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Neuroscience

एक गामा-Aminobutyric एसिड रिसेप्टर प्रकार एक Neurotransmission का नियमन उपंयास यौगिकों की खोज के लिए तरीके

Published: August 16, 2018 doi: 10.3791/57842
Automatic Translation
1, 1, 2
1Discovery Neuroscience, Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel, 2HiQScreen Sàrl 6

Summary

यहां, हम वर्तमान प्रोटोकॉल गाबा पर सक्रिय यौगिकों की खोज करने के लिएएक रिसेप्टर्स, फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के लिए बाध्यकारी से.

Abstract

यह पांडुलिपि गामा-aminobutyric एसिड प्रकार एक (गाबाएक) रिसेप्टर्स और उपंयास से नैदानिक परख में सक्रिय अणुओं की पहचान की दिशा में इसके उपयोग में एक इन विट्रो रिकॉमबिनेंट स्क्रीनिंग यौगिकों के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है मूषक मस्तिष्क स्लाइस में देशी रिसेप्टर्स पर उनके औषधीय प्रभाव को रिसेप्टर. रिसेप्टर्स के बेंजोडाइजेपाइन साइट पर बाध्यकारी यौगिकों के लिए, पहला कदम प्रमुख गाबाएक उपप्रकार व्यक्त कोशिका झिल्ली पर radioligand बाध्यकारी परख के विकास के होते हैं कि एक प्राथमिक स्क्रीन स्थापित करने के लिए है. फिर, Xenopus अंडाणुओं या HEK २९३ कोशिकाओं में कुतर और मानव गाबाएक रिसेप्टर्स की heterologous अभिव्यक्ति का लाभ लेने, यह electrophysiological परख में, पता लगाने के लिए संभव है, अलग रिसेप्टर के शारीरिक गुण उपप्रकारों और औषधीय गुणों की पहचान की यौगिकों । Xenopus oocyte प्रणाली यहां प्रस्तुत किया जाएगा, अंडाणुओं के अलगाव और उनके microinjection अलग mRNAs के साथ शुरू, औषधीय लक्षण वर्णन दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज clamps का उपयोग करने के लिए ऊपर । अंत में, एक अच्छी तरह से परिभाषित ंयूरॉन सर्किट में उनके मूल रिसेप्टर्स पर अणुओं की गतिविधि का आकलन करने के लिए एक माध्यमिक शारीरिक परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है कि कुतर मस्तिष्क स्लाइस में किए गए रिकॉर्डिंग वर्णित किया जाएगा । एकाधिक न्यूरॉन्स की जनसंख्या प्रतिक्रियाओं का उपयोग Extracellular रिकॉर्डिंग दवा आवेदन के साथ एक साथ प्रदर्शन कर रहे हैं.

Introduction

यहां, हम गाबा पर सक्रिय यौगिकों की खोज के लिए प्रोटोकॉल मौजूदएक रिसेप्टर्स, फिजियोलॉजी और औषध विज्ञान के लिए बाध्यकारी से. उपंयास गाबा के लिए विशिष्ट अणुओं के लिए खोज मेंएक रिसेप्टर्स, यह परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में संभव के रूप में ठीक है, ब्याज की उपप्रकार और नव पहचान यौगिकों की विशिष्टता का आकलन (जैसे, एक समीक्षा के लिए, रूडोल्फ देखें और Knoflach१या Sieghart२). दवा की खोज में एक विशिष्ट पथ और कदम है कि प्राप्त करने की जरूरत है चित्रा 1में सचित्र हैं ।

बाध्यकारी परख गया है और अभी भी मोटे तौर पर दवा की खोज में पहला कदम के रूप में इस्तेमाल किया । गाबाएक रिसेप्टर्स के मामले में, वे यौगिकों की पहचान करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि बेंजोडाइजेपाइन रिसेप्टर के बंधन साइट के लिए बाध्य जहां चिकित्सकीय उपयोगी और सुरक्षित दवाओं बाँध. अंय तकनीकों, fluorometric इमेजिंग प्लेट रीडर (FLIPR) झिल्ली संभावित लाल डाई आधारित परख3का उपयोग, barbiturates जैसे यौगिकों कि अतिरिक्त साइटों है कि उनके अवांछित पक्ष प्रभाव प्रोफ़ाइल के कारण कम वांछनीय है करने के लिए बाध्य का पता लगाने । इसके अलावा, उपयोग रंजक सीधे गाबाएक रिसेप्टर्स सक्रिय कर सकते हैं, इस प्रकार दवा4खोज के लिए इन परख की उपयोगिता पर सवाल. बाध्यकारी परख केवल सबूत है कि एक दिया यौगिक एक विशिष्ट रिसेप्टर वर्ग के लिए बाध्य कर सकते है प्रदान कर सकते हैं। इन विट्रो में सेल झिल्ली के साथ परख चयनात्मक मानव गाबाएक α5β3γ2 रिसेप्टर लाइगैंडों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. क्षणिक transfected HEK293 मानव गाबाएक α5β3γ2 व्यक्त कोशिकाओं, α1β3γ2, α2β3γ2, और α3β3γ2 रिसेप्टर्स इन परख के लिए झिल्ली तैयार करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. लाइगैंडों के प्रभाव [3 एच] flumazenil झिल्ली रिसेप्टर्स ([3एच] flumazenil बंधन का एक निषेध) के लिए बाध्य की जुटान को मापने के द्वारा पता चला है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि ब्याज की रिसेप्टर पर यौगिक बाध्यकारी अपनत्व का एक तेजी से और कुशल दृढ़ संकल्प ब्याज की रिसेप्टर पर प्रदान की जाती है ।

कार्यात्मक अध्ययन यौगिकों के कार्यात्मक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए और रिसेप्टर्स के लिए यौगिकों के बंधन की वजह से तंत्र के एक शारीरिक और औषधीय विवरण का प्रस्ताव करने के लिए आवश्यक हैं. आज, यह अच्छी तरह से मांयता प्राप्त है कि कार्यात्मक गाबाएक रिसेप्टर्स pseudosymmetry की एक धुरी ईओण ताकना और पांच समान उपइकाईयों के विधानसभा से परिणाम द्वारा गठित के आसपास के विधानसभा से परिणाम है । गाबाएक रिसेप्टर्स के अधिकांश दो या अधिक विभिन्न उपइकाईयों से बना रहे हैं. प्रमुख मस्तिष्क गाबाएक रिसेप्टर, उदाहरण के लिए, 2, 2, और 1 के एक stoichiometry में हैं1, β2, और γ2 उपइकाईयों से बना है क्रमशः5,6. Xenopus अंडाणुओं या HEK293 कोशिकाओं के रूप में एक मेजबान प्रणाली में एक पुनर्गठन तेजी से रिसेप्टर्स के औषधीय गुणों की खोज की संभावना प्रदान करता है ।

यौगिकों के औषधीय गुणों तो मस्तिष्क स्लाइस7में extracellular रिकॉर्डिंग के साथ पता लगाया है । इस विधि neurotransmission पर यौगिकों के प्रभाव की एक खोज की अनुमति देता है और समग्र में देशी रिसेप्टर्स के स्तर पर heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में निर्धारित यौगिकों के कार्यात्मक प्रभाव की पुष्टि करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है न्यूरॉन वातावरण. GABAergic neurotransmission निरोधात्मक postsynaptic स्वरुपात (IPSCs)८पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के द्वारा आणविक स्तर पर भी मूल्यांकन किया जा सकता है. लेकिन यहां प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया और मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के आधार पर अधिक विस्तृत है और एक कम प्रवाह पैदावार ।

अंत में, शक्तियों और कमजोरियों में इन विट्रो स्क्रीनिंग α5β3γ2 की पहचान के लिए इस्तेमाल झरना-चयनात्मक लाइगैंडों विभिंन तकनीकों और उनके आंतरिक सीमाओं के परिप्रेक्ष्य में चर्चा कर रहे हैं । इस काम के विशेषज्ञों और गैर गाबा के क्षेत्र में विशेषज्ञएक रिसेप्टर्स इन विट्रो इन ligand-gated आयन चैनलों के नए मॉडुलन की खोज से निपटने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में अलग के संयोजन की एक उपयोगी समीक्षा प्रदान करना चाहिए.

Protocol

Xenopus laevis का घर है और जिनेवा गुआंगज़ौ पशु दिशानिर्देश के अनुसार संभाला ।

१. Radioligand बंधनकारक

  1. परख थाली की तैयारी
    1. 5 मिमी KCl, १.२५ मिमी CaCl2, १.२५ मिमी MgCl2, १२० मिमी NaCl, और 15 मिमी Tris के साथ परख बफर के १.५ एल तैयार; ७.४ के लिए एचसीएल के साथ पीएच समायोजित करें ।
    2. यौगिकों तैयार ५०.७६ µ एम पर परीक्षण किया जा करने के लिए (जैसे, एक microcentrifuge ट्यूब में एक ९८० µ एल परख बफर में 10 मिमी पर एक 5 µ एल यौगिक). मिश्रण उंहें अच्छी तरह से 2 के लिए उच्च गति पर एक भंवर मशीन का उपयोग-5 एस ।
    3. pipetting 1 µ एल यौगिक के द्वारा संदर्भ यौगिक flumazenil के एक पूर्व कमजोर पड़ने तैयार (10 मिमी) परख बफर के १,९७० µ एल. मिश्रण उंहें अच्छी तरह से 2 के लिए उच्च गति पर एक भंवर मशीन का उपयोग-5 एस ।
    4. एक पतला [3एच] परख बफर के साथ flumazenil स्टॉक समाधान 4 डिग्री सेल्सियस से 4 एनएम में एक ५० एमएल के ट्यूब में ।
    5. पिपेट ५० µ एल/खैर के कॉलम में 1 और 3-11 ९६-अच्छी तरह से microplate के रूप में प्लेट लेआउट में दिखाया चित्र 2में प्रतिनिधित्व बफर ।
    6. पिपेट ७३.२ µ एल यौगिकों के ५०.७६ µ मीटर में पतला (चरण 1.1.2 देखें) प्लेट के कॉलम 12 में ।
    7. प्रत्येक यौगिक पतला 9 कदम (1E-10 -1E-06 मीटर) पर एक ज्यामितीय प्रगति का उपयोग कर, एक २३.१२ µ एल स्थानांतरण मात्रा के साथ और कॉलम को भरने 3 – 11. मिश्रण अच्छी तरह से कमजोर पड़ने । हर कमजोर पड़ने के बाद टिप बदलें ।
  2. कोशिका झिल्ली को पतला करना
    1. गल कोशिका झिल्ली पहले से अलग एक HEK293 मानव गाबाएक रिसेप्टर (0.025-0.15 मिलीग्राम/एमएल) को व्यक्त करने के लिए कमरे के तापमान पर ८० मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए (RT) और 4 डिग्री सेल्सियस पर परख बफर करने के लिए निलंबन स्थानांतरण ।
    2. अभी भी 4 ° c पर 30 के लिए एक ऊतक homogenizer के साथ झिल्ली समाधान resuspend-10000 पर 40 एस-12000 rpm ।
  3. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (NSB) नियंत्रण के लिए डायजेपाम पतला करना
    1. 5 मिलीलीटर में ४० µ मीटर की एकाग्रता के लिए परख बफर के साथ एक 4 मिमी डायजेपाम शेयर समाधान पतला ।
  4. प्रतिक्रिया शुरू
    1. पिपेट ५० µ एल के 4 एनएम [3एच] ९६ की एक अच्छी तरह से थाली में flumazenil और यह एक बर्फ के पानी के कंटेनर में रहते हैं ।
    2. जोड़ें १०० µ गाबा के एलएक रिसेप्टर उपप्रकार झिल्ली तैयारी 0.5 मिलीग्राम/एमएल के एक प्रोटीन एकाग्रता है ।
    3. पिपेट ५० µ एल की ४० µ मी डायजेपाम कॉलम 2 में ।
    4. बर्फ पर 1 एच के लिए थाली मशीन ।
    5. बाद में झिल्ली जुदाई और रेडियोधर्मिता माप के लिए एक ९६-अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट के प्रत्येक कुआं में परख बफर के ५० µ एल जोड़ें और प्रतिक्रिया बाद में बंद करो ।
  5. प्रतिक्रिया रोकें
    1. ५० mM Tris-HCl, pH ७.४ के साथ एक वाशिंग बफर तैयार करें ।
    2. एक ९६-अच्छी तरह से सेल हार्वेस्टर का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर । अच्छी तरह से प्रति बर्फ ठंड धोने बफर के ३०० µ एल के साथ 3x प्लेट धो लो ।
    3. एक प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्लेट के नीचे सील और तरल पदार्थ में एक अच्छी तरह से गिनती के लिए ४० µ के साथ जोड़ो और यह इथेनॉल ७०% के साथ पोंछ ।
    4. धीरे आर टी में कम से 1 ज के लिए थाली हिला । इसे आरटी पर कम से एक घंटे के लिए खड़े हो जाओ ।
    5. एक जुटाना काउंटर पर प्लेट रखकर रेडियोधर्मिता (सीपीएम में) को मापने. प्रति अच्छी तरह से 3 मिनट के लिए एक मापने की अनुमति दें ।
  6. डेटा विश्लेषण
    1. के लिए माध्य का निर्धारण 8 प्रतिकृति गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (NSB) और कुल बाइंडिंग (टीबी) के साथ ही डुप्लिकेट या नमूने के triplicates के लिए । निंन समीकरण के अनुसार प्रत्येक नमूने के माध्य के लिए% विशिष्ट बाइंडिंग (SB) की गणना करें:
      Equation 1
      यहाँ
      कुल SB = मतलब टीबी शूंय मतलब NSB।
    2. abscissa में प्लॉट% SB बनाम अवरोध करनेवाला सांद्रता तालमेल में । एकल साइट प्रतियोगिता विश्लेषण समीकरण का उपयोग करके डेटा फ़िट:
      Equation 2
      यहाँ
      y = SB का%,
      A = yकी ंयूनतम,
      ख = yकी अधिकतम,
      सी = आईसी५०,
      X = लॉग इन प्रतिस्पर्धा यौगिक की एकाग्रता के10 ,
      घ = वक्र की ढलान (एक पहाड़ी गुणांक) ।
    3. बंधन संबध (की गणना) का उपयोग कर आधा अधिक से अधिक निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी५०), पृथक्करण स्थिरांक (केडी) के [3ज] flumazenil पर संबंधित झिल्ली9, और की एकाग्रता [3एच] निंनलिखित डेटा के अनुसार परख में flumazenil-समीकरण का उपयोग कर:
      Equation 3

2. रिसेप्टर अभिव्यक्ति और रिकॉर्डिंग Xenopus अंडाणुओं में

  1. अंडाशय कटाई और oocyte की तैयारी
    1. ८८ mm NaCl, 1 mm KCl, २.४ mm NaHCO3, 10 mm HEPES, ०.८२ mm MgSO4. 7H2हे, ०.३३ mm Ca(NO3)2. 4H 2 ओ, और ०.४१ mm CaCl2.6H 2 ओ के साथबाँझ Barth समाधान तैयार करें, पीएच ७.४ में , १०० इकाई/एमएल ऑफ पेनिसिलिन, १०० µ जी/एमएल streptomycin और ०.२५ µ जी/एमएल amphotericin बी के साथ पूरक ।
    2. ८८.५ mm NaCl, २.५ mm KCl, 5 mm HEPES, 1 mm MgCl 2.6H2O, pH ७.४ के साथ 1xOR2 मीडियम (no CaCl2) तैयार करें ।
    3. Tricaine methanesulfonate में 20 मिनट के लिए गहरी संज्ञाहरण द्वारा एक Xenopus Laevis महिला बलिदान (१५० मिलीग्राम/l, पीएच ७.४ पर समायोजित) और सोडियम बिकारबोनिट (३०० मिलीग्राम/एल) decapitation द्वारा पीछा किया ।
    4. अंडाशय साफ कैंची और संदंश के साथ तेजी से फसल और उंहें 2 पेट्री-व्यंजन (10 सेमी) में 1x Barth समाधान और एंटीबायोटिक दवाओं/antimycotic की ४० मिलीलीटर से भरा जगह है ।
    5. 4 ° c पर Barth समाधान में 2 सप्ताह तक के लिए गैर-असंबद्ध अंडाशय को संग्रहीत करें ।
    6. पृथक्करण के लिए, छोटे भागों में एक साफ उस्तरा ब्लेड के साथ अंडाशय में कटौती (1-2 सेमी3) और उन्हें CaCl2 के बिना OR2 मध्यम के ५० मिलीलीटर में गर्मी (OR2-noCaCl2) ०.२% collagenase (प्रकार मैं) पर 17 – 19 डिग्री सेल्सियस में एक १०० मिलीलीटर स्पिनर 4 के लिए एक धीमी गति से आंदोलन के साथ कुप्पी – 5 h. सत्यापित करें कि चुंबकीय बार स्पिनर कुप्पी के नीचे लगभग 3-5 सेमी अंडाणुओं को कुचलने से बचने के लिए रखा गया है ।
    7. 4 के बाद-5 एच, सत्यापित करें कि अंडाणुओं के अधिकांश अपने कूप से मुक्त कर रहे है (यानी, वे चारों ओर व्यक्तिगत तैरना) । १.८ mM CaCl2के साथ पूरक OR2 की २०० मिलीलीटर के साथ उंहें धो 5x ।
    8. defolliculated अंडाणुओं को पेट्री-व्यंजन (10 सेमी) से Barth समाधान और एंटीबायोटिक्स/antimycotics से भर दें और उन्हें सीडीएनए या mRNA इंजेक्शन से पहले 17 डिग्री सेल्सियस पर कम से रात रखें ।
    9. अगले दिन, का चयन करें, एक दूरबीन के तहत, एक स्वस्थ oocyte एक वनस्पति पोल बनाम एक स्पष्ट और विशिष्ट पशु (वनस्पति पोल के लिए हल्के पीले बनाम पशु ध्रुव के लिए गहरे भूरे रंग) पेश । स्वच्छ पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें और एक के बाद एक बाँझ शंकु ९६ इंजेक्शन अच्छी तरह से थाली में अंडाणुओं एक निपटान ।
      नोट: mRNA इंजेक्शन के लिए अंडाणुओं के स्थान में कोई विशेष देखभाल की जरूरत है; जबकि, सीडीएनए इंजेक्शन के लिए, यह पशु पोल ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ अंडाणुओं ओरिएंट के लिए अपरिहार्य है ।
  2. mRNA या सीडीएनए स्वत: इंजेक्शन
    1. अनुशंसित निर्देशों के बाद एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके mRNAs को संश्लेषित करें । उपकरणों और RNase के साथ मेज साफ और उचित सुरक्षा दस्ताने पहनते हैं ।
      नोट: mRNA की गुणवत्ता के लिए एक अच्छा अभिव्यक्ति उपज निर्धारक है, और यह इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान mRNA गिरावट को रोकने के लिए अपरिहार्य है ।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके cDNAs तैयार करें और ०.२ µ g/µ l की सांद्रता पर bidistilled जल में वांछित राशि को भंग करे ।
    3. ०.२ µ जी/µ l, या nL समाधान के 10 सीडीएनए के एक एकाग्रता पर mRNA समाधान के 10 – 50 nL सुई 0.02 से लेकर एकाग्रता – 0.2 µ g/µ l, अधिमानतः में ९५ अंडाणुओं के बैचों.
    4. झिल्ली प्रोटीन के लिए एकाधिक उपइकाईयों की आवश्यकता (यानी, heteromeric α1β2γ2 गाबाएक रिसेप्टर्स), इसी mRNAs या cDNAs इच्छित अनुपात में मिश्रण (यानी, 1:1:1 या 1:10:1).
    5. 17 डिग्री सेल्सियस पर oocyte रखें अंडाणुओं द्वारा गर्मी सदमे प्रोटीन की अभिव्यक्ति को रोकने के लिए; microplate को एक थर्मामीटर-नियंत्रित संग्रह क्षेत्र में संग्रहीत करते हैं ।
    6. परीक्षण यौगिकों जो OR2 में 0.1 पर बाध्यकारी परख में सकारात्मक परीक्षण किया गया भंग-electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए 1000 µ मीटर और उंहें निपटाने में बंद एक ९६-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे की थाली ।
  3. अभिव्यक्ति के लिए Plasmids
    1. बैक्टीरियल T7 या T6 मोटरों के साथ mRNA संश्लेषण के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किटों के अनुदेश पुस्तिकाओं का पालन करें और µ-मुक्त पानी में ०.२ µ g/RNase l पर एक समाधान के 20 µ l बना लें ।
    2. सीडीएनए व्यंजक के लिए एक यूकेरियोट व्यंजक वेक्टर वाले समाधान के कम से 20 µ l को तैयार करें, सामान्यतया ०.२ µ g/µ l को bidistilled पानी में भंग कर दिया.
  4. अपनी गुणवत्ता के Oocyte और विज़ुअलाइज़ेशन में Microinjection
    1. सुई 10 – प्लाज्मिड युक्त समाधान के 50 nL (कदम 2.3.1 या 2.3.2) एक टिप व्यास के साथ एक गिलास माइक्रो इंजेक्शन सुई का उपयोग कर १०० µm एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली से सुसज्जित एक micromanipulator पर मुहिम शुरू की है
      नोट: उदाहरण में यहां पर चर्चा की, अंडाणुओं एक स्वचालित सीडीएनए या mRNA के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त प्रणाली के साथ ९५ के बैचों द्वारा इंजेक्ट कर रहे हैं ।
    2. इस तरह के 1% पर methylene नीले रंग के रूप में एक डाई के 1 µ एल के साथ इंजेक्शन सुई भरें और मानक प्रक्रिया का उपयोग कर अंडाणुओं सुई (या तो सीडीएनए के लिए या कोशिका द्रव्य में mRNA के लिए नाभिक में).
    3. उबलते पानी में के बारे में 1 मिनट के लिए इंजेक्शन अंडाणुओं निपटाने । एक दूरबीन के तहत एक उस्तरा ब्लेड के साथ छमाही में अंडाणुओं में कटौती ।
      नोट: डाई चित्र 3ईमें दिखाया गया है, इंजेक्शन का एक सटीक अवलोकन की अनुमति के रूप में स्थानीयकृत रहता है ।
  5. दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग
    1. अच्छी तरह से स्वचालित प्रणाली है, जो 4 चित्रामें सचित्र सिद्धांत का उपयोग करता है पर अंडाणुओं युक्त थाली प्लेस ।
      नोट: 5 चित्रामें सचित्र पैच दबाना प्रणाली के विपरीत, कोशिका की असली झिल्ली क्षमता वोल्टेज इलेक्ट्रोड द्वारा पढ़ा जाता है.
    2. प्रोग्राम स्वचालित रिकॉर्डिंग प्रणाली के साथ आइकन आधारित इंटरफेस का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, इस योजना एकाग्रता गतिविधि संबंध के निर्धारण के लिए चित्रा 6 में सचित्र ।
  6. वक्र फिटिंग
    1. उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण, सचित्र एकाग्रता सक्रियण वक्र का उपयोग कर, एगोनिस्ट एकाग्रता के लघुगणक के एक समारोह के रूप में वर्तमान आयाम साजिश ।
    2. sigmoidal वक्र है कि बाद में फार्म में अनुभवजंय पहाड़ी समीकरण के साथ फिट किया जा सकता निरीक्षण:
      Equation 4
      यहाँ
      वाई= पैदा वर्तमान के अंश,
      EC ५० = एक ५०% सक्रियण के लिए एकाग्रता,
      x = यौगिक की एकाग्रता,
      एनएच = पहाड़ी गुणांक या स्पष्ट cooperativity ।
    3. कोशिकाओं की एक श्रृंखला से प्राप्त डेटा का विश्लेषण करने के लिए उच्चतम एकाग्रता पर दर्ज मूल्य बनाम प्रत्येक प्रतिक्रिया के आयाम विभाजित करके एक एकता के लिए धाराओं को सामान्य.
    4. औसत और मानक त्रुटियों का निर्धारण और वक्र मानक उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फिटिंग का एहसास ।

3. मस्तिष्क स्लाइस में Electrophysiological रिकॉर्डिंग

नोट: हिप्पोकैम्पस चूहा स्लाइस राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार तैयार कर रहे हैं ।

  1. हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी
    1. विच्छेदन कृत्रिम cerebro-रीढ़ की हड्डी द्रव (dACSF) १२४ मिमी NaCl १२४, २.५ मिमी KCl, १.२५ मिमी KH2पीओ4, 2 मिमी MgSO4. 7H2ओ, २.५ मिमी CaCl2 2H 2ओ, 26 मिमी NaHCO3, 10 मिमी ग्लूकोज, और 4 मिमी के साथ तैयार ९५% O2 और 5% कं2का मिश्रण के साथ बोतल में saccharose मार डाला ।
    2. रिकॉर्डिंग कृत्रिम cerebro-स्पाइनल द्रव (rACSF) १२४ मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, १.२५ मिमी KH2पीओ4, 2 मिमी MgSO4. 7H2ओ, २.५ मिमी CaCl2 2H2ओ, 25 मिमी NaHCO3, और 10 मिमी ग्लूकोज के साथ तैयार ९५% O2 और 5% कं2का मिश्रण के साथ बोतल में मार डाला ।
    3. Anesthetize २.५% isoflurane और शुद्ध ऑक्सीजन के मिश्रण का उपयोग चूहों और उन्हें decapitate ।
    4. कैंची के एक ठीक जोड़ी के साथ midline निंनलिखित खोपड़ी काट । अंतर्निहित ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना midline साथ खोपड़ी में कटौती । चिमटी के साथ खोपड़ी निकालें और मस्तिष्क बाहर स्कूप करने के लिए एक ठीक रंग का उपयोग करें ।
    5. मार डाला dACSF समाधान आरटी में मस्तिष्क प्लेस और एक ठीक रंग के साथ छोड़ दिया हिप्पोकैम्पस गठन काटना ।
    6. एक ऊतक हेलिकॉप्टर के साथ हिप्पोकैम्पस के मध्यम भाग से अनुप्रस्थ स्लाइसें (४०० µm मोटी) में कटौती और एक पेंटिंग ब्रश के उपयोग के साथ रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए उन्हें हस्तांतरण. ४५ मिनट के लिए आरटी पर स्लाइस बनाए रखें ।
    7. Perfuse ३५ ° c पर मार डाला rACSF के साथ स्लाइसें और १.५ मिलीलीटर की दर से/न्यूनतम ९५% O2 और 5% सह2के मिश्रण के साथ समाधान बुलबुला ।
      नोट: इस चरण के बाद, स्लाइस electrophysiological प्रयोगों के लिए तैयार हैं.
  2. एकल जनसंख्या स्पाइक रिकॉर्डिंग
    1. माइक्रोस्कोप पर चढ़कर चैंबर में एक मस्तिष्क टुकड़ा रखें ।
    2. rACSF के साथ 3 मिलीलीटर/मिनट की दर से स्लाइस Perfuse ।
    3. ~ 2 MΩ के एक प्रतिरोध होने पिपेट खींचने के साथ एक borosilicate ग्लास micropipette खींचो ।
      नोट: इस micropipette एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के रूप में प्रयोग किया जाता है और विद्युत एम्पलीफायर के लिए जुड़ा हुआ है.
    4. 2 M NaCl वाले सॉल्यूशन के साथ micropipette भरें और इसे एम्पलीफायर के पिपेट होल्डर में लगाएं ।
    5. स्थिति हिप्पोकैम्पस टुकड़ा के CA1 क्षेत्र में परत pyramidale में रिकॉर्डिंग micropipette सही micromanipulator का उपयोग कर ।
      नोट: स्थान योजनाबद्ध रूप से चित्र 7में प्रतिनिधित्व किया है ।
    6. बाईं micromanipulator पर धारक में एक अछूता द्विध्रुवी प्लेटिनम/इरिडियम इलेक्ट्रोड प्लेस ।
      नोट: इस इलेक्ट्रोड उत्तेजना इलेक्ट्रोड के रूप में प्रयोग किया जाता है और विद्युत उत्तेजना जनरेटर से जुड़ा है.
    7. हिप्पोकैम्पस स्लाइस के CA1 क्षेत्र में Schaffer जमानतों में उत्तेजना इलेक्ट्रोड सही micromanipulator का उपयोग कर स्थिति.
      नोट: स्थान योजनाबद्ध रूप से चित्र 7में प्रतिनिधित्व किया है ।
    8. उत्तेजना करने के लिए एक मौजूदा पल्स उद्धार इलेक्ट्रोड हर 30 s (१०० µs अवधियों का उपयोग करते हुए, 10 µA से शुरू) और एक जनसंख्या स्पाइक (पुनश्च) जब तक उत्तेजना शक्ति में वृद्धि
    9. प्रोत्साहन शक्ति को समायोजित करने के लिए एक PS अधिकतम आयाम है कि प्राप्त किया जा सकता है की ४५% के अनुरूप पैदा करने के लिए । PSs २.४ khz पर फ़िल्टर किए जाते हैं और संकेत एम्पलीफायर का उपयोग कर 20 khz पर डिजीटल.
  3. युग्मित-नाड़ी निषेध
    1. मस्तिष्क स्लाइसें (चरण ३.१) तैयार करें और पहले वर्णित के रूप में आगे बढ़ें (steps 3.2.1 – 3.2.7) ।
    2. उत्तेजना के लिए दो मौजूदा दालों उद्धार (एक 20 ms अंतराल पर १०० µs अवधि) प्रत्येक 30 उत्तेजना जनरेटर का प्रयोग एस इलेक्ट्रोड । एक अधिकतम आयाम के ४५% करने के लिए इसी पुनश्च पैदा करने के लिए उत्तेजना ताकत सेट करें ।
  4. यौगिक परीक्षण
    1. मार डाला ACSF में परीक्षण किया जा करने के लिए यौगिकों के कमजोर पड़ने बनाओ ताकि DMSO के अंतिम एकाग्रता ०.१% से अधिक नहीं.
    2. यौगिक समाधान में से एक ही एकाग्रता पर नियंत्रण समाधान करने के लिए DMSO जोड़ें ।
    3. रिकॉर्ड एक एकल (चरण ३.२) या एक बनती-नाड़ी (कदम ३.३) पुनश्च Schaffer संपार्श्विक उत्तेजना द्वारा पैदा की हर 30 एस कम 30 मिनट के लिए । इस आधारभूत अवधि के दौरान PS आकृति स्थिर होनी चाहिए ।
    4. मार डाला rACSF के साथ एक चोंच तैयार यौगिक की एक निश्चित एकाग्रता युक्त परीक्षण किया जा करने के लिए ।
    5. Perfuse इस समाधान के साथ हिप्पोकैम्पस टुकड़ा है जबकि अभी भी रिकॉर्डिंग एकल या युग्मित-पल्स पुनश्च ।
    6. यौगिक के बिना मार डाला rACSF के साथ टुकड़ा perfusing द्वारा यौगिक प्रभाव से वसूली का मूल्यांकन.
      नोट: प्रतिवर्ती प्रभाव के लिए, PS अपनी प्रारंभिक आकृति के लिए वापस आ जाता है यौगिक अनुप्रयोग से पहले आधारभूत अवधि के दौरान स्वीकार्य ।
  5. डेटा विश्लेषण
    1. डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके 4 के ब्लॉक में प्रयोग के दौरान रिकॉर्ड किए गए PS अंश का औसत ।
    2. औसत निशान के पुनश्च आयाम को मापने ।
    3. एक यौगिक perfusing करने से पहले 10 मिनट दर्ज की गई आधारभूत मानों के प्रतिशत के रूप में आयाम को सामान्य.
    4. अर्थ ± SEM के रूप में डेटा व्यक्त करते हैं ।

Representative Results

बाइंडिंग:
सेल झिल्ली के साथ इन विट्रो परख में चयनात्मक मानव गाबाएक α5β3γ2 रिसेप्टर लाइगैंडों रिसेप्टर्स युक्त γ2 के BZD allosteric साइट पर बाध्यकारी की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्षणिक transfected HEK293 मानव गाबाएक α5β3γ2 व्यक्त कोशिकाओं, α1β3γ2, α2β3γ2, और α3β3γ2 रिसेप्टर्स इस परख के लिए झिल्ली तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है. संभावित लाइगैंडों के प्रभाव [3 एच] flumazenil झिल्ली रिसेप्टर्स ([3एच] flumazenil बंधन का एक निषेध) के लिए बाध्य को मापने के द्वारा पता चला है । विस्थापन बाध्यकारी घटता तो RO4938581 (चित्रा 8) के साथ उदाहरण के रूप में एक विशिष्ट गाबाएक रिसेप्टर के लिए यौगिकों के selectivity का आकलन करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं. चित्रा 9 α5 चयनात्मक गाबाएक रिसेप्टर नकारात्मक allosteric मॉडुलन, RO49385819, जो बाध्यकारी परख का उपयोग कर उत्पन्न किए गए थे कि सहित कई संदर्भ यौगिकों के प्रोफ़ाइल संक्षेप.

में रिकॉर्डिंग Xenopus अंडाणुओं:
गाबा की अभिव्यक्ति जैसे α5β3γ2 heteromer गाबा एक्सपोजर के जवाब में मजबूत धाराओं पैदावार के रूप मेंएक रिसेप्टर्स. ठेठ वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग एक oocyte व्यक्त में प्राप्त मानव α5β3γ2 के जवाब में संक्षिप्त गाबा पल्सेस (30 एस) को लेकर ३०० µ मी चित्रा 6में दिखाया गया है. इस प्रयोग में गाबा के विभिन्न सांद्रता ९६-वेल प्लेट में निपटारा कर दिया गया और प्रतिक्रियाओं को एक विशिष्ट कुआं में सेल ले जाकर पैदा किया गया. गाबा केंद्रीय छिड़काव कक्ष के लिए सेल लौटने और इसी सिकुड़नेवाला पंप सक्रिय करके नियंत्रण समाधान के एक छिड़काव लागू करने से अच्छी तरह से धोया गया था. एकाग्रता सक्रियण वक्र के निर्धारण के लिए प्रयुक्त कार्यक्रम अनुक्रम चित्रा 6एमें सचित्र है । पूरी तरह से स्वचालित रूप से आयोजित, इन आंकड़ों रिकॉर्डिंग कि Xenopus अंडाणुओं में प्राप्त किया जा सकता है और रिसेप्टर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर mRNA इंजेक्शन के बाद कुछ दिनों प्राप्त की दोनों गुणवत्ता वर्णन । प्रयोगों, अलग रिसेप्टर संयोजन पर आयोजित, चुनाव आयोग की एक श्रृंखला५०एस, जो गाबा की एकाग्रता के लिए आवश्यक रिसेप्टर्स के आधे सक्रिय है उपज. इस तरह के रूप में 10 चित्रामें सचित्र एक मकड़ी ग्राफ पर चुनाव आयोग५०के मूल्यों का एक भूखंड, रिसेप्टर गुण और उपइकाई संरचना के प्रभाव की एक तेजी से तुलना प्रदान करता है ।

एक नकारात्मक या सकारात्मक allosteric मॉडुलन (NAM या पाम) के प्रभाव की जांच करने के लिए, यह एक एगोनिस्ट (गाबा) परीक्षण पल्स, नियंत्रण में पहले और फिर मॉडुलनकर्ता की उपस्थिति में पैदा की प्रतिक्रिया की तुलना करने के लिए आवश्यक है. एक कुशल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल इस तरह के एक प्रयोग का संचालन करने के लिए चित्र 11में सचित्र है । गाबा की एक संदर्भ एकाग्रता के लिए सेल की प्रतिक्रिया पहले से निर्धारित है और अनुक्रम एक ही गाबा एकाग्रता और फिर एक सह द्वारा गाबा प्लस मॉडुलन के आवेदन द्वारा दोहराया जाता है. दो आरोपित प्रतिक्रियाओं की एक साजिश इस उदाहरण में एक चिह्नित मॉडुलन की उपस्थिति की वजह से संकोच से पता चलता है. मॉडुलन प्रभाव का एक ठहराव आसानी से नियंत्रण और परिणाम एक गर्मी साजिश के रूप में प्लॉट किया जा सकता है मॉडुलन की उपस्थिति में पैदा की प्रतिक्रिया के अनुपात कंप्यूटिंग द्वारा प्राप्त की है. चित्रा 12 में दिखाया गया डेटा ९६ यौगिकों के लिए प्राप्त तीन डेटा सेट की रिकॉर्डिंग के लिए इसी गर्मी साजिश को स्पष्ट करना ।

पर्याप्त रूप से सक्रिय हैं कि यौगिकों की पहचान के बाद, यह अक्सर इन अणुओं अन्य रिसेप्टर संयोजन पर सक्रिय कर रहे हैं का आकलन करने के लिए अपरिहार्य है. गाबाएक रिसेप्टर के मामले में, 19 विभिन्न उपइकाईयों के लिए एंकोडिंग जीन की पहचान की गई है, और यह ज्ञात है कि एक कार्यात्मक रिसेप्टर विभिन्न उपइकाईयों के एक multimeric विधानसभा से परिणाम कर सकते हैं (Knoflach, Hernandez, और बर्ट्रेंड के लिए10 देखें एक समीक्षा) । हालांकि एकाधिक उपइकाईयों और संयोजनों रिसेप्टर उपप्रकार है कि काउंटर स्क्रीनिंग की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है की एक विशाल प्रदर्शनों की जांच की उपज, यह अक्सर सबसे प्रचुर मात्रा में उपप्रकार है जो, गाबा के मामले में एक पर पहले ध्यान केंद्रित करने के लिए संभव है रिसेप्टर्स, α1β2γ2 संरचना है. प्रयोगों के सिर की अभिव्यक्ति के साथ सिर का आयोजन किया, उदाहरण के लिए, α5β3γ2 और oocyte के एक ही बैच में α1β2γ2 एक दिया अणु के संबंधित प्रभावों की एक अच्छी तुलना उपज । ठेठ α5β3γ2 और α1β2γ2 के लिए तीन कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों चित्रा 13में दिखाया गया है, जो α5β3γ2 पर एक अणु के तरजीही सकारात्मक मॉडुलन दिखाता है ।

प्रयोगात्मक 11 चित्र में सचित्र प्रोटोकॉल अच्छी तरह से एक पाम गतिविधि के लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल है । इस प्रोटोकॉल में, यौगिक है कि परीक्षण किया है उत्तरोत्तर बढ़ती सांद्रता में एगोनिस्ट के साथ सह-लागू है । एक ही कक्ष पर एकाधिक अनुप्रयोगों के कारण संभावित संचयी प्रभावों से बचने के लिए, प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए एक नया और भोली कक्ष मापा जाता है । एगोनिस्ट अकेले के साथ दर्ज की प्रतिक्रिया के आयाम का एक माप और फिर यौगिक आवेदन के दौरान एक अनुपात जो पाम या गुटनिरपेक्ष प्रभाव quantifies पैदावार । ठेठ α1β2γ2 और डायजेपाम के लिए α5β3γ2 में प्राप्त परिणाम 14 चित्रामें दिखाया गया है, α5β3γ2 की एक स्पष्ट संवेदनशीलता खुलासा है कि लगभग 10 गुना अधिक इस रिसेप्टर संयोजन पर है. ये मान प्रकाशित डेटा11के साथ अच्छे संबंध में हैं । जैसा कि यह सोचा है कि बेंजोडाइजेपाइन साइट इंटरफेस द्वारा गठित γ2 और उसके निकटवर्ती α उपइकाई12-14के बीच है, α5β3γ2 की संवेदनशीलता डायजेपाम-γ2 ओवर α5-γ2 के लिए एक तरजीही हैं1 अपनत्व का सुझाव देती है । संभावना अलग रिसेप्टर एक कुशल कार्यात्मक लक्षण वर्णन के साथ संयुक्त संयोजनों को व्यक्त करने के लिए कई तरीके पाम संपत्तियों के निर्धारकों और शारीरिक और औषधीय प्रभाव के लिए उनके निहितार्थ का पता लगाने के खुल जाता है ।

हिप्पोकैम्पस ब्रेन स्लाइसेस:
चूहे हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस के साथ प्रयोगों में इन विट्रो परख में एक देशी रिसेप्टर मॉडल में पहचान यौगिकों के औषधीय प्रोफ़ाइल को मान्य करने के लिए आयोजित कर रहे हैं. प्रमुख गाबाएक रिसेप्टर उपहिप्पोकैम्पस के पिरामिड कोशिकाओं में व्यक्त प्रकार है α1β2/3γ2, α2β2/3γ2, और α5β2/3γ2, जो सभी बेंजोडाइजेपाइन (BDZs)15द्वारा संग्राहक रहे हैं । युग्मित-पल्स निषेध दो युग्मित विद्युत उत्तेजनाओं के दूसरे के जवाब में परिवर्तन का परीक्षण करके हिप्पोकैम्पस सर्किट उत्तेजित कर सकते हैं पता चलता है 20 एमएस के अलावा दिया । दूसरी प्रतिक्रिया के परिवर्तन पिरामिडीय कोशिका परत16-18innervating ंयूरॉंस द्वारा GABAergic प्रतिक्रिया के कारण है । के रूप में चित्रा 7में दिखाया गया है, नियंत्रण की स्थिति में, दो युग्मित उत्तेजनाओं का दूसरा जवाब एक GABAergic अवरोध के कारण बाधित है । जब यह संकोच β-सीसीएम, एक गैर चयनात्मक गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ टुकड़ा perfusing द्वारा कम है, दो युग्मित उत्तेजनाओं का दूसरा जवाब एक बहुत कम हद तक बाधित है । इस प्रयोगात्मक प्रतिमान एक गाबा α5 उपइकाई युक्त रिसेप्टर के लिए चयनात्मक यौगिकों के प्रति संवेदनशील है.

Figure 1
चित्रा 1 : स्क्रीनिंग रणनीति । एक ठेठ दवा स्क्रीनिंग मार्ग उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग जिसमें यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों एक विशिष्ट लक्ष्य के लिए जांच की जाती है के साथ शुरू होता है । लीड परीक्षार्थी की पहचान के बाद ही औषधीय रसायन का काम शुरू होता है । इस चरण के दौरान केमिस्टों द्वारा वांछित मानदंडों को पूरा करने के लिए संरचनात्मक संशोधन करते हुए अणुओं का अध्ययन और परिशोधित करेंगे जैसे लक्ष्य selectivity, ब्रेन penetrance, स्थिरता, क्षरण आदि इस महत्वपूर्ण चरण के दौरान, यह आवश्यक है यह आकलन करना कि क्या रासायनिक संशोधनों ने अणु संपत्तियों को बदला नहीं है और श्रेष्ठ उम्मीदवार के लिए परिशोधित किया है. निंनलिखित कदम के लिए कुछ होनहार यौगिकों की पहचान करने और उंहें अगले कदम जो सुरक्षा, सहिष्णुता, आदि ध्यान दें कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कार्यात्मक परख के रूप में संकेत दिया है, लेकिन है कि अंय तरीकों, कैल्शियम सहित प्रतिदीप्ति शामिल करने के लिए लाना है परख या वोल्टेज संवेदनशील रंजक, विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । ये बाद के तरीकों को भी बाध्यकारी परख के लिए एक प्रतिस्थापन के रूप में उच्च प्रवाह परख में इस्तेमाल किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एक ९६-अच्छा चढ़ाया बाध्यकारी प्रयोगों के लिए उपयोग का लेआउट । स्तंभ 1 गैर-विशिष्ट बाइंडिंग माप के लिए कुल बाइंडिंग माप और 2 स्तंभ के लिए उपयोग किया जाता है । पंक्तियां a – H 4 विभिन्न यौगिकों को बढ़ाने में सांद्रता (कॉलम 3 – 12), डुप्लिकेट में प्रत्येक यौगिक (यानी, पंक्तियों में एक यौगिक 1 और ई, पंक्तियों में यौगिक 2, बी और एफ, आदि) में विभिन्न रंगों के साथ लेआउट में प्रतिनिधित्व भर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : Microinjection एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर । (क) एक सटीक XYZ प्रणाली, जिसमें एक गिलास इंजेक्शन सुई प्लाज्मिड युक्त तरल से भरा हुआ है, जिसमें ब्याज की अंडाणुओं में स्वचालित रूप से प्रहार होता है । (ख) इस पैनल में ९६-ठीक शंकु-निचली प्लेट दिखाई देती है जिसमें (C) अंडाणुओं स्वचालित रूप से इंजेक्ट किए जाते हैं । (घ) इस पैनल इंजेक्शन सिद्धांत को दर्शाता है । परमाणु इंजेक्शन के लिए, सुई oocyte नाभिक से थोड़ा गहरा प्रवेश, के रूप में पैनल बीमें दिखाया गया है फिर, सुई नाभिक से वापस ले लिया है (पैनल सीदेखें) इंजेक्शन से पहले (पैनल डीदेखें) । (ङ) इंजेक्शन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए, सुई एक डाई से भरा जा सकता है और "पकाया" अंडाणुओं आधा में काटा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : स्वचालित दो वोल्टेज-क्लैंप इलेक्ट्रोड सिद्धांत । सिद्धांत छिड़काव में तरल लागू करने के बजाय कुओं के बीच तैयारी चलती पर आधारित है । (क) पैनल के बाएं हाथ की ओर दो इलेक्ट्रोड और एक नमूना से आंदोलन के दौरान तैयारी के आसपास एक तरल छोटी बूंद को बनाए रखने जाएगा कि छोटे टोकरी के साथ एक Xenopus oocyte में रिकॉर्डिंग की अनुमति व्यवस्था का प्रतिनिधित्व करता है दूसरे के लिए । दो इलेक्ट्रोड के साथ टोकरी में रखा oocyte की एक तस्वीर दाहिने हाथ की ओर दिखाया गया है. (ख) इस पैनल "उल्टा" इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग सिद्धांत के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है । (ग) इस पैनल रिकॉर्डिंग टेबल पर oocyte, यौगिक प्लेट, और वॉश स्टेशन के स्वभाव का पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग बनाम पैच दबाना । एक ठेठ दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना अंडाणुओं के लिए रिकॉर्डिंग (बाएँ पैनल) एक सेल लाइन (दाएँ पैनल) के लिए इस्तेमाल किया पैच दबाना विन्यास की तुलना में है. अंडाणुओं जो लगभग 20 µm है बनाम व्यास में 1 मिमी के बीच आकार में अंतर नोट करें । दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना में, oocyte की झिल्ली की क्षमता वांछित पकड़े वोल्टेज की तुलना में है और संकेत अंतर वर्तमान इलेक्ट्रोड में इंजेक्शन है. एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग में, यह माना जाता है कि पैच क्लैंप इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध झिल्ली प्रतिरोध बनाम नगण्य है और इसलिए, कि वोल्टेज एम्पलीफायर द्वारा लगाया जाता है ईमानदारी से कोशिका झिल्ली19करने के लिए खिलाया जाता है. चित्र एक तरल रेशा छिड़काव जिसमें एक थीटा ट्यूब () के दो चैनलों के साथ भर रहे हैं, एक हाथ पर, एक नियंत्रण समाधान और, दूसरी ओर, दवा20,21युक्त समाधान के साथ दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : मानव α5β3γ2 रिसेप्टर्स में एकाग्रता सक्रियण संबंध. (क) स्वचालित प्रणाली को नियंत्रित अनुक्रम माउस की एक श्रृंखला के होते है और एकाग्रता सक्रियण संबंध के निर्धारण के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सेट । 1 – 3 चरणों में, जैसा कि इस पैनल में दिखाया गया है, सिस्टम प्लेट से oocyte को मापने की टोकरी में लोड करता है । रिसाव वर्तमान चरण 2 में मापा जाता है, और यह मान इच्छित मापदंड से अधिक होना चाहिए, कक्ष स्वचालित रूप से परिवर्तित हो जाता है (चरण 3) । एक स्थिरीकरण अवधि के बाद (चरण 4), एक संदर्भ गाबा एकाग्रता के लिए oocyte प्रतिक्रिया मापा जाता है (चरण 5-8). अंडाणुओं 1 µA से बड़ा धाराओं प्रदर्शित अनुवर्ती माप के लिए रखा जाता है । चरण 11-13 में, सेल गाबा के विभिंन सांद्रता द्वारा चुनौती दी हैएक और प्रक्रिया ही सांद्रता की वांछित संख्या (14 कदम) और कोशिकाओं (15 कदम) के लिए दोहराता है । (ख) इस पैनल ठेठ धाराओं संक्षिप्त गाबा अनुप्रयोगों (30 एस) की एक श्रृंखला के द्वारा पैदा से पता चलता है बढ़ते क्रम में लागू किया । यौगिक आवेदन के समय सलाखों के द्वारा संकेत दिया है । (ग) गाबा एकाग्रता के लघुगणक के एक समारोह के रूप में पीक आवक वर्तमान के एक भूखंड एकाग्रता सक्रियण वक्र है कि आसानी से अनुभवजंय पहाड़ी समीकरण से फिट है पैदावार, एक सतत वक्र के साथ, के बारे में 11 µ मीटर में एक चुनाव आयोग५० , और एक पहाड़ी १.३ के गुणांक । 8 कोशिकाओं में दर्ज धाराओं अधिक से अधिक पैदा की प्रतिक्रिया के लिए एक एकता के लिए सामान्यीकृत थे । पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : β-सीसीएम, एक गाबाएक NAM हिप्पोकैम्पस स्लाइस में बनती-नाड़ी अवरोध को कम कर देता है. (क) इस पैनल के एक चूहे हिप्पोकैम्पस टुकड़ा की एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है । Schaffer संपार्श्वों (Sch सी) वृक्ष पिरामिडीय न्यूरॉन्स के arborization CA1 पर CA3 हवामहल कोशिका axons परियोजना से उद्भव. Micropipettes परत pyramidale (str pyramidale) में जनसंख्या spikes (पी एस) रिकॉर्ड और परत radiatum (str radiatum) क्षेत्र वृक्ष उत्तेजक क्षमता (postsynaptic) के epsp रिकॉर्डिंग के लिए में रखा गया । उत्तेजना इलेक्ट्रोड Schaffer जमानतों के भीतर रखा गया था । (ख) यह पैनल एक 20 एमएस अंतराल पर एक ही उत्तेजक इलेक्ट्रोड के माध्यम से लागू किया गया है कि युग्मित उत्तेजनाओं से पैदा PSs दिखाता है । दूसरी उत्तेजना (PS2) के लिए जनसंख्या प्रतिक्रिया है कि पहले उत्तेजना (PS1) के जवाब की तुलना में छोटे आयाम की है । (ग) PSs अनुपस्थिति (काली पट्टी) और β-सीसीएम, एक गैर चयनात्मक गाबाएक रिसेप्टर NAM (हरी पट्टी) की उपस्थिति में दर्ज किए गए थे. β-सीसीएम आंशिक रूप से किसी भी फ़ीड आगे GABAergic निषेध अवरुद्ध द्वारा दूसरे PS2 के आयाम बढ़ाया । पट्टियां माध्य की मानक त्रुटि इंगित करती है और * * * वह डेटा किसी p < 0.01 के साथ अत्यधिक महत्वपूर्ण है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्रा 8: ठेठ बाध्यकारी एक प्रतियोगी (निषेध या विस्थापन) परख में प्राप्त परिणाम । विस्थापन बंधन curves उत्पन्न होता है जिसमें से आईसी५० और Ki निर्धारित किया जा सकता है । आईसी५० एक प्रतिस्पर्धा ligand जो radioligand के विशिष्ट बंधन के ५०% विस्थापित की एकाग्रता है, और (एक दवा के लिए निषेध लगातार) एक प्रतिस्पर्धा ligand की एकाग्रता है जो रिसेप्टर्स के ५०% पर कब्जा होगा अगर कोई radioligand मौजूद थे । की गणना की है आईसी५० चेंग-Prusoff समीकरण का उपयोग कर:
Equation 5
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Figure 9
चित्र 9 : प्रतिस्पर्धी विस्थापन बाध्यकारी प्रमुख गाबाएक रिसेप्टर उपप्रकार में बाध्यकारी लाइगैंडों के साथ प्रदर्शन किया गया था. समानताएं (एनएम) एक का उपयोग कर मापा गया [3एच] flumazenil-बाध्यकारी परख और HEK293 कोशिकाओं से झिल्ली क्षणिक अलग मानव गाबाएक रिसेप्टर उप इकाई संयोजन के साथ transfected. हिस्टोग्राम प्रतिनिधित्व स्पष्ट रूप से अंतर α5β3γ2 रिसेप्टर्स पर सबसे कम के साथ यौगिक RO493851 के लिए मनाया संवेदनशीलता दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 10
चित्र 10 : अंतर गाबा रिसेप्टर्स की संवेदनशीलता. एक साजिश रिसेप्टर गाबा एक मकड़ी की साजिश पर चुनाव आयोग५० और ख्यात उपइकाई संरचना का प्रतिनिधित्व कुशल तरीके अलग उपइकाईयों की भूमिका की तुलना प्रदान करते हैं । ध्यान दें कि γ2 उपइकाई की शुरूआत रिसेप्टर संवेदनशीलता में कमी के साथ जुड़ा हुआ है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 11
चित्र 11 : एक मॉडुलन के प्रभाव की जांच. (क) इस पैनल को स्वचालित प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल आइकन अनुक्रम दिखाता है । ध्यान दें कि दो (A/D) चिह्न नियंत्रण (हरा) में रिकॉर्डिंग के अनुरूप है और मॉडुलन जोखिम (लाल) के दौरान । (ख) इस पैनल ठेठ धाराओं के एक ऐसे अनुक्रम के दौरान गाबाएक रिसेप्टर व्यक्त सेल में दर्ज दिखाता है. एक मॉडुलन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, पहले गाबा की एक निश्चित एकाग्रता (ग्रीन ट्रेस) के लिए जोखिम द्वारा पैदा की प्रतिक्रिया को मापने का एक दृश्य, गाबा के लिए पहले जोखिम और फिर गाबा प्लस मॉडुलन (लाल ट्रेस) के बाद, आयोजित किया गया था. पोजिशनिंग क्रॉसहेयर टेप कर्सर (सियान और नीला) माप का सीमांकन, और ब्लू क्रॉस दो रिकॉर्डिंग शर्तों के बीच अधिकतम अंतर को इंगित करता है । नियंत्रण और मॉडुलन शर्त के बीच अनुपात स्वचालित रूप से विश्लेषण सॉफ्टवेयर में गणना की है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 12
चित्र 12 : तीन के साथ हीट प्लॉट प्रतिकृति । इस पैनल मानव α5β3γ2 गाबाएक रिसेप्टर्स पर ९६ यौगिकों के लिए प्राप्त मॉडुलन प्रभाव के तीन दोहराने के लिए इसी गर्मी की साजिश से पता चलता है. ०.५ और १.२ के बीच लेकर नियंत्रण पर परीक्षण प्रतिक्रिया के अनुपात के रूप में नियंत्रण से काफी अलग नहीं माना जाता था और एक हरे रंग की बिंदी द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । ०.५ नीचे अनुपात एक निरोधात्मक प्रभाव का प्रतिनिधित्व करने के रूप में माना जाता है और नीले डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे थे. १.२ से ऊपर अनुपात प्रतिक्रिया को बढ़ाने के रूप में माना जाता है और लाल डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे थे । तीन स्वतंत्र रिकॉर्डिंग के बीच पैटर्न में पढ़्ते नोट करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 13
चित्र 13 : α1β2γ2 में काउंटर स्क्रीनिंग । (क) इस पैनल के एक ख्यात उपइकाई संगठन का प्रतिनिधित्व दिखाता है । निंनलिखित पैनलों शो (बीडी) मानव α5β3γ2 में एक सकारात्मक allosteric मॉडुलन के प्रभाव का मूल्यांकन और (α1β2γ2 परएफएच), गाबा और इसी तरह की सांद्रता की तुलनीय सांद्रता का उपयोग (१०० µ m) मॉडुलन, जो इन प्रयोगों में परीक्षण यौगिक की विशिष्टता पर प्रकाश डाला. (ङ) यह पैनल एक ख्यात उपइकाई संगठन का प्रतिनिधित्व भी दिखाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 14
चित्र 14 : पाम संवेदनशीलता और रिसेप्टर संरचना । डायजेपाम प्रभाव की सांद्रता की एक श्रृंखला के प्रभाव का निर्धारण (a-D) α1β2γ2 पर और (E-H) α5β3γ2 रिसेप्टर्स स्पष्ट संबध में लगभग एक 10 गुना अंतर से पता चलता है. ध्यान दें भी α1β2γ2 रिसेप्टर्स पर एक तेजी से अधिक संवेदीकरण के साथ प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम पर उपइकाई संरचना के प्रभाव (देखें, उदाहरण के लिए, पैनलों डी और एच). ध्यान दें कि α1β2γ2 और α5β3γ2 रिसेप्टर्स गाबा के लिए अलग समानताएं प्रदर्शन के रूप में ( यह भी आंकड़ा 10देखें), एगोनिस्ट की एकाग्रता दो रिसेप्टर्स के बीच एक तुलनीय सक्रियण सीमा में होना करने के लिए समायोजित किया गया था. (I) यह पैनल एक मौजूदा एकता को नियंत्रण शर्त बनाम सामान्यीकृत आयाम में गुना वृद्धि की एक साजिश का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 15
चित्र 15 : T7 और सीएमवी मोटर सहित अभिव्यक्ति प्लाज्मिड । ये पैनल एक Xenopus oocyte (ऊपरी दाएँ फलक) में अभिव्यक्ति के लिए प्लाज्मिड दिखाने के लिए और एक सेल लाइन में. नीचे सही पैनल एक ठेठ HEK-२९३ सेल transfected एक प्लाज्मिड साथ एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) पैच-दबाना रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के साथ के लिए भी जीन युक्त दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

ऐसे गाबाएक रिसेप्टर्स के रूप में एक ligand-gated आयन चैनल पर सक्रिय उपंयास यौगिकों के विकास के कई तरीकों के उपयोग की आवश्यकता है. आमतौर पर, पहला कदम अक्सर बाध्यकारी परख का उपयोग किया जाता है; हालांकि, ऐसे माप यौगिक या इसके सटीक औषध विज्ञान की शारीरिक गतिविधि की विशेषता के लिए अपर्याप्त हैं । विशेष रूप से, एक यौगिक है कि एक रिसेप्टर को बांध बढ़ाने या अपने समारोह को बाधित या यहां तक कि कोई कार्यात्मक प्रभाव पैदा कर सकते हैं (चुप) (यानी, अपने कार्य को संशोधित करने के बिना रिसेप्टर को बांध). इस प्रकार, एक कार्यात्मक परीक्षण एक पूर्ण यौगिक लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है ।

बाध्यकारी परख:
बाध्यकारी परख का मुख्य लाभ यह है कि यह कुशलतापूर्वक कई हजारों को लेकर नमूनों की एक बड़ी संख्या पर आयोजित किया जा सकता है और यह सक्रिय अणुओं के लिए बाध्यकारी समानताएं प्रदान करता है । यहां वर्णित के रूप में, पहला कदम वांछित रिसेप्टर उपप्रकार के आकलन के लिए एक विधि की स्थापना के होते हैं । अर्थात्, जबकि बंधन भागों या पूरे दिमाग से मूल रिसेप्टर्स पर आयोजित किया जा सकता है, इस तरह के एक विधि विशिष्ट रिसेप्टर उपप्रकार में समानताएं के निर्धारण को रोकने जाएगा. इसलिए, वांछित लक्ष्य पर अणुओं स्क्रीन करने के लिए रिकॉमबिनेंट प्रणालियों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । आजकल, सेल लाइनों में वांछित रिसेप्टर उपइकाई cDNAs के एक क्षणिक या स्थिर अभिकर्मक के लिए ब्याज की रिसेप्टर उपप्रकार व्यक्त करने के लिए एक कुशल और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है (जैसे, गाबाएक α5β3γ2). पारंपरिक बाध्यकारी परख radioligands का उपयोग करते हैं, लेकिन आजकल तकनीक उपलब्ध है कि रेडियोधर्मिता से निपटने की असुविधा से बचने के (जैसे, मात्रात्मक प्रतिदीप्ति आधारित ligand-बाध्यकारी) ।

एक मेजबान प्रणाली में कार्यात्मक अभिव्यक्ति:
एक मेजबान प्रणाली में जीन एक्सप्रेस, ब्याज की कोडिंग अनुक्रम एक प्लाज्मिड है कि पर्याप्त मोटरों शामिल में डाला जाना चाहिए । आमतौर पर, के लिए इन विट्रो mRNA संश्लेषण, बैक्टीरियल T7 या T6 मोटरों का उपयोग किया जाता है । एक सीडीएनए अभिव्यक्ति के लिए, ब्याज की जीन की प्रतिलिपि ऐसे सीएमवी (cytomegalovirus) या समकक्ष के रूप में एक यूकेरियोट मोटर द्वारा विनियमित किया जाना चाहिए । आजकल, दो मोटरों सहित कई plasmids, (यानी, pUNIV, pCMV-6AC, पीएसएफ-सीएमवी/T7, पीसीआई-नव, pcDNA), या तो एक इन विट्रो संश्लेषण में mRNA की अनुमति उपलब्ध है या एक सीडीएनए अभिव्यक्ति के रूप में चित्र 15में दिखाया गया है । गाबाएक रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति ईमानदारी से या तो सेल लाइनों में या Xenopus अंडाणुओं में प्राप्त किया जा सकता है । बाद के मुख्य लाभ एक अंतर्जात रिसेप्टर अभिव्यक्ति की कमी, जोड़तोड़ की सादगी, और सूक्ष्म इंजेक्शन और रिकॉर्डिंग के लिए एक स्वचालित प्रणाली की उपलब्धता कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं स्वचालित प्रणाली की क्षमता है जो के बारे में 7 मिनट में ९६ अंडाणुओं के इंजेक्शन की अनुमति देता है और कोई micromanipulation कौशल की आवश्यकता है वर्णन । याद है कि एक Xenopus से एक एकल अंडाशय 10000 – 30000 अंडाणुओं के बीच होता है, यह स्पष्ट है कि सेल माप की एक बड़ी संख्या में एक ही तैयारी पर आयोजित किया जा सकता है । इसके अलावा, के रूप में एक अभिव्यक्ति सीडीएनए इंजेक्शन का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है, एक ही plasmids है कि बाध्यकारी प्रयोगों के लिए विकसित कर रहे है ब्याज की जीन युक्त एक कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए आगे आणविक जीवविज्ञान की आवश्यकता के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है जोड़तोड़.

अपने बड़े आकार और उच्च सतह अभिव्यक्ति को देखते हुए, एक एकल oocyte रिसेप्टर्स कि लगभग एक ३५ मिमी पेट्री डिश में धाराप्रवाह कोशिकाओं के बराबर है की एक संख्या पैदावार । हालांकि, एक अंडाणुओं तैयारी और इंजेक्शन एक सेल लाइन की लागत का एक अंश का प्रतिनिधित्व करता है, के रूप में प्रयोग एक विशिष्ट संस्कृति मध्यम और बाँझ जोड़तोड़ की आवश्यकता नहीं है । एक एकल गाबाएक चैनल के सक्रियकरण कुछ picoamperes (10-12) पैदावार और धाराओं microampere के दसियों को लेकर (10-6) आसानी से एक एकल oocyte में दर्ज कर रहे हैं, जो कई लाखों लोगों के सहवर्ती गतिविधि की पुष्टि एक भी प्रतिक्रिया के दौरान रिसेप्टर्स.

ligand-gated आयन चैनलों के लक्षण वर्णन में एक पहला कदम अक्सर रिसेप्टर्स के स्पष्ट संबंध का निर्धारण है. प्रयोगों है कि आयोजित की जरूरत है संक्षिप्त एगोनिस्ट परीक्षण दालों की एक श्रृंखला लागू करने और पैदा की वर्तमान के आयाम की साजिश रचने से मिलकर बनता है या, कुछ मामलों में, वक्र के तहत क्षेत्र (ईमेज) एगोनिस्ट एकाग्रता के लघुगणक के एक समारोह के रूप में. के रूप में यह आसानी से विभिंन प्लाज्मिड सांद्रता और अंडाणुओं के एक ही बैच में अनुपात microinject संभव है, अभिव्यक्ति की इस प्रणाली को इस तरह के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है । इसके अलावा, एक बैच के लिए बैच तुलना अलग चुनाव आयोग५०एस के लिए स्थिरता की एक उच्च डिग्री का पता चला । रिसेप्टर के स्पष्ट संबंध पर उपइकाई संरचना के प्रभाव को आसानी से एक मकड़ी की साजिश का उपयोग कर, चित्र 10में उदाहरण के रूप में कल्पना की है ।

दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना Xenopus अंडाणुओं में प्राप्त के परिणाम अक्सर पैच क्लैंप इलेक्ट्रोड का उपयोग कर बनाया रिकॉर्डिंग के साथ तुलना कर रहे हैं. जबकि यह इस काम के दायरे से बाहर जाने के लिए इन दोनों प्रणालियों के बीच एक विस्तृत तुलना में जाना होगा, कुछ बिंदुओं की जांच की जा सकती है । जबकि कोशिकाओं में एक पैच दबाना एक तेजी से दवा आवेदन के साथ एक भौतिक लक्षण वर्णन के लिए लाभ प्रदान करता है, अपनी आवश्यकताओं को Xenopus अंडाणुओं में दो इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग की तुलना में अधिक जटिल हैं. एक पहली और गैर नगण्य कठिनाई एक कोशिका संस्कृति की आवश्यकता के साथ एक दिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति है, एक क्षणिक या स्थिर अभिकर्मक, और वांछित निर्माण व्यक्त कर रहे हैं कि कोशिकाओं की पहचान. इसके अलावा, यह माना जाता सेल में अंतर्जात अभिव्यक्ति के संभावित योगदान की जांच अपरिहार्य है । इसके अलावा, एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक कुशल व्यक्ति के लिए एक उच्च आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत micromanipulation आचरण की आवश्यकता है, जबकि उस व्यक्ति को भी आकलन करने के लिए प्रयोग के दौरान एक पर्याप्त विश्लेषण करने की जरूरत है, उदाहरण के लिए, सील की गुणवत्ता, इसके विपरीत उपयोग प्रतिरोध आदि , एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग, विशेष रूप से एक स्वचालित electrophysiological प्रणाली का उपयोग कर, किसी भी विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं है और प्रयोगशाला तकनीशियनों द्वारा आयोजित किया जा सकता है ।

जब एक electrophysiological सेट अप प्राप्त करने, लागत विचार निश्चित रूप से एक महत्वपूर्ण कारक है कि जरूरतों को ध्यान से विश्लेषण किया है । उदाहरण के लिए, जबकि एक स्वचालित प्रणाली की लागत अपेक्षाकृत अधिक है, एक करीब तुलना से पता चलता है कि एक पूरा electrophysiological रिग की स्थापना जैसे अच्छे micromanipulators, एक दूरबीन लेंस, एक एंपलीफायर, एक छिड़काव के रूप में उपकरणों की खरीद भी शामिल है प्रणाली, और एक विरोधी कंपन तालिका, जबकि भी डेटा प्राप्त करने और एक विश्लेषण प्रदर्शन । एक दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना सेट अप बनाम एक पैच क्लैंप सेट अप के बीच एक लागत तुलना भी आगे विसंगतियों का पता चलता है । इसके अलावा, स्वचालित प्रणाली पूरी तरह से स्वचालित उपकरण का लाभ प्रदान करता है और दिन और रात को उपेक्षित चलाता है ।

एक यौगिक के औषधीय गुणों रिसेप्टर पर कार्रवाई की अपनी विधा के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, प्रतिस्पर्धी अवरोधकों अणुओं है कि एक ही बाध्यकारी जेब, या orthosteric साइट में प्रवेश कर सकते हैं, के रूप में एगोनिस्ट ही एक प्रतियोगिता का कारण बनता है । गैर प्रतिस्पर्धी अवरोधक यौगिकों कि एक और साइट पर बातचीत से रिसेप्टर्स को बाधित कर रहे हैं और, एक ligand के मामले में-gated आयन चैनल, कि दर्ज करें और ईओण ताकना ब्लॉक कर सकते हैं, उदाहरण के लिए. यह इस काम के दायरे से बाहर जाने के लिए संपर्क के विभिंन तंत्र की जांच करेंगे, लेकिन अधिक जानकारी एक औषधीय पाठ्यपुस्तक से प्राप्त किया जा सकता है और/या बर्ट्रेंड और बर्ट्रेंड है22के रूप में अंय काम से ।

allosteric मॉडुलन के मामले में, एक साइट है कि orthosteric साइट से अलग है पर यौगिक बांधता है, लेकिन अणु की उपस्थिति सक्रिय और अन्य राज्यों के बीच ऊर्जा बाधा को संशोधित करता है. पॉजिटिव allosteric ढा (पम्म) ऐसे यौगिक होते हैं जो आराम से सक्रिय अवस्था में ऊर्जा अवरोध को कम करते हैं और इसलिए, एगोनिस्ट के प्रभाव को बढ़ाते हैं । संभव पाम प्रभाव विशेषताएं, यह इसलिए, यदि यौगिक के लिए एक जोखिम एगोनिस्ट की प्रतिक्रिया को बढ़ाता है और निर्धारित करने के लिए आवश्यक है, अगर ऐसा है, जिस पर एकाग्रता । चित्र 11 और चित्रा 14 में प्रस्तुत प्रयोगों को सफलतापूर्वक गाबाएक रिसेप्टर्स पर पम्म के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटोकॉल को स्पष्ट करना.

कुछ मामलों में, अकेले पाम करने के लिए जोखिम रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त हो सकता है । इस तरह की गतिविधि प्रायोगिक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत की एक मामूली संशोधन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । अर्थात्, गाबा के लिए जोखिम के दौरान एक सह मॉडुलन के आवेदन का उपयोग कर के बजाय, प्रोटोकॉल पहले अकेले यौगिक के आवेदन के लिए संशोधित किया जा सकता है और फिर गाबा की उपस्थिति में. प्रत्यक्ष एगोनिस्ट गतिविधि का लक्षण वर्णन की प्रतिक्रिया के आयाम के निर्धारण द्वारा किया जाएगा खुद को यौगिक द्वारा पैदा की और गाबा की तुलना में वर्तमान पैदा की ।

इस तरह के चित्र 7में सचित्र के रूप में मस्तिष्क स्लाइस में किए गए प्रयोगों, पशु मॉडल में आगे जाने के लिए और नैदानिक परीक्षणों की ओर मार्ग के साथ पहले एक निश्चित निरोधात्मक सर्किट में देशी रिसेप्टर्स पर यौगिक गतिविधि की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. अपेक्षाकृत सरल डेटा रिकॉर्डिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल पुनश्च आयाम पर उनके अंतर modulatory प्रभाव का मूल्यांकन करके कई यौगिकों की रैंकिंग की अनुमति देता है । गैर विशिष्ट यौगिकों जो गाबा प्रणाली से संबंधित नहीं हैं के प्रभाव भी पता लगाया जा सकता है (जैसे, पुनश्च आकार में परिवर्तन मनाया जाता है). प्रत्यक्ष, GABAergic neurotransmission इन मामलों में निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (IPSCs) पर यौगिकों के प्रभाव को मापने के द्वारा पूरे सेल पैच दबाना तकनीक8का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखक Frédéric Knoflach और मारिया-Clemencia Hernandez एफ Hoffmann-ला Roche एजी, ४०७० बेसल, स्विट्जरलैंड, एक दवा कंपनी के कर्मचारी हैं । लेखक डैनियल बर्ट्रेंड HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, १२२२ Vésenaz जिनेवा, स्विट्जरलैंड, दवा कंपनियों को स्क्रीनिंग सुविधाएं प्रदान करने का एक कर्मचारी है ।

Acknowledgments

लेखकों जूडिथ Lengyel, मारिया कॅग, Grégoire Friz, राहेल Haab, और Pflimlin से मैरी क्लेयर Roche और Tifany Schaer और दबोरा Paolucci से HiQScreen उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General equipment
96 well cell harvester -(Filtermate 196)  Packard To filter membranes with bound radioligand
Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) Packard Microplate Scintillation and Luminescence counter
Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) Packard Vial Scintillation and Luminescence counter
Liquid  handler (Biomek 2000) Beckman coulter To prepare compound dilutions
Vortex (Vortex Genie 2) Scientific industries Inc. To mix compound stock solutions
Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) Kinematica AG To resuspend the membrane preparations
XLfit5 software Microsoft Excel
 add-on by IDBS		 Curve fitting software
Smart Pull UniPix - Electrode Puller
RoboInject MultiChannel Systems - Automated Injection (Xenopus Oocytes)
HiClamp MultiChannel Systems - Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes)
DataMining MultiChannel Systems - Data Analysis Software
DataMerger MultiChannel Systems - Data Processing Software
Digidata 1550 Molecular Devices Low noise data acquisition system
CyberAmp 380 or equivalent Axon Instruments Programmable Signal Conditioner
pClamp program suite Molecular Devices Software for data acquisition and analysis software
Antivibraton table  TMC To avoid microelectrode vibrations 
Patchstar Micromanipulators Scientifica To accurately position microelectrodes in brain slices
Faraday Cage  Sutter Instruments To isolate recordings from noise
McIlwain Tissue Chopper Campden Instruments LTD  To prepare brain slices
Borosilicate glass micropipette  Warner Instruments GC150TF-10 To record extracellular potentials in brain slices
Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode World Precision Instruments To stimulate the brain slices with current
Stimulus generator for current and voltage driven stimulation MultiChannel Systems STG4000 Delivers the current to the stimulation electrode
Plasticware
Microtiter plate round bottom Corning #3365 Used for the binding assay
GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter  Packard  #6005174 used for the binding assay
50 mL Tubes Falcon  #352070 used for the binding assay
Safe-lock tubes 1.5 mL Eppendorf #0030 120086 used for the binding assay
Safe-lock tubes 2 mL Eppendorf #0030 120094 used for the binding assay
Shipping tubes 180 mL  Semadeni Europe AG  #3722 used for the binding assay
Pony vial Polyethylene 6 mL  Perkin Elmer  #6013329 used for the binding assay
Top Seal  Perkin Elmer  #60051859 used for the binding assay
Spinner Flask Bellco BELLCO # 1965-00100 Spinner Flask
96  Well Plate (Conical) Thermo Scientific Milian 56368 Injection plate for the oocytes
96  Well Plate (Flat bottom) Corning (Vitaris Switzerland) 3364-cor Compound Plate for the HiClamp
Glass capillary  Hilgenberg (Germany) - borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament
RNA preparation
Ambion mMessage mMachine Thermo Fisher Scientific for the in vitro synthesis
Chemicals
Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. Used for binding assay
Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. Used for binding assay
Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO Used for binding assay
Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO Used for binding assay
Diazepam 4 mM in DMSO Used for binding assay
[3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C Used for binding assay
Microscint 40  Packard  #6013641 Used for binding assay
Ultima Gold  Perkin Elmer  #6013329 Used for binding assay
MS-222 Sigma Sigma # A5040 MS-222
AB/AM Sigma Sigma # A5955 antibiotics / antimycotics
Collagenase Sigma Sigma # C1030 Collagenase Type I
Rnase Sigma Sigma # R2020-250 mL RNaseZAP
EndoFree Plasmid maxi Kit Qiagen Qiagen # 12362
Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) Sigma
Membranes
Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. Used for binding assay

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References

  1. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
  2. Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
  3. Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
  4. Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
  5. Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
  6. Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
  7. Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
  8. Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
  9. Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
  10. Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
  11. Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
  12. Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
  13. Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
  14. Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
  15. Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
  16. Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
  17. Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
  18. Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
  19. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
  20. Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
  21. Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
  22. Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).

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एक गामा-Aminobutyric एसिड रिसेप्टर प्रकार एक Neurotransmission का नियमन उपंयास यौगिकों की खोज के लिए तरीके
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Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission. J. Vis. Exp. (138), e57842, doi:10.3791/57842 (2018).

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