2 h, h, 그리고 하룻밤 5) 시간 잠복기에 의해 행 해질 수 있다. 다음, 그것은 SDS 페이지에서 처리 샘플 젤 분열 효율성을 확인 하기 위해서 좋습니다. 또한, FPLC 또는 주사기에 연결에서 어떤 원심 상쾌한 또는 eluent 누출을 하도록 하지 중요 하다. 마찬가지로, 그것은 집중된 단백질 pipetting 때 거품을 피하기 위해 해야 합니다.

다양 한 후속 시험관에서 분석 절차가이 프로토콜에서 단백질을 활용 하는 등 지질 bilayer, 엑스레이 결정학, cryo 전자 현미경 검사 법, 분광학, 및 높은 처리량 검열8,25 , 26.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88, (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97, (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease). Human Molecular Genetics. 7, (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19, (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278, (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516, (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346, (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104, (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82, (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85, (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8, (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23, (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93, (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9, (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111, (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7, (5), e37079 (2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3, (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588, (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173, (9), 2307-2322 (2017).
표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화
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Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).More

Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

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