Summary
Här presenterar vi protokoll för att upptäcka föreningar aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi.
Abstract
Detta manuskript presenterar ett stegvisa protokoll för screening föreningar på gamma-aminobutyric syra typ en (GABAA) receptorer och dess användning mot identifiering av nya molekyler verksamma i prekliniska analyser från en in vitro- rekombinant Remote-receptorn till deras farmakologiska effekter på infödda receptorer i gnagare hjärnan skivor. För föreningar bindande på webbplatsens bensodiazepin i receptorn, är det första steget att inrätta en primär skärm som består av framkallning radioligand bindande analyser på cellmembran som uttrycker de stora GABAA -undertyperna. Sedan, dra nytta av ett heterologt uttryck för gnagare och mänskliga GABAA -receptorer i Xenopus oocyter eller HEK 293 celler, är det möjligt att utforska, elektrofysiologiska analyser, fysiologiska egenskaper av olika receptorn subtyper och de farmakologiska egenskaperna hos de identifiera föreningarna. I Xenopus äggcellen systemet kommer att presenteras här, börjar med isolering av oocyterna och deras Mikroskop med olika mRNA, upp till farmakologiska karakterisering med två-elektrod spänning klämmor. Slutligen, inspelningar genomfördes i gnagare hjärnan skivor kommer att beskrivas som används som ett sekundärt fysiologiska test för att bedöma aktiviteten av molekyler på deras infödda receptorer i en väldefinierad neuronala krets. Extracellulära inspelningar med befolkningen Svaren av flera nervceller demonstreras tillsammans med ansökan om drogen.
Introduction
Här presenterar vi protokoll för upptäckten av föreningar som är aktiva på GABAA -receptorer, från bindningen till fysiologi och farmakologi. I sökandet efter nya molekyler specifika för GABAA -receptorer, är det avgörande att definiera, så exakt som möjligt, subtyp av intresse och bedömningen av den särskilda karaktären hos de nyligen identifierade föreningarna (t.ex., för en genomgång, se Rudolph och Knoflach1eller Sieghart2). En typisk sökväg i läkemedelsutveckling och de steg som behöver uppnås illustreras i figur 1.
Bindande analyser har varit och är fortfarande till stor del används som ett första steg i läkemedelsutveckling. När det gäller GABAA -receptorer, är de optimerade för att identifiera substanser som binder till bindningsstället bensodiazepin av receptorn där terapeutiskt användbar och säkra läkemedel binder. Andra tekniker, använda fluorometric imaging plate reader (FLIPR) membran potentiella röda färgämnet-baserade analyser3, identifiera föreningar som barbiturater som binder till ytterligare platser som är mindre önskvärt på grund av deras oönskade bieffekt profil. De utnyttja färgämnena kan dessutom direkt aktivera GABAA -receptorer, således ifrågasätta nyttan av dessa analyser för drug discovery4. Bindande analyser kan endast ge bevis för att en viss förening kan binda till en specifik receptor klass. In vitro- analyser med cellmembran används för att identifiera selektiv mänsklig GABAA α5β3γ2-receptorligander. Övergående transfekterade HEK293 celler som uttrycker de mänskliga GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 och α3β3γ2 receptorer används för att förbereda membran för dessa analyser. Effekten av liganderna identifieras genom att mäta scintillation av [3H] flumazenil bunden till membranreceptorer (en hämning av [3H] flumazenil bindande). Den största fördelen med denna teknik är att en snabb och effektiv bestämning av det förening-affinitet på receptorn av intresse tillhandahålls på receptorn av intresse.
Funktionella studier är viktigt att utvärdera den funktionella aktiviteten av föreningar och föreslå en fysiologiska och farmakologiska förklaring av de mekanismer som orsakas av bindningen av föreningarna till receptorerna. Idag är det välkänt att funktionell GABAA -receptorer leder från montering av fem subenheter runt en axel av pseudosymmetry bildas av Joniska pore och resultatet från montering av fem identiska subenheter. De flesta av GABAA receptorerna består av två eller flera olika subenheter. Den stora hjärnan GABAA -receptorn, exempelvis består av α1, β2 och γ2 subunitsna i en stökiometri av 2, 2 och 1 respektive5,6. En beredning i ett värdsystem som Xenopus oocyter eller HEK293 celler erbjuder möjligheten att snabbt utforska de farmakologiska egenskaperna hos receptorerna.
De farmakologiska egenskaperna hos föreningarna utforskas sedan med extracellulära inspelningar i hjärnan skivor7. Denna metod tillåter en utforskning av effekten av föreningar på neurotransmission och ger ett effektivt sätt att bekräfta de funktionella effekterna av de föreningar som bestäms i heterologa uttryck system på nivå av infödda receptorer i totalt neuronala miljö. GABAergic neurotransmission kan också bedömas på molekylär nivå genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs)8. Men protokollet används här och baserat på hela-cell patch clamp inspelningar i hjärnan skivor är mer genomarbetade och ger en lägre genomströmning.
Slutligen diskuteras styrkor och svagheter i vitro screening cascade används för identifiering av α5β3γ2-selektiv ligander i perspektivet av de olika teknikerna och deras inneboende begränsningar. Detta arbete bör ge och icke-experter på fältet av GABAA -receptorer som en trevlig recension av kombinationen av olika in vitro- metoder används för att ta itu med upptäckten av nya modulatorer av dessa ligandreglerade jonkanaler.
Protocol
Xenopus laevis är inrymt och hanteras enligt de riktlinjer som Genève Canton djur.
1. Radioligand bindande
-
Beredning av assay plattan
- Förbereda 1,5 L analysbuffert med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl och 15 mM Tris; Justera pH med HCl till 7,4.
- Förbereda föreningarna som skall provas vid 50.76 µM (t.ex., en 5 µL sammansatta på 10 mM i en 980 µL analysbuffert i en mikrocentrifug rör). Blanda dem väl med en vortex maskin i hög hastighet för 2 – 5 s.
- Förbereda en utspädning av den referens sammansatta flumazenil genom pipettering 1 µL av föreningen (10 mM) till 1,970 µL analysbuffert. Blanda dem väl med en vortex maskin i hög hastighet för 2 – 5 s.
- Späd en [3H] flumazenil stamlösning med Analysbuffert vid 4 ° C till 4 nM i en 50 mL polypropylen tub.
- Pipettera 50 µL per brunn av analysbuffert i kolumnerna 1 och 3 – 11 i en 96 brunnar mikroplattan som visas i layouten plattan representerade i figur 2.
- Pipettera 73,2 µL av de föreningar som utspätt till 50.76 µM (se steg 1.1.2) i kolumn 12 av plattan.
- Späd varje förening, använda en geometrisk progression över 9 steg (1E-10 – 1E–06 M), med en 23.12 µL överföring volym och fyll kolumner 3 – 11. Blanda utspädning. Byt spets efter varje utspädning.
-
Späd cellmembranen
- Tina de cellmembran som tidigare isolerade från en HEK293 overexpressing humana GABAA -receptorn (0,025 – 0,15 mg/mL) att erhålla 80 mL vid rumstemperatur (RT) och överföra suspensionen till analysbuffert vid 4 ° C.
- Återsuspendera membran lösningen fortfarande vid 4 ° C med en vävnad Homogenisatorer för 30 – 40 s vid 10.000 – 12.000 rpm.
-
Späd diazepam för icke-specifik bindning (NSB) kontroll
- Späd en 4 mM diazepam stamlösning med Analysbuffert till en koncentration av 40 µM i 5 mL.
-
Starta reaktionen
- Överför med pipett 50 μl av 4 nM [3H] flumazenil till varje brunn plattan med 96 brunnar och hålla den i en isvatten behållare.
- Tillsätt 100 µL av GABAA receptor subtyp membran preparatet har en proteinkoncentration av 0,5 mg/mL.
- Överför med pipett 50 μl av 40 µM diazepam till kolumn 2.
- Inkubera plattan för 1 h på is.
- Tillsätt 50 µL analysbuffert i varje brunn 96 brunnar filter platta för efterföljande membran separation och radioaktivitet mätning och stoppa reaktionen efteråt.
-
Stoppa reaktionen
- Förbereda en tvätt buffert med 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.
- Filtrera lösningen med en 96 brunnar cell skördare. Tvätta plattan 3 x med 300 µL av iskall tvätt buffert per brunn.
- Försegla botten av plattan med en plastfilm och tillsätt 40 µL av scintillation cocktail för liquid scintillation räknar i varje brunn och torka av den med etanol 70%.
- Skaka försiktigt plattan för minst 1 h på RT. Låt den stå i minst en timme vid RT.
- Mäta radioaktiviteten (i CPM) genom att placera plattan på ett scintillationsräknare. Kan en mäta för 3 min per brunn.
-
Analys av data
- Bestämma medelvärdet för 8 replikerar av icke-specifik (NSB) och den totala bindningen (TB) samt när det gäller de dubbletter eller exemplar av proverna. Beräkna den % specifika bindningen (SB) för medelvärdet av varje prov enligt följande ekvation:
Här
totala SB = den genomsnittliga TB minus det menar NSB. - Rita i abskissan % SB kontra i ordinate hämmare koncentrationerna. Passa data med hjälp av enda plats konkurrens analys ekvation:
Här
y = % av SB,
A = minsta möjliga y,
B = maximum av y,
C = IC50,
X = log10 av koncentrationen av konkurrerande föreningen,
D = lutningen på kurvan (en Hill koefficient). - Beräkna det affinitet (Ki) använder den halv maximal hämmande koncentrationen (IC50), dissociationskonstant (Kd) av [3H] flumazenil på respektive membran9och koncentrationen av [3H] Flumazenil i analysen enligt följande data-med ekvation:
- Bestämma medelvärdet för 8 replikerar av icke-specifik (NSB) och den totala bindningen (TB) samt när det gäller de dubbletter eller exemplar av proverna. Beräkna den % specifika bindningen (SB) för medelvärdet av varje prov enligt följande ekvation:
2.-receptoruttryck och inspelningar i Xenopus oocyter
- Äggstockarna skörd och äggcell förberedelse
- Förbereda den sterila Barth lösningen med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (nr3)2.4h2O och 0,41 mM CaCl2.6H2O, vid pH 7,4 , kompletterat med 100 enheter/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin och 0,25 µg/mL amfotericin B.
- Förbereda det 1 x OR2 mediet (ingen CaCl2) med 88,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, vid pH 7,4.
- Offra en Xenopus Laevis kvinnliga av djup anestesi i 20 min i kylda Tricaine methanesulfonate (med en koncentration av 150 mg/L, justeras vid pH 7,4) och natriumbikarbonat (300 mg/L) följt av halshuggning.
- Skörda äggstockarna snabbt med ren sax och pincett och placera dem i 2 Petri-rätter (10 cm) fylld med 40 mL 1 x Barth lösning och antibiotika/antimycotic.
- Lagra icke-differentierade äggstockarna för upp till 2 veckor i Barth lösning vid 4 ° C.
- För dissociationen, skär äggstockarna med en ren rakblad i små fraktioner (1 – 2 cm3) och inkubera dem i 50 mL OR2 medium utan CaCl2 (OR2-noCaCl2) som innehåller 0,2% kollagenas (typ I) vid 17 – 19 ° C i en 100 mL-spinnare kolv med en långsam agitation för 4 – 5 h. Kontrollera att magnetiska baren är placerad cirka 3 – 5 cm ovanför botten av spinner kolven att undvika krossning oocyterna.
- Efter 4 – 5 h, verifierar att de flesta av oocyterna är befriad från sin follikeln (dvs, de simmar runt individuellt). Tvätta dem 5 x med 200 mL OR2 kompletteras med 1,8 mM CaCl2.
- Överföra den defolliculated oocyter till Petri-rätter (10 cm) fylld med Barth lösning och antibiotika/antimykotika och hålla dem minst över natten vid 17 ° C före cDNA eller mRNA injektion.
- På den nästa dagen, Välj, under en kikare, en hälsosam äggcellen presentera en tydlig och distinkt djur kontra polack vegetal (mörkbrun för djur pole kontra ljusgul för vegetal stången). Använd rena Pasteur-pipetter och släng oocyterna en efter en i en steril koniska 96-injektion väl platta.
Obs: Ingen speciell vård behövs i placeringen av oocyterna för mRNA injektioner; för cDNA injektionerna är det oumbärligt att orientera oocyterna med djur stången uppåt.
- mRNA eller cDNA automatisk injektion
- Syntetisera de mRNA som använder en kommersiellt tillgänglig kit efter tillverkarens anvisningar. Rengör instrument och tabellen med RNase och bära lämpliga skyddande handskar.
Obs: Kvaliteten på mRNA är avgörande att ge ett bra uttryck, och det är nödvändigt att förhindra mRNA nedbrytning under förfarandet för injektion. - Förbereda cDNAs använder en kommersiellt tillgänglig kit och lös upp önskad mängd i bidistilled vatten vid en koncentration av 0.2 µg/µL.
- Injicera 10 – 50 nL mRNA lösning vid en koncentration av 0.2 µg/µL eller 10 nL cDNA lösning vid en koncentration som sträcker sig från 0,02 – 0,2 µg/µL, helst i partier av 95 oocyter.
- För membranet proteiner som kräver flera subenheter (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABAA -receptorer), blanda den motsvarande mRNA eller cDNAs i önskad förhållandet (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).
- Hålla äggcellen vid 17 ° C att förhindra uttrycket av värma chockar proteiner av oocyterna; lagra mikroplattan i en thermo-kontrollerade området.
- Lös de test föreningar som testades positivt i den bindande OR2-analysen på 0,1-1000 µM för elektrofysiologiska inspelningar och avyttra dem. i en 96 brunnar flat bottenplatta av polypropen.
- Syntetisera de mRNA som använder en kommersiellt tillgänglig kit efter tillverkarens anvisningar. Rengör instrument och tabellen med RNase och bära lämpliga skyddande handskar.
- Plasmider för uttryck
- Följ bruksanvisningarna av kommersiellt tillgängliga kit för mRNA syntes med bakteriell T7 eller T6 promotorer och gör 20 µL av en lösning på 0,2 µg/µL i RNase-gratis vatten.
- Bered minst 20 µL av en lösning innehållande en Eukaryoter uttryck vektor av cDNA uttryck, vanligtvis på 0.2 µg/µL upplöst i bidistilled vatten.
- Mikroskop i äggcellen och visualisering av dess kvalitet
- Injicera 10 – 50 nL av lösningen innehållande plasmid (se steg 2.3.1 eller 2.3.2) med en glas mikro-injektionsnål med en spets diameter sträcker sig upp till 100 µm monterad på en micromanipulator utrustad med ett system för utmatning av tryck eller med en automatiserad insprutningssystem.
Obs: I exempel diskuteras här injiceras oocyter partier på 95 med ett automatiserat system som är lämplig för användning med cDNA eller mRNA. - Fyll injektionsnålen med 1 µL av ett färgämne såsom metylenblått på 1% och injicera oocyterna använda standardförfarandet (antingen i kärnan för cDNA eller i cytoplasman för mRNA).
- Släng de injicerade oocyterna i ca 1 min i kokande vatten. Halvera oocyterna med ett rakblad under en kikare.
Obs: Färgen förblir lokaliserade som visas i figur 3E, möjliggör en noggrann observation av injektionen.
- Injicera 10 – 50 nL av lösningen innehållande plasmid (se steg 2.3.1 eller 2.3.2) med en glas mikro-injektionsnål med en spets diameter sträcker sig upp till 100 µm monterad på en micromanipulator utrustad med ett system för utmatning av tryck eller med en automatiserad insprutningssystem.
- Två-elektrod spänningen klämman recordings
- Placera väl plattan som innehåller oocyterna den automatiserat system, som använder principen illustreras i figur 4.
Obs: I motsats till patch clamp systemet illustreras i figur 5, sanna membranet potential av cellen läses av spänning elektroden. - Programmera automatisk inspelning systemet med ikon-baserade gränssnittet med, exempelvis systemet illustreras i diagram 6 för bestämning av koncentration aktivitet förhållandet.
- Placera väl plattan som innehåller oocyterna den automatiserat system, som använder principen illustreras i figur 4.
- Kurva montering
- Analysera resultaten med lämplig programvara, använda kurvan illustrerade koncentration aktivering, rita aktuella amplituden som en funktion av logaritmen av agonist koncentrationen.
- Iaktta den sigmoidal kurva som därefter kan utrustas med empiriska Hill ekvationen i formuläret:
Här
Y= fraktionen av evoked ström,
EG 50 = koncentrationen för en 50%-aktivering,
x = koncentration av substansen,
nH = den Hill koefficient eller uppenbara kooperativitet. - Normalisera strömmarna till en enhet genom att dividera amplituden av varje svar jämfört med värdet som registrerades på den högsta koncentrationen att analysera data från en serie celler.
- Fastställa den genomsnittliga och standardfel och inser den kurva montering använder standardmässigt tillgänglig programvara.
3. elektrofysiologiska inspelningar i hjärnan skivor
Obs: Hippocampus råtta skivor är beredda enligt nationella och institutionella riktlinjer.
-
Beredning av hippocampus skivor
- Förbereda den dissektion konstgjorda cerebrospinalvätska (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukos och 4 mM saccharose gasade i flaskan med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.
- Förbereda den inspelning konstgjorda cerebrospinalvätska (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25 mM NaHCO3och 10 mM glukos gasade i flaskan med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.
- Söva råttorna med en blandning av 2,5% isofluran och rent syre och halshugga dem.
- Skär i hårbotten efter mittlinjen med en bra sax. Skär skallen längs mittlinjen utan att skada underliggande vävnad. Ta bort skallen med pincett och Använd en bra spatel för att ösa ut hjärnan.
- Placera hjärnan i gasade dACSF lösningen vid RT och dissekera vänster Hippocampus bildandet med fina spatel.
- Skär tvärgående skivor (400 µm tjock) från medelstora delen av hippocampus med en vävnad chopper och överföra dem till inspelning kammaren med användning av en målning borste. Upprätthålla skivor på RT för 45 min.
- BEGJUTA skivor med de gasade rACSF vid 35 ° C och med en hastighet av 1,5 mL/min. bubbla lösningen med en blandning av 95% O2 och 5% CO2.
Obs: Efter detta steg, skivor är redo för elektrofysiologiska experiment.
-
Enda befolkningen spike inspelning
- Placera en hjärna skiva in i mikroskopet monterade kammaren.
- BEGJUTA segmentet med en hastighet av 3 mL/min med rACSF.
- Dra en borosilikatglas mikropipett med en pipett avdragare med ett motstånd på ~ 2 MΩ.
Obs: Denna mikropipett används som en inspelning elektrod och är elektriskt ansluten till förstärkaren. - Fyll mikropipett med en lösning innehållande 2 M NaCl och placera den i pipett hållaren av förstärkaren.
- Placera den inspelning mikropipett i de stratum pyramidale i regionen CA1 i hippocampus segmentet med hjälp av rätt micromanipulator.
Obs: Platsen representeras schematiskt i figur 7. - Placera en isolerade bipolära platinum/iridium elektrod i hållaren på den vänstra micromanipulator.
Obs: Denna elektrod används som stimulering elektroden och är elektriskt ansluten till stimulans generator. - Ställning stimulering elektroden i de Schaffer säkerheter i regionen CA1 Hippocampus segmentet med hjälp av rätt micromanipulator.
Obs: Platsen representeras schematiskt i figur 7. - Leverera en puls till stimulering elektroden med hjälp av stimulans generator varje 30 s (100 µs varaktigheter, börjar vid 10 μA) och gradvis öka stimulering styrka tills en befolkning spike (PS) visas.
- Justera styrkan stimulans för att framkalla en PS motsvarar 45% av den maximal amplitud som kan erhållas. PSs filtreras på 2,4 KHz och digitaliseras vid 20 KHz med signalförstärkare.
-
Parat-pulse hämning
- Förbereda hjärnan skivor (steg 3.1) och fortsätt enligt beskrivningen tidigare (här 3.2.1–3.2.7).
- Leverera två strömpulser (100 µs varaktigheter 20 ms intervall) till stimulering elektroden varje 30 s med hjälp av stimulans generator. Ange stimulans styrkan att framkalla en PS motsvarar 45% av den maximal amplituden.
-
Sammansatta testning
- Göra spädningar av föreningarna som ska testas i gasade ACSF så att den slutliga koncentrationen av DMSO inte högre än 0,1%.
- Lägga till DMSO kontrollösningen vid samma koncentration än i sammansatta lösningen.
- Spela in en singel (steg 3,2) eller en parad-pulse (steg 3.3) PS frammanade av Schaffer säkerheter stimuli varje 30 s för minst 30 min. PS formen bör vara stabil under denna baseline-period.
- Förbereda en bägare med gasade rACSF som innehåller en fast koncentration av substansen testas.
- BEGJUTA på Hippocampus segmentet med denna lösning medan du spelar fortfarande in enstaka eller Parade-pulse PS.
- Utvärdera återhämtningen från den sammansatta effekten av startas på segmentet med gasade rACSF utan föreningen.
Obs: För reversibla effekter, PS återgår till sin ursprungliga form som observerats under baslinjen innan förening.
-
Analys av data
- Genomsnittliga PS spår inspelade under experimentet i block av 4 med hjälp av programvara för analys av data.
- Mäta de PS amplituderna för i genomsnitt spår.
- Normalisera amplituderna som en procentandel av baslinjen värdena registreras 10 min innan startas en förening.
- Uttrycka data som menar ± SEM.
Representative Results
Bindning:
In vitro- analysen med cellmembran används för att identifiera selektiv mänsklig GABAA α5β3γ2-receptorligander bindande på BZD Alloster platsen för γ2 innehållande receptorer. Övergående transfekterade HEK293 celler som uttrycker de mänskliga GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 och α3β3γ2 receptorer används för att förbereda membran för denna analys. Effekten av de potentiella liganderna identifieras genom att mäta scintillation av [3H] flumazenil bunden till membranreceptorer (en hämning av [3H] flumazenil bindande). Deplacement bindande kurvorna genereras sedan för att bedöma selektiviteten i föreningarna för en specifik GABAA -receptor som i exemplet med RO4938581 (figur 8). Figur 9 sammanfattar profilen av flera referens föreningar inklusive α5 selektiv GABAA receptor negativa Alloster modulatorn, RO49385819, som genererades med bindande analys.
Inspelningar i Xenopus oocyter:
Uttrycket av GABAA receptorer såsom den α5β3γ2 heteromer ger robust strömmar i svar på GABA exponering. Typiska spänningen klämman inspelningar erhålls i en äggcell som uttrycker de mänskliga α5β3γ2 svar på kort GABA pulser (30 s) sträcker sig upp till 300 µM visas i figur 6. I detta experiment, de olika koncentrationerna av GABA avyttrats i plattan med 96 brunnar och svaren var frammanas genom att flytta cellen i en särskild brunn. GABA tvättades grundligt genom återgår cellen till centrala perfusion kammaren och tillämpa en genomblödning i control-lösning genom att aktivera motsvarande peristaltiska pumpen. Sekvensen som används för bestämning av koncentration aktiveringen kurvan illustreras i figur 6A. Dessa uppgifter utförs helt automatiskt, och illustrerar både kvaliteten på inspelningarna som kan erhållas i Xenopus oocyter och höga-receptoruttryck erhållits några dagar efter injektionen mRNA. De experiment, gästat olika receptor kombinationer, ge en rad EG50s, vilket är koncentrationen av GABA nödvändigt att aktivera hälften av receptorer. En tomt på EG50-värden på en spindel graf, ger som illustreras i figur 10, en snabb jämförelse av receptorn egenskaper och påverkan av subenhet sammansättning.
För att undersöka effekten av en negativ eller positiv Alloster modulator (NAM eller PAM), är det nödvändigt att jämföra responsen frammanas av en agonist (GABA) test puls, först i kontrollen och sedan i närvaro av modulatorn. En effektiv experimentellt protokoll att genomföra sådant experiment illustreras i figur 11. Svaret från cellen till en referens koncentration av GABA avgörs först och sekvensen upprepas genom att tillämpa samma GABA koncentrationen och då av en samtidig tillämpning av GABA plus modulatorn. En tomt av två överlagrade Svaren avslöjar i det här exemplet en markant hämning som orsakas av närvaron av modulatorn. En kvantifiering av modulator effekten erhålls lätt genom att beräkna förhållandet mellan responsen frammanas i närvaro av den modulator kontra kontroll och resultaten kan ritas i form av en värme-tomt. De data som visas i figur 12 visar värme tomten motsvarar inspelningarna av tre uppsättningar av data som erhållits för 96 föreningar.
Efter identifiering av föreningar som är tillräckligt aktiv, är det ofta nödvändigt att bedöma om dessa molekyler är aktiv på andra receptor kombinationer. När det gäller GABAA receptorn, 19 gener som kodar för olika subenheter har identifierats, och det är känt att en fungerande receptor kan resultera från en multimeric sammansättning av olika subenheter (se Knoflach, Hernandez och Bertrand10 för en översyn). Även om flera subenheter och kombinationer avkastningen en stor repertoar av receptor subtypes som kan kräva ett stort antal counter screening utföras, är det ofta möjligt att fokusera först på den vanligast förekommande subtyp som, när det gäller GABAA receptorer, är α1β2γ2 sammansättning. Experiment som utförs huvud till huvud med uttryck för, till exempel α5β3γ2 och α1β2γ2 i samma parti av äggcell ger en bra jämförelse av de respektiva effekterna av en viss molekyl. De typiska resultat som erhållits i tre celler för α5β3γ2 och α1β2γ2 visas i figur 13, som illustrerar den förmånliga positiva moduleringen av en molekyl på α5β3γ2.
Det experimentellt protokoll som illustreras i figur 11 är väl lämpad för karakterisering av en PAM-aktivitet. I detta protokoll är den förening som testas samarbete tillämpas med agonist successivt ökande koncentrationer. För att undvika eventuella kumulativa effekter orsakade av flera program på samma cell, mäts en ny och naiv cell för varje datapunkt. En mätning av amplituden av svaret registreras med agonist ensam och sedan under programmet förening ger en kvot som kvantifierar den PAM eller NAM effekten. Typiska resultat som erhållits vid α1β2γ2 och α5β3γ2 för diazepam visas i figur 14, avslöjar en uppenbar känslighet av den α5β3γ2 som är ca 10 gånger högre på denna receptor kombination. Dessa värden är i god korrelation med publicerade data11. Som det är tänkt att webbplatsen bensodiazepin utgörs av gränssnittet mellan γ2 och dess intilliggande α-subenheten12-14, föreslår känsligheten hos α5β3γ2 en förmånliga diazepam affinitet för γ2-α5 över γ2-α1. Möjligheten att uttrycka olika receptor kombinationer kombinerat med en effektiv funktionell karakterisering öppnar upp flera sätt att utforska bestämningsfaktorer av PAM egenskaper och deras konsekvenser för fysiologiska och farmakologiska effekter.
Hippocampus hjärnan skivor:
Experimenten med råtta Hippocampus hjärnan skivor genomförs för att validera den farmakologiska profilen av de föreningar som identifierats i in vitro- analyser i en native receptor-modell. De dominerande GABAA receptor undertyper uttryckt i pyramidala celler i hippocampus är α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 och α5β2/3γ2, som alla moduleras av bensodiazepin (BDZs)15. Parat-pulse hämning är ett paradigm som kan avslöja Hippocampus krets retbarhet av testning förändringen i svaret av andra av två ihopkopplade elektriska stimuli levereras 20 ms apart. Förändringen av andra svar beror på GABAergic feedback av interneuroner innervating de pyramidala cell lager16-18. Som visas i figur 7, i kontroll situationen, är den andra svaren av två ihopkopplade stimuli hämmad på grund av en GABAergic hämning. När denna hämning sänks genom startas på segmentet med β-CCM, hämmas en icke-selektiv NAM, den andra svaren av de två ihopkopplade stimuli i mycket mindre utsträckning. Detta experimentella paradigm är känslig för föreningar selektivt för en GABAA receptor som innehåller den α5-subenheten.
Figur 1 : Screening strategi. En typisk drug screening väg börjar med high-throughput screening där stora bibliotek av föreningar screenas för ett specifikt mål. Efter identifiering av den ledande kandidaten börjar arbetet för läkemedelskemi. Under den här fasen kemister kommer att studera och förfina molekylerna genom att utföra en strukturell modifiering för att möta de önskade kriterierna, till exempel mål selektivitet, hjärnan penetrans, stabilitet, nedbrytning etc. under denna avgörande fas, är det viktigt att bedöma om de kemiska modifieringarna inte har förändrat egenskaperna molekyl och förfina för den bästa kandidaten. Följande steg är att identifiera några lovande föreningar och föra dem till nästa steg som omfattar säkerhet, tolerans, etc. Obs att elektrofysiologi är indicerat som funktionell analys men att andra metoder, inklusive kalcium fluorescens analyser eller spänning känsliga färgämnen, kan användas som alternativ. Dessa sistnämnda metoder används också i hög genomströmning analyser som en ersättning för bindande analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Layout av en 96-väl förkromad utnyttjas för bindande experiment. Kolumn 1 används för totala bindande mätningar och kolumn 2 för icke-specifik bindning mätningar. Rader A – H är fyllda med 4 olika föreningar i ökande koncentrationer (kolumner 3 – 12), varje förening i dubbletter (dvs sammansatta 1 i rader A och E, sammansatta 2 i raderna B och F, etc.) representerade i layouten med olika färger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Mikroskop med hjälp av ett automatiserat system. (A) A exakt XYZ system, där en glas injektionsnål fylld med vätska som innehåller plasmiden av intresse, är automatiskt petade in oocyterna. (B) i denna panel visas 96 brunnar koniska-bottenplattan i vilken (C) oocyterna automatiskt injiceras. (D), här panelen illustrerar principen injektion. Den nukleära injektionsvätska penetrerar nålen äggcellen något djupare än kärnan, som visas i panel B. Sedan nålen dras tillbaka från kärnan (se panel C) före injektionen (se panelen D). (E) för att bedöma kvaliteten på injektionen, nålen kan fyllas med ett färgämne och ”kokta” oocyter kan skäras i hälften. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Automatiserad två spänning-clamp elektrod principen. Principen bygger på flytta preparatet mellan brunnar i stället för att tillämpa vätskan i perfusionen. (A), vänster sida av panelen representerar arrangemanget så att inspelningen i en Xenopus äggcell med de två elektroderna och en liten korg som kommer att upprätthålla en flytande droplet runt preparatet under rörelsen från ett prov till en annan. En bild av en äggcell som placeras i korgen med de två elektroderna visas på höger sida. (B) denna panel visar en schematisk representation av den ”uppochner” elektrofysiologi inspelning principen. (C), denna panel visar dispositionen av de äggcell, stansad plåt och tvätta station på tabellen inspelning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Två-elektrod spänningen klämman inspelning kontra patch clamp. En typisk två-elektrod spänning klämma inspelning för oocyter (vänster) jämfört med den patch clamp-konfiguration som använts för en cellinje (höger panel). Observera skillnaden i storlek mellan de oocyter som är ca 1 mm i diameter jämfört med de celler som är ca 20 µm. I två-elektrod spänningen klämman genom membranet potential i äggcellen är jämfört med önskad anläggning spänningen och signalen skillnaden injiceras i nuvarande elektroden. I en patch clamp inspelning antas det att motståndet av patch clamp elektroden är försumbar jämfört med membran motståndet och, därför att spänningen som införts av förstärkaren matas troget till cellmembranet19. Bilden illustrerar en flytande glödtråden perfusion där de två kanalerna en theta tube () är fyllda med, å ena sidan, en kontrollösning och, å andra sidan, med lösningen innehållande de drog20,21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Koncentration aktiveringen relation på de mänskliga α5β3γ2 receptorerna. (A), sekvensen styra det automatiska systemet består av en serie av ikoner och sätter det experimentellt protokollet för bestämning av koncentration aktiveringen förhållandet. I steg 1 – 3, som visas i denna panel laddar systemet i äggcellen från plattan i mäta korgen. Den läcka nuvarande mäts i steg 2 och, bör detta värde överstiger önskad kriterierna, cellen ändras automatiskt (steg 3). Efter en stabiliseringsperiod (steg 4) är äggcell svar på en referens GABA koncentrationen uppmätta (steg 5-8). Oocyter visar strömmar större än 1 µA hålls för den efterföljande värderingen. I steg 11 – 13, cellen utmanas av olika koncentrationer av GABAA och processen upprepas sig för önskat antal koncentrationer (steg 14) och celler (15 steg). (B) i denna panel visas typiska strömmarna framkallat av en serie korta GABA applikationer (30 s) tillämpas i växande ordning. Tidpunkten för den sammansatta för indikeras av barerna. (C), en tomt på den inåt toppström som en funktion av logaritmen av GABA koncentrationen ger koncentration aktiveringen kurvan som är lätt monterat av empiriska Hill ekvationen, med en kontinuerlig kurva, en EG50 på ca 11 µM och en kulle koefficient på 1,3. Strömmar in i 8 celler var normaliserade till en enhet för maximal framkallat svar. Staplarna visar standardavvikelsen för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7 : Β-CCM, en GABAA NAM minskar Parade-pulse hämning i hippocampus skivor. (A) denna panel visar en schematisk representation av en råtta Hippocampus skiva. De Schaffer säkerheter (Sch C) med ursprung från CA3 pyramidal cell axoner projektet på den dendritiska arborization av CA1 pyramidala nervceller. Mikropipetter placerades i den stratum pyramidale (str pyramidale) att spela in befolkningen spikar (PS) och i de stratum radiatum (str radiatum) för dendritiska inspelningar av fältet excitatoriska postsynaptiska potentialer (epsp). Stimulering elektroden placerades inom de Schaffer säkerheter. (B) i denna panel visas PSs frammanade av Parade stimuli tillämpas genom samma stimulerande elektroden 20 ms intervall. Den befolkningen svaren på andra stimulans (PS2) är av mindre amplitud än svaret på den första stimulansen (PS1). (C) PSs registrerades i frånvaro (svart fält) och förekomsten av β-CCM, en icke-selektiv GABAA receptor NAM (grön stapel). Β-CCM enhanced amplituden av andra PS2 genom att delvis blockera någon feed-forward GABAergic hämning. Staplarna visar standardavvikelsen för medelvärdet och *** att data är mycket betydelsefullt med ett p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: typiska bindande resultat erhålls i ett konkurrenskraftiga (hämning eller förskjutning) assay. Deplacement bindande kurvorna genereras från som IC50 och Ki kan fastställas. IC50 är koncentrationen av en konkurrerande ligand som förflyttar 50% av den specifika bindningen av radioligand och Ki (hämning konstanten för en drog) är koncentrationen av en konkurrerande ligand som skulle uppta 50% av receptorerna om ingen radioligand var närvarande. Ki beräknas från IC50 med hjälp av Cheng-Prusoff ekvation:
Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 9 : Konkurrenskraftiga deplacement bindande utfördes med ligander bindande på de stora GABAA receptor undertyperna. Tillhörighet (nM) mättes med en [3H] flumazenil-bindande analys och membran från HEK293 celler transfekterade normalnivå med olika mänskliga GABAA receptor subenhet kombinationer. Histogrammet representation illustrerar tydligt differentiell känsligheten observerat för den sammansatta RO493851 med den lägsta Ki på α5β3γ2 receptorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10 : Differential GABA känslighet av receptorer. En tomt av receptorn GABA EG50 på en spindel tomt och en representation av förmodad subenhet sammansättning ger effektiva sätt att jämföra olika subunitsna roll. Observera att införandet av γ2 subunitsna är associerade med en minskning av receptor känslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11 : Sondera effekten av en modulator. (A), här panelen illustrerar den ikonen sekvens som används för att styra det automatiska systemet. Notera att de två (A/D) ikonerna motsvara inspelningen i kontrollen (grön) och under modulator exponeringen (röd). (B) denna panel visar typiska strömmar registreras i en cell som uttrycker den GABAA -receptorn under sådan en sekvens. För att utvärdera effekterna av en modulator, genomfördes en sekvens av först mäta responsen frammanas av exponering för en fast koncentration av GABA (gröna spår), följt av exponeringen först till GABA och sedan till GABA plus modulatorn (röda spår). Positionering hårkors markörknapparna (cyan och blått) avgränsar mätningarna och blå korset anger maximal skillnaden mellan två inspelningsförhållanden. Förhållandet mellan kontroll och modulator villkoret beräknas automatiskt i analysprogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12 : Värme tomt med tre replikat. I denna panel visas en värme tomt motsvarar tre replikat av modulator effekter erhålls för 96 föreningar på mänskliga α5β3γ2 GABAA receptorerna. Nyckeltalen för test svar över kontrollen varierar mellan 0,5 och 1.2 ansågs inte signifikant från kontroll och representeras av en grön punkt. Procentsiffror på under 0,5 ansågs representera en hämmande effekt och representeras av blå prickar. Nyckeltal ovan 1.2 ansågs öka responsen och representeras av röda prickar. Observera liknelse i mönster mellan de tre oberoende inspelningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13 : Motverka screening vid α1β2γ2. (A) denna panel visar en representation av en förmodad subenhet organisation. Följande paneler Visa (B-D) en utvärdering av effekterna av en positiv Alloster modulator på mänskliga α5β3γ2 och (F-H) på α1β2γ2, med hjälp av jämförbara koncentrationer av GABA och liknande koncentrationer (100 µM) av den modulator, som betonar specificitet av substansen testas i dessa experiment. (E), denna panel visar också en representation av en förmodad subenhet organisation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14 : PAM känslighet och receptor sammansättning. Bestämning av effekterna av en serie koncentrationer av diazepam effekter (A-D) på α1β2γ2 ochE-Hα5β3γ2 receptorer avslöjar nästan en 10-faldig skillnad i uppenbara affinitet. Observera också påverkan av subenhet sammansättning på svar tid kursen med en snabbare desensibilisering på α1β2γ2 receptorer (se, till exempel paneler D och H). Observera att när α1β2γ2 och α5β3γ2 receptorer displayen olika tillhörighet för GABA (se även figur 10), koncentrationen av agonist justerades mellan de två receptorerna i en jämförbar aktiveringen utbud. (I) denna panel representerar en tomt av luckan ökning i en nuvarande amplitud normaliserade till unity kontra kontroll skick. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 15 : Uttrycket plasmid inklusive T7 och CMV promotor. Dessa paneler visar plasmiden för uttrycket i en Xenopus äggcellen (övre högra panelen) och i en cellinje. Den nedre högra panelen illustrerar en typisk HEK-293 cell transfekterade med en plasmid innehåller också genen för ett grönt fluorescerande protein (GFP) med patch-clamp inspelning elektroden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Utvecklingen av nya föreningar aktiva på en ligandreglerade jonkanal såsom GABAA receptorerna kräver användning av flera metoder. Vanligtvis utförs det första steget ofta med bindande analyser; sådana mätningar är dock otillräckliga för att karakterisera den fysiologiska aktiviteten av föreningen eller dess exakta farmakologi. I synnerhet en förening som binder till en receptor kan förbättra eller hämma dess funktion eller ens ge ingen funktionell effekt (tiga) (dvsbinda till receptorn utan att ändra dess funktion). Således krävs ett funktionellt test för en fullständig förening karakterisering.
Bindande analyser:
Den största fördelen med bindande analysen är att det kan genomföras effektivt på ett stort antal prover som sträcker sig upp till flera tusen och att det ger bindande tillhörigheter för de aktiva molekylerna. Som beskrivs häri, består det första steget av att fastställa en metod för bedömning av önskad receptor undertyper. Nämligen, medan bindning kan utföras på infödda receptorer från bråk eller hela hjärnor, sådan metod kommer att hindra fastställandet av tillhörighet på specifik receptor undertyper. Det är därför nödvändigt att använda rekombinant system till skärmen molekyler på det önskade målet. Nuförtiden, erbjuder en övergående eller stabil transfection av den önskade receptor subenhet cDNAs i cellinjer en effektiv och tillförlitlig metod för att uttrycka de receptor undertyperna av intresse (t.ex., GABAA α5β3γ2). Traditionella bindande analyser göra använda av radioligands, men nuförtiden tekniker är tillgängliga att undvika olägenhet för hantering av radioaktivitet (t.ex., kvantitativa fluorescens-baserade ligand-bindning).
Funktionella uttryck i ett värdsystem:
För att uttrycka gener i ett värdsystem, måste kodande sekvens av intresse införas i en plasmid som innehåller de adekvat promotorer. För in vitro- mRNA-syntesen används vanligtvis, de bakteriella T7 eller T6 promotorer. För ett cDNA uttryck måste transkriptionen av genen av intresse regleras av en Eukaryoter promotor såsom CMV (cytomegalovirus) eller motsvarande. Numera är flera plasmider, inklusive de två promotorer (dvs, pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), tillgänglig så att antingen en in vitro- syntes av mRNA eller ett cDNA-uttryck som visas i figur 15. Ett uttryck för GABAA receptorerna kan erhållas troget i cellinjer eller i Xenopus oocyter. De främsta fördelarna med det senare är avsaknaden av endogena receptoruttryck, enkelheten i manipulationer och tillgängligheten av ett automatiserat system för mikro-injektioner och inspelningar. Procedurerna som beskrivs i detta protokoll illustrera effektiviteten i den automatiserade system som tillåter injektion av 96 oocyter i ca 7 min och kräver ingen mikromanipulation färdigheter. Att komma ihåg att en enda äggstock från en Xenopus innehåller mellan 10 000 – 30 000 oocyter, är det uppenbart att ett stort antal cell mätningar kan utföras på ett enda preparat. Dessutom som ett uttryck kan utföras med cDNA injektioner, kan de samma plasmider som innehåller generna av intresse som är utvecklade för de bindande experiment användas för en funktionell karakterisering utan behov av ytterligare molekylärbiologi manipulationer.
En enda äggcell med tanke på dess storlek och hög yta uttryck, och ger ett antal receptorer som motsvarar ungefär konfluenta cellerna i en 35 mm petriskål. Dock representerar en oocyter beredning och injektion en bråkdel av kostnaden för en cell fodrar, som experiment inte kräver en särskild odlingssubstrat och sterila manipulationer. Aktivering av en enda GABAA -kanal ger några picoamperes (10-12) och strömmar som sträcker sig upp till tiotals microampere (10-6) registreras enkelt i en enda äggcell, som bekräftar samtidig aktiviteten av flera miljoner receptorer under ett enda svar.
Ett första steg i karakterisering av ligandreglerade jonkanaler är ofta bestämning av uppenbara affinitet receptorer. De experiment som behöver genomföras består av tillämpa en rad korta agonist test pulser och plottning amplituden av den evoked nuvarande eller, i vissa fall arean under kurvan (AUC) som en funktion av logaritmen av agonist koncentrationen. Som det är lätt genomförbart att microinject olika plasmid koncentrationer och baserat i samma parti av oocyter, är detta system av uttryck särskilt lämpliga för sådan en karakterisering. Dessutom visade en sats till sats jämförelsen en hög grad av stabilitet för olika EC50s. Påverkan av subenhet sammansättningen på den receptorn uppenbar affinitet är lätt visualiseras med en spindel tomt, som exemplifieras i figur 10.
Resultaten av två-elektrod spänningen klämman erhållits i Xenopus oocyter jämförs ofta med inspelningar gjorda med patch clamp elektroder. Medan det skulle gå utanför ramen för detta arbete att gå in i en detaljerad jämförelse mellan dessa två system, kan ett par punkter undersökas. Medan en patch clamp i celler erbjuder fördelar för en biofysiska karakterisering med en snabb drog programmet, är dess krav mer komplexa än de av den två-elektrod inspelningar i Xenopus oocyter. En första och icke försumbar svårighet är ett uttryck för ett visst protein med nödvändigheten av en cellkultur, en övergående eller stabil transfection och identifiering av de celler som uttrycker den önskvärda bygga. Det är dessutom nödvändigt att undersöka det möjliga bidraget av endogena uttrycket i betraktas cellen. Dessutom kräver en patch clamp inspelning en kunnig person att genomföra mikromanipulation i hög förstoring Mikroskop, medan personen behöver också utföra en adekvat analys under experimentet att bedöma, exempelvis kvaliteten av tätningen, tillgång motstånd etc. i kontrast, en två-elektrod spänning klämma inspelning, speciellt en med hjälp av ett automatiserat elektrofysiologiska system, kräver inte någon särskild kompetens och kan bedrivas av laboratorietekniker.
När förvärva en Elektrofysiologisk set-up, är kostnad faktor säkerligen en viktig faktor som behöver analyseras noggrant. Till exempel, medan kostnaden för ett automatiserat system är relativt hög, visar en närmare jämförelse att installation av en komplett elektrofysiologiska rigg ingår att köpa utrustning såsom bra micromanipulators, en binocular lins, en förstärkare, en perfusion systemet, och en vibrationsdämpande tabell, samtidigt förvärva data och utföra en analys. En kostnadsjämförelse mellan en två-elektrod spänningen klämman set-up kontra en patch clamp set-up avslöjar ytterligare avvikelser. Dessutom det automatiska systemet erbjuder fördelen av fullt automatiserad utrustning och körs obevakad dag och natt.
De farmakologiska egenskaperna hos en förening bestäms av dess verkningssätt på receptorn. Till exempel är konkurrenskraftiga hämmare molekyler som kan ange samma bindande ficka eller orthosteric plats, eftersom agonist själv orsakar en tävling. Icke-kompetitiva hämmare är föreningar som hämmar receptorer genom att interagera på en annan plats och i fråga om en ligandreglerade jonkanal, som kan ange och blockera Joniska pore, till exempel. Det skulle gå utanför ramen för detta arbete att undersöka olika mekanismer för interaktion, men ytterligare information kan erhållas från en farmakologisk lärobok eller från annat arbete såsom Bertrand och Bertrands22.
När det gäller Allosteriska modulatorer ändrar de sammansatta binder på en plats som är skild från webbplatsen för orthosteric, men förekomsten av molekylen energibarriären mellan de aktiva och andra staterna. Positiv Allosteriska modulatorer (PAMs) är föreningar som minskar energibarriären från vila till det aktiva tillståndet och, därför, förstärka effekten av agonist. För att karaktärisera möjligt PAM, är det därför nödvändigt att fastställa om en exponering mot föreningen förbättrar att bemöta agonist och, i så fall vid vilken koncentration. De experiment som presenteras i figur 11 och figur 14 illustrera protokoll som kan användas framgångsrikt för karakterisering av PAMs på GABAA receptorerna.
I vissa fall kan exponering för PAM ensam räcka att aktivera receptorerna. Sådan verksamhet kan bestämmas genom en smärre ändring av protokollet experimentella presenteras här. Nämligen, i stället för en samtidig tillämpning av modulatorn under exponering för GABA, protokollet kan ändras för tillämpningen av första förening ensam och sedan i närvaro av GABA. En karakterisering av den direkta agonistaktivitet kommer att göras av bestämning av amplituden av svaret frammanade av föreningen själv och jämfört den GABA-framkallat nuvarande.
Experiment som utförs i hjärnan skivor, som illustreras i figur 7, används för att bekräfta aktiviteten sammansatta på infödda receptorer i en bestämd hämmande krets innan du går vidare i djurmodeller och längs vägen mot kliniska studier. Relativt enkla data inspelning och analys protokollet tillåter rangordningen av flera föreningar genom att utvärdera deras differentiell immunmodulerande effekt på PS amplitud. Icke-specifika effekter av föreningar som inte är relaterade till GABA-systemet kan också vara upptäckta (t.ex., när förändringar i formen PS observeras). Direkt, GABAergic neurotransmission kan bedömas i dessa fall genom att mäta effekterna av föreningarna på hämmande postsynaptiska strömmar (IPSCs) använder den hela-cell patch clamp teknik8.
Disclosures
Författarna Frédéric Knoflach och Maria-Clemencia Hernandez är anställda av F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, Schweiz, ett läkemedelsföretag. Författaren Daniel Bertrand är anställd av HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genève, Schweiz, som tillhandahåller screening faciliteter till läkemedelsföretag.
Acknowledgments
Författarna tackar Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, och Marie Claire Pflimlin från Roche och Tifany Schaer och Deborah Paolucci från HiQScreen för deras utmärkta tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).
