Summary
Her presenterer vi for å oppdage forbindelser aktiv ved GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi.
Abstract
Dette manuskriptet presenterer en trinnvis protokoll for screening forbindelser på gamma-aminobutyric acid skriver en (GABAA) reseptorer og bruk mot identifikasjon av romanen molekyler i preklinisk analyser fra en i vitro rekombinant reseptor å deres farmakologiske effekter på innfødt reseptorer i gnager hjernen skiver. For forbindelser bindende på benzodiazepiner stedet reseptoren, er det første trinnet å sette opp en primære skjerm som består av å utvikle radioligand binding analyser på cellemembraner uttrykke store GABAA subtyper. Deretter benytte seg av heterologous uttrykk for gnager og menneskelig GABAA reseptorer i Xenopus oocytes eller HEK 293 celler, er det mulig å utforske, i elektrofysiologiske analyser, fysiologiske egenskapene til ulike reseptoren subtyper og Farmakologiske egenskaper av de identifiserte forbindelsene. Xenopus oocyte systemet vil bli presentert her starter med isolering av oocytes og deres microinjection med forskjellige mRNAs, til farmakologisk karakterisering ved hjelp av to elektrode spenning klemmer. Til slutt, opptak i gnager hjernen skiver beskrives som brukes som en sekundær fysiologiske test for å vurdere aktiviteten til molekyler på deres opprinnelige reseptorer i en veldefinert neuronal krets. Ekstracellulære innspillinger med befolkningen svar flere neurons er vist med narkotika-program.
Introduction
Her presenterer vi protokoller for oppdagelsen av forbindelser aktive på GABAA reseptorer, fra bindingen til fysiologi og farmakologi. I søk for romanen molekyler gjelder GABAA reseptorer, er det avgjørende å definere, så nøyaktig som mulig, undertypen av interesse og vurdering av spesifisitet av nylig identifisert forbindelser (f.eksfor gjennomgang, se Rudolph og Knoflach1eller Sieghart2). En typisk bane i stoffet funnet og trinnene som må oppnås er illustrert i figur 1.
Bindende analyser har vært og er fortsatt i stor grad brukes som første trinn i stoffet funnet. Ved GABAA reseptorer, er de optimalisert for å identifisere forbindelser som binder til benzodiazepiner binding området av reseptoren der terapeutisk nyttig og pengeskap narkotika binde. Andre teknikker, bruk fluorometric tenkelig plate leseren (FLIPR) membran potensielle røde fargebasert analyser3, oppdage forbindelser som barbiturater som binder seg til andre områder som er mindre ønskelig på grunn av deres uønsket side-effekt-profil. I tillegg kan de utnyttet fargestoffer direkte aktivere GABAA -reseptorer problematiserer dermed nytten av disse analyser for drug discovery4. Bindende analyser kan bare gi bevis for at en gitt sammensatt kan binde til en bestemt klasse. In vitro analyser med cellemembraner brukes til å identifisere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 reseptor ligander. Transiently transfekterte HEK293 celler uttrykke den menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 reseptorer brukes til å forberede membraner disse analyser. Effekten av ligander oppdages ved å måle scintillation av [3H] flumazenil bundet til membran reseptorer (en hemming av [3H] flumazenil binding). Den største fordelen med denne teknikken er at en rask og effektiv fastsettelse av den sammensatte-forpliktende tilhørighet på reseptoren rundt tilbys på reseptoren av interesse.
Funksjonell studier er viktig å vurdere den funksjonelle aktiviteten av forbindelser og å foreslå en fysiologiske og farmakologiske forklaring av mekanismer forårsaket av binding av forbindelsene til receptors. I dag er det anerkjente at funksjonelle GABAA reseptorer resultere fra monteringen av fem underenheter rundt en akse av pseudosymmetry dannet av ionisk pore og resultat fra samlingen av fem identiske underenheter. De fleste av GABAA reseptorer består av to eller flere forskjellige underenheter. Stor hjerne GABAA reseptoren, for eksempel består av α1, β2 og γ2 underenheter i en støkiometri av 2, 2 og 1 henholdsvis5,6. En rekonstituering i et vertssystem som Xenopus oocytes eller HEK293 celler tilbyr muligheten til raskt å utforske de farmakologiske egenskapene av reseptorer.
Farmakologiske egenskaper av forbindelser er deretter undersøkt med ekstracellulære innspillinger i hjernen skiver7. Denne metoden tillater en utforskning av effekten av forbindelser på neurotransmission og gir en effektiv måte å bekrefte funksjonelle virkningene av forbindelser i heterologous uttrykk systemer på nivået av innfødte reseptorer i samlet neuronal miljø. GABAergic neurotransmission kan også vurderes på molekylært nivå ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs)8. Men protokollen brukes her og basert på hele celle oppdateringen klemme opptak i hjernen skiver er mer forseggjort og gir en lavere gjennomstrømning.
Til slutt, styrker og svakheter for vitro screening gjennomgripende brukes for identifikasjon av α5β3γ2-selektiv ligander diskuteres i perspektiv av ulike teknikker og deres iboende begrensninger. Dette arbeidet bør gi eksperter og ikke-eksperter innen GABAA reseptorer en nyttig gjennomgang av kombinasjonen av ulike i vitro tilnærminger brukt å takle oppdagelsen av nye modulatorer disse ligand-gated ion kanaler.
Protocol
Xenopus laevis er plassert og håndteres i henhold til Genève Canton dyr retningslinjer.
1. Radioligand Binding
-
Forberedelse av analysen plate
- Forberede 1.5 L analysebuffer med 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM NaCl og 15 mM Tris; justere pH med HCl 7,4.
- Forberede den forbindelser skal testes på 50.76 µM (f.eks, en 5 µL ved 10 mM til en 980 µL analysebuffer i et microcentrifuge rør). Bland dem godt med en vortex maskin med høy hastighet for 2-5 s.
- Forberede en pre fortynning av referanse sammensatte flumazenil av pipettering 1 µL av sammensatt (10 mM) å 1,970 µL av analysebuffer. Bland dem godt med en vortex maskin med høy hastighet for 2-5 s.
- Fortynne en [3H] flumazenil lager løsning med analysebuffer ved 4 ° C til 4 nM i et 50 mL polypropylen rør.
- Pipetter 50 µL/vel av analysebuffer i kolonne 1 og 3-11 av en 96-brønnen microplate som vist i plate oppsettet i figur 2.
- Pipetter 73.2 µL av forbindelser utvannet på 50.76 µM (se trinn 1.1.2) i kolonnen 12 av platen.
- Fortynn hver sammensatte, bruker en geometrisk progresjon over 9 trinn (1E-10 -1E-06 M), med en 23.12 µL overføringen volumet og fyll kolonner 3-11. Bland fortynning godt. Endre spissen etter hver fortynning.
-
Fortynne cellemembraner
- Tine cellemembraner tidligere isolert fra en HEK293 overexpressing menneskelige GABAA reseptor (0.025-0,15 mg/mL) skaffer 80 mL ved romtemperatur (RT) og overføre suspensjon til analysebuffer på 4 ° C.
- Resuspend membran løsningen på 4 ° C med en vev homogenizer for 30-40 s på 10.000-12 000 rpm.
-
Fortynne diazepam for kontrollen uspesifisert binding (NSB)
- Fortynne en 4 mM diazepam lagerløsning med analysebuffer i en konsentrasjon av 40 µM i 5 mL.
-
Starte reaksjonen
- Pipetter 50 µL av 4 nM [3H] flumazenil i hver brønn av 96-brønns plate og holde det i isen vann beholdere.
- Legg 100 µL av GABAA reseptor undertype membraner preparatet å ha en protein konsentrasjon på 0,5 mg/mL.
- Pipetter 50 µL av 40 µM diazepam i kolonne 2.
- Inkuber platen 1t på is.
- Legge til 50 µL av analysebuffer i hver brønn av en 96-brønns filter plate for påfølgende membran separasjon og radioaktivitet måling og stoppe reaksjonen etterpå.
-
Stoppe reaksjonen
- Forberede en vask buffer med 50 mM Tris-HCl, pH 7.4.
- Filtrere løsningen ved å benytte en 96-brønns celle innhøsting. Vaske platen 3 x med 300 µL iskald vaske bufferen per brønn.
- Forsegle bunnen av platen med en plastfolie og legge 40 µL av scintillation cocktailparty for flytende scintillation teller i hver vel og tørk med etanol 70%.
- Forsiktig risting platen i minst 1 h på RT. La den stå i minst en time ved RT.
- Måle radioaktiviteten (i CPM) ved å sette platen på en scintillation teller. Tillate en måle for 3 min per brønn.
-
Dataanalyse
- Bestemme gjennomsnittet for 8 gjentak av ikke-spesifikk (NSB) og den totale bindingen (TB) samt duplikater eller triplicates prøvene. Beregne % bestemt bindingen (SB) for gjennomsnittet av hver prøve etter denne formelen:
her
totalt SB = den betyr TB minus mener NSB. - Tegne inn i abscissa % SB versus i Ordinat hemmer konsentrasjoner. Tilpasse dataene med enkelt nettsted konkurranse analyse ligningen:
her
y = % av SB,
A = minimum av y,
B = maksimalt antall y,
C = KI50,
X = Logg10 av konsentrasjonen av konkurrerende sammensatte,
D = skråningen av kurven (en Hill koeffisient). - Beregne forpliktende tilhørighet (Ki) bruke den halve maksimal inhibitoriske konsentrasjonen (IC50), dissosiasjon konstant (Kd) av [3H] flumazenil på respektive membraner9og konsentrasjonen av [3H] flumazenil i analysen i henhold til denne data-bruke formelen:
- Bestemme gjennomsnittet for 8 gjentak av ikke-spesifikk (NSB) og den totale bindingen (TB) samt duplikater eller triplicates prøvene. Beregne % bestemt bindingen (SB) for gjennomsnittet av hver prøve etter denne formelen:
2. reseptor uttrykk og opptak i Xenopus Oocytes
- Eggstokkene høsting og oocyte forberedelse
- Forberede den sterile Barth løsningen med 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7H2O, 0,33 mM Ca (ingen3)2.4H2O og 0.41 mM CaCl2.6H2O, ved pH 7.4 , supplert med 100 enhet/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin og 0,25 µg/mL av amfotericin B.
- Klargjør 1 x OR2 mediet (ingen CaCl2) med 88,5 mM NaCl, 2,5 KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, ved pH 7.4.
- Offer en Xenopus Laevis kvinnelige av dyp anestesi for 20 min i Tricaine methanesulfonate (i en konsentrasjon av 150 mg/L, justert ved pH 7.4) og natriumbikarbonat (300 mg/L) etterfulgt av halshogging.
- Høste eggstokkene raskt med ren saks og tang og plassere dem i 2 Petri-retter (10 cm) fylt med 40 mL 1 x Barth løsning og antibiotika/antimycotic.
- Lagre ikke-dissosiert eggstokkene 2 uker i Barth løsning på 4 ° C.
- Dissosiasjon, kuttet eggstokkene med et rent barberblad i små brøker (1-2 cm3) og ruge dem i 50 mL av OR2 medium uten CaCl2 (OR2-noCaCl2) med 0,2% collagenase (Type I) på 17-19 ° C i en 100 mL spinner flasken med en langsom agitasjon for 4-5 h. Kontroller at den magnetiske baren er plassert ca 3-5 cm over bunnen av spinner kolbe å unngå knuse oocytes.
- Etter 4-5 h, kontrollerer du at de fleste av oocytes er frigjort fra sine hårsekken (dvs.de svømme rundt individuelt). Vask dem 5 x med 200 mL OR2 med 1,8 mM CaCl2.
- Overføre defolliculated oocytes Petri-retter (10 cm) fylt med Barth løsning og antibiotika/antimycotics og holde dem minst over natten ved 17 ° C før cDNA eller mRNA injeksjon.
- På den neste dagen, velger under en kikkert, en sunn oocyte presenterer en klar og tydelig dyr versus en vegetal stang (mørk brun til dyr pole versus lys gul for vegetal Polen). Bruk ren Pasteur Pipetter og kast oocytes en etter en i et sterilt konisk 96-injeksjon godt plate.
Merk: Ingen spesiell behandling er nødvendig i plasseringen av oocytes for mRNA injeksjoner; mens cDNA injeksjoner, er det uunnværlig å orientere oocytes med dyr Polen vendt oppover.
- mRNA eller cDNA automatisk injeksjon
- Syntetisere mRNAs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit følge anbefalte instruksjonene. Rengjør instrumenter og tabellen med RNase og bruk riktig beskytte hanskene.
Merk: Kvaliteten på mRNA er Determinanten til en godt uttrykk, og det er nødvendig å hindre mRNA nedbrytning under innsetting prosedyren. - Utarbeide cDNAs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig utstyr og oppløse ønsket mengde i bidistilled vann i en konsentrasjon av 0,2 µg/µL.
- Injisere 10-50 nL mRNA løsning i en konsentrasjon av 0,2 µg/µL eller 10 nL cDNA løsning på en konsentrasjon varierer fra 0,02-0,2 µg/µL, fortrinnsvis i porsjoner med 95 oocytes.
- Membran proteiner som krever flere underenheter (dvs., heteromeric α1β2γ2 GABAA reseptorer) blande den tilsvarende mRNAs eller cDNAs i ønsket forholdet (dvs.1:1:1 eller 1:10:1).
- Holde oocyte på 17 ° C å hindre uttrykk for varme sjokk proteiner ved oocytes; Lagre i microplate i et thermo-kontrollerte lagringsområde.
- Oppløse test forbindelsene testet positivt i bindende analysen i OR2 på 0,1-1000 µM elektrofysiologiske opptak og kast dem av i en 96-brønns flat bunn polypropylen plate.
- Syntetisere mRNAs ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig kit følge anbefalte instruksjonene. Rengjør instrumenter og tabellen med RNase og bruk riktig beskytte hanskene.
- Plasmider for uttrykk
- Følg brukerhåndboken til kommersielt tilgjengelig kits for mRNA syntese med bakteriell T7 eller T6 promoterere og gjøre 20 µL av en løsning på 0,2 µg/µL i RNase-fritt vann.
- Forbered minst 20 µL av en løsning som inneholder en eukaryoter uttrykk vektor cDNA uttrykket, vanligvis på 0,2 µg/µL oppløst i bidistilled vann.
- Microinjection i Oocyte og visualisering av kvaliteten
- Injisere 10-50 nL løsningen inneholder plasmider (se trinn 2.3.1 eller 2.3.2) bruker en glass mikro-injeksjon nål tips diameter alt opptil 100 µm montert på en micromanipulator utstyrt med press utstøting systemet eller en automatisert innsprøytningssystem.
Merk: I eksemplet diskutert her oocytes er injisert av grupper av 95 med et automatisert system egnet for bruk med cDNA eller mRNA. - Fyll injeksjon nålen med 1 µL av et fargestoff som methylene blåfarge på 1% og injisere oocytes bruker standard prosedyre (enten i kjernen for cDNA eller i cytoplasma for mRNA).
- Kast de injiserte oocytes i ca 1 min i kokende vann. Halvert i oocytes med et barberblad under en kikkert.
Merk: Fargestoff forblir lokaliserte som vist i Figur 3E, slik at en presis observasjon av injeksjon.
- Injisere 10-50 nL løsningen inneholder plasmider (se trinn 2.3.1 eller 2.3.2) bruker en glass mikro-injeksjon nål tips diameter alt opptil 100 µm montert på en micromanipulator utstyrt med press utstøting systemet eller en automatisert innsprøytningssystem.
- To elektrode spenning klemme opptak
- Plass den godt platen inneholder oocytes på automatiserte system, som bruker prinsippet illustrert i Figur 4.
Merk: I motsetning til oppdateringen klemme systemet illustrert i figur 5, sant membran potensialet i cellen blir lest av spenning elektroden. - Programmet automatisert opptak systemet med ikon-basert grensesnitt, for eksempel ordningen illustrert i figur 6 for fastsettelse av konsentrasjon aktivitet forholdet.
- Plass den godt platen inneholder oocytes på automatiserte system, som bruker prinsippet illustrert i Figur 4.
- Montering kurve
- Analysere resultatene med riktig programvare, bruke illustrert konsentrasjon aktivisering kurven, plot gjeldende amplituden som en funksjon av logaritmen av Agonistiske konsentrasjonen.
- Observere sigmoidal kurven som senere kan utstyres med empirisk Hill ligningen i skjemaet:
her
Y= brøkdel av evoked gjeldende,
EC 50 = konsentrasjonen for en 50% aktivisering,
x = konsentrasjonen av sammensatt,
nH = Hill koeffisient eller åpenbar cooperativity. - Normalisere strøm til en enhet ved å dele amplituden til hvert svar kontra verdien registreres på den høyeste konsentrasjonen analysere dataene fra en rekke celler.
- Finne gjennomsnitt og standardfeil og innser montering kurve ved hjelp av elever med en standard tilgjengelig programvare.
3. elektrofysiologiske opptak i hjernen skiver
Merk: Hippocampus rotte skiver er utarbeidet i henhold til nasjonale og institu veiledning.
-
Utarbeidelse av hippocampus skiver
- Forberede den disseksjon kunstig cerebro-spinalvæske (dACSF) med 124 mM NaCl 124, 2,5 KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 CaCl2 2t2O, 26 mM NaHCO3, 10 mM glukose og 4 mM sukrose gasset i flasken med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.
- Forberede den opptak kunstig cerebro-spinalvæske (rACSF) med 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H2O, 2,5 CaCl2 2t2O, 25 mM NaHCO3og 10 mM glukose gasset i flasken med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.
- Bedøve rotter bruker en blanding av 2,5% isoflurane og ren oksygen og halshugge dem.
- Kutt i hodebunnen etter midtlinjen med en fin saks. Kuttet skallen langs midtlinjen uten å skade den underliggende vev. Fjerne skallen med pinsett og bruke en fin slikkepott til å øse ut hjernen.
- Plasser hjernen i gasset dACSF løsningen på RT og dissekere venstre hippocampus dannelse med en fin slikkepott.
- Skiver tverrgående (400 µm tykk) fra middels del av hippocampus med en vev helikopter og overføre dem til opptak kammeret med bruk av en maling pensel. Opprettholde skiver på RT i 45 minutter.
- Perfuse skivene med gasset rACSF på 35 ° C og med en sats på 1,5 mL/min. boble løsningen med en blanding av 95% O2 og 5% CO2.
Merk: Etter dette trinnet sektorene er klar for elektrofysiologiske eksperimenter.
-
Enkelt befolkningen spike opptak
- Plass en hjerne skive i mikroskop-montert kammeret.
- Perfuse skive med en hastighet på 3 mL/min med rACSF.
- Dra Borosilikatglass brønnene med Pipetter puller har en motstand av ~ 2 MΩ.
Merk: Denne brønnene som en innspilling elektrode og er elektrisk koblet til forsterkeren. - Fyll i brønnene med en løsning som inneholder 2 M NaCl og plasser den i pipette innehaver av forsterkeren.
- Plasser opptak brønnene i stratum pyramidale i regionen CA1 på hippocampus sektoren med den høyre micromanipulator.
Merk: Hvor er skjematisk representert i figur 7. - Plasser en isolert bipolar platinum/iridium elektrode i holderen på den venstre micromanipulator.
Merk: Denne elektrode brukes som stimulering elektroden og er elektrisk koblet til stimulans generatoren. - Plasser elektroden stimulering i Schaffer collaterals i regionen CA1 på hippocampus sektoren med den høyre micromanipulator.
Merk: Hvor er skjematisk representert i figur 7. - Levere en aktuell puls til stimulering elektroden ved hjelp av stimulans generator hver 30 s (100 µs varigheter, start ved 10 µA) og gradvis øke stimulering styrken til en befolkning (PS) vises.
- Justere stimulans styrke til å fremkalle en PS tilsvarende 45% av maksimal amplituden som kan oppnås. PSs er filtrert på 2,4 KHz og digitalisert på 20 KHz bruker signalforsterkeren.
-
Sammen-puls hemming
- Forberede hjernen skiver (trinn 3.1) og fortsett som beskrevet tidligere (trinn 3.2.1–3.2.7).
- Levere to nåværende pulser (100 µs varighet med 20 ms intervaller) til stimulering elektroden hver 30 s ved hjelp av stimulans generator. Angi stimulans styrke til å fremkalle en PS tilsvarende 45% av maksimal amplituden.
-
Sammensatte testing
- Gjøre fortynninger av forbindelser skal testes i gasset ACSF slik at den endelige konsentrasjonen av DMSO ikke høyere enn 0,1%.
- Legge til DMSO kontrolløsning på samme konsentrasjonen enn i sammensatte løsningen.
- Registrere en enkelt (trinn 3.2) eller en sammenkoblet-puls (trinn 3.3) PS fremkalt av Schaffer sivile stimulations hver 30 s i minst 30 min. PS figuren skal være stabil i denne planlagte periode.
- Klargjør et beaker med gasset rACSF som inneholder en fast konsentrasjon av sammensatt skal testes.
- Perfuse hippocampus sektoren med denne løsningen mens de fortsatt registrering enkle eller sammenkoblet-puls PS.
- Vurdere utvinning sammensatte effekten av perfusing i sektoren med gasset rACSF uten sammensatte.
Merk: For reversibel effekter, PS tilbakestilles til sin opprinnelige form observert i planlagte perioden før programmet sammensatte.
-
Dataanalyse
- Gjennomsnittlig PS sporene innspilt under eksperimentet i blokker med 4 med data analyseprogramvare.
- Måle PS amplituder av gjennomsnitt sporene.
- Normalisere amplituder i prosent av de opprinnelige verdiene registrert 10 min før perfusing en sammensatt.
- Uttrykke dataene som mener ± SEM.
Representative Results
Binde:
I vitro analysen med cellemembraner brukes til å identifisere selektiv menneskelige GABAA α5β3γ2 reseptor ligander bindende ved BZD allosteric stedet for γ2 inneholder reseptorer. Transiently transfekterte HEK293 celler uttrykke den menneskelige GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 og α3β3γ2 reseptorer brukes til å forberede membraner for denne analysen. Effekten av de potensielle ligander oppdages ved å måle scintillation av [3H] flumazenil bundet til membran reseptorer (en hemming av [3H] flumazenil binding). Forskyvning bindende kurver genereres for å vurdere selektivitet av forbindelser for en bestemt GABAA reseptor eksemplet med RO4938581 (Figur 8). Figur 9 oppsummerer profilen til flere referanse forbindelser inkludert α5 selektiv GABAA reseptor negative allosteric modulator, RO49385819, som ble generert ved hjelp av bindende analysen.
Opptakene i Xenopus oocytes:
Uttrykket av GABAA reseptorer som α5β3γ2 heteromer gir robust strøm svar til GABA eksponering. Typisk spenning klemme opptak innhentet i en oocyte uttrykke den menneskelige α5β3γ2 svar kort GABA pulser (30 s) alt opptil 300 µM er vist i figur 6. I dette eksperimentet, i ulike konsentrasjoner av GABA var innstilt i 96-brønnen platen og svarene ble vekket ved å flytte cellen i en bestemt godt. GABA var grundig vasket ved retur cellen til sentrale perfusjon chamber og bruke en perfusjon av kontrolløsning ved å aktivere tilsvarende peristaltiske pumpen. Programmet rekkefølgen brukes til fastsettelse av konsentrasjon aktivisering kurven er illustrert i figur 6en. Gjennomført fullstendig automatisk, disse dataene illustrerer både kvaliteten på opptakene som kan oppnås i Xenopus oocytes og høy reseptor uttrykk innhentet noen dager etter mRNA injeksjon. Eksperimentene, gjennomført på forskjellige reseptor kombinasjoner, gi en rekke EF50s, som er konsentrasjonen av GABA nødvendig å aktivere halvparten av reseptorer. En tomt EF50verdier på en edderkopp diagram, gir som illustrert i Figur 10, en rask sammenligning av egenskapene reseptor og påvirkning av delenhet sammensetningen.
For å undersøke effekten av en negativ eller positiv allosteric modulator (NAM eller PAM), er det nødvendig å sammenligne svaret fremkalt av en Agonistiske (GABA) test puls, først i kontrollen, og deretter i nærvær av modulator. En effektiv eksperimentelle protokoll å gjennomføre slikt eksperiment er illustrert i Figur 11. Responsen av cellen en referanse konsentrasjon av GABA bestemmes først og sekvensen gjentas ved å bruke den samme GABA-konsentrasjonen og deretter en co-anvendelse av GABA pluss modulator. Et plott av to lagt svar avslører i dette eksemplet en markert hemming skyldes tilstedeværelse av modulator. En kvantifisering av modulator effekten oppnås lett ved forholdet mellom svaret utløste i nærvær av modulator versus kontroll og resultatene kan tegnes i form av en varme plott. Dataene i Figur 12 illustrerer varme tomten tilsvarer opptakene av tre datasett innhentet for 96 forbindelser.
Etter identifikasjon av forbindelser som er tilstrekkelig aktive, er det ofte uunnværlig å vurdere om disse molekylene er aktive på andre reseptor kombinasjoner. Ved GABAA reseptoren, 19 gener som koder for forskjellige underenheter har blitt identifisert, og det er kjent at en funksjonell reseptor skyldes en multimeric samling av ulike underenheter (se Knoflach, Hernandez og Bertrand10 for en gjennomgang). Selv om flere kombinasjoner og underenheter avkastningen et stort repertoar reseptoren subtypes som krever en rekke counter screening utføres, er det ofte mulig å fokusere først på den mest tallrike undertype som i tilfelle av GABAA reseptorer, er α1β2γ2 sammensetningen. Eksperimenter utført hode til hode med uttrykk for, for eksempel α5β3γ2 og α1β2γ2 i den samme gruppen av oocyte gi en god sammenligning av de respektive effektene av et bestemt molekyl. Typisk resultatene i tre celler for α5β3γ2 og α1β2γ2 er vist i figur 13, som illustrerer fortrinnsrett positive modulering av ett molekyl på α5β3γ2.
Eksperimentell protokollen illustrert i Figur 11 er godt egnet for karakterisering av en PAM aktivitet. I denne protokollen er sammensatte som er testet co anvendt med Agonistiske på gradvis økende konsentrasjoner. For å unngå mulig kumulative effekten forårsaket av flere programmer på den samme cellen, måles en ny og naiv celle for hvert datapunkt. Et mål for amplituden til svaret innspilt med Agonistiske alene og deretter under sammensatte programmet gir et forhold som quantifies PAM eller NAM effekten. Typiske resultater oppnådd ved α1β2γ2 og α5β3γ2 for diazepam er vist i figur 14, avsløre en tilsynelatende følsomheten til α5β3γ2 som er ca 10-fold høyere på denne reseptoren kombinasjonen. Disse verdiene er godt sammen med publiserte data11. Som det er tenkt at webområdet benzodiazepiner er konstituert av grensesnittet mellom γ2 og dets tilstøtende α delenhet12-14, tyder følsomheten til α5β3γ2 en fortrinnsrett diazepam affinitet for γ2-α5 over γ2-α1. Muligheten til å uttrykke forskjellige reseptor kombinasjoner kombinert med en effektiv funksjonell karakteristikk åpner flere måter å utforske determinanter av PAM egenskapene og deres konsekvens for fysiologiske og farmakologiske effekter.
Hippocampus hjernen skiver:
Eksperimenter med rotte hippocampus hjernen skiver utføres for å validere farmakologiske profilen av forbindelser i i vitro analyser i en innfødt reseptor-modell. Dominerende GABAA reseptor subtyper uttrykt i pyramideformet cellene i hippocampus er α1β2/3γ2, α2β2/3γ2 og α5β2/3γ2, som er alle modulert av benzodiazepiner (BDZs)15. Sammen-puls hemming er et paradigme som kan avsløre hippocampus krets excitability av testing endringen i svaret av andre av to sammenkoblede elektrisk stimuli levert 20 ms fra hverandre. Endring av det andre svaret er GABAergic tilbakemeldinger av interneurons innervating pyramideformet celle lag16-18. Som vist i figur 7i kontroll situasjonen, er det andre svaret to sammenkoblede stimuli hemmet på grunn av en GABAergic hemming. Når denne hemming reduseres perfusing skive med β-CCM, er en ikke-selektive NAM, det andre svaret av to sammenkoblede stimuli hemmet i mye mindre grad. Dette eksperimentelle paradigmet er følsom for forbindelser selektive for en GABAA reseptor som inneholder α5 delenhet.
Figur 1 : Screening strategi. En typisk narkotikarelaterte screening veien begynner med høy gjennomstrømming screening der store biblioteker av forbindelser er vist for et bestemt mål. Etter identifikasjon av bly kandidaten begynner arbeidet med medisinsk kjemi. I denne fasen kjemikere studere og avgrense molekylene ved å utføre en strukturell endring for å møte de ønskede kriteriene, for eksempel mål selektivitet, hjernen penetrance, stabilitet, degradering etc. i denne avgjørende fasen er det viktig vurdere om kjemisk endringene ikke endret egenskapene molekylet og avgrense for den beste kandidaten. Følgende trinn er å identifisere noen lovende forbindelser og bringe dem til de neste trinnene inkluderer sikkerhet, toleranse, etc. Merk at elektrofysiologi angis som den funksjonelle analysen men som andre metoder, inkludert kalsium fluorescens analyser eller spenning følsom fargestoffer, kan brukes som alternativer. Disse sistnevnte metodene brukes også i høy gjennomstrømming analyser som en erstatning for bindingen analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Utformingen av en 96-brønns belagt benyttes for bindende eksperimenter. Kolonne 1 brukes til totalt bindende målinger og kolonne 2 for uspesifisert bindende målinger. Rader A-H er fylt med 4 forskjellige forbindelser i økende konsentrasjoner (kolonner 3-12), hver sammensatte i duplikater (dvs. sammensatte 1 i rader A og E, sammensatte 2 i rader B og F, etc.) i layout med forskjellige farger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Microinjection med et automatisert system. (A) A nøyaktig XYZ system, der en glass injeksjon nål fylt med væske som inneholder plasmider av interesse, er automatisk stakk inn på oocytes. (B) dette panelet viser konisk 96-brønns Bunn platen i hvilke (C) i oocytes er automatisk injisert. (D) dette panelet illustrerer injeksjon prinsippet. Injeksjonsvæske kjernefysisk trenger p oocyte litt dypere enn kjernen, som er vist i panelet B. Deretter nålen er trukket fra kjernen (se panelet C) før injeksjon (se panelet D). (E) til å vurdere kvaliteten på injeksjon, nålen kan bli fylt med en farge og "kokt" oocytes kan bli halvert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Automatisert to spenning-klemme elektrode prinsippet. Prinsippet er basert på flytter utarbeidelse mellom brønner i stedet for å bruke flytende inne perfusjonen. (A) venstre side av panelet representerer ordningen slik at opptaket i en Xenopus oocyte med de to elektrodene og små kurven som opprettholder en flytende dråpe rundt utarbeidelsen i bevegelse fra ett utvalg til en annen. Et bilde av oocyte plassert i kurven med de to elektrodene vises på høyre side. (B) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av det "opp ned" elektrofysiologi opptak prinsippet. (C) dette panelet viser disponeringen av oocyte, sammensatt plate og vaske stasjon i tabellen opptak. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : To elektrode spenning klemme opptak versus oppdateringen klemme. En typisk to elektrode spenning klemme opptak for oocytes (venstre panel) sammenlignet med oppdateringen klemme konfigurasjonen brukes for en celle linje (høyre panel). Merk forskjellen i størrelse mellom oocytes som er ca 1 mm i diameter versus cellene som er rundt 20 µm. I to elektrode spenning klemmen, membran potensialet i oocyte sammenlignes ønsket beholdning spenning og signal forskjellen injiseres i gjeldende elektroden. I en patch klemme innspilling antas det at motstanden av oppdateringen klemme elektroden er ubetydelig versus membran motstand, og derfor at spenningen pålagt av forsterkeren er trofast matet til cellemembranen19. Bildet illustrerer en flytende filament perfusjon som to kanaler for en theta tube () er fylt med, på den ene siden, en kontrolløsning og, derimot, løsningen som inneholder stoffet20,21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Konsentrasjon aktivisering forhold til menneskelig α5β3γ2 reseptorene. (A) sekvensen kontrollere det automatiserte systemet består av en rekke ikoner og angir eksperimentelle protokollen for fastsettelse av konsentrasjon aktivisering forholdet. I trinn 1-3, som vist i dette panelet, laster systemet oocyte fra platen i måler kurven. Lekkasjen gjeldende måles i trinn 2, og bør denne verdien overskrider de ønskede kriteriene, cellen endres automatisk (trinn 3). Etter en stabilisering periode (trinn 4) er en referanse GABA-konsentrasjon oocyte svaret målt (trinn 5-8). Oocytes viser strømmer større enn 1 µA holdes for etterfølgende måling. I trinn 11-13, cellen blir utfordret av ulike konsentrasjoner av GABAA og prosessen gjentas seg for ønsket antall konsentrasjoner (trinn 14) og celler (trinn 15). (B) dette panelet viser typisk strøm fremkalt av en rekke kort GABA programmer (30 s) brukes i økende rekkefølge. Tidspunktet for sammensatte programmet angis av barer. (C) en tomt på toppen innover gjeldende som en funksjon av logaritmen av GABA-konsentrasjon gir konsentrasjon aktivisering kurven som er lett utstyrt av empirisk Hill ligningen, med en kontinuerlig kurve, en EF50 på ca 11 µM og en høyde koeffisient 1.3. Strøm i 8 celler var normalisert til en enhet for maksimal evoked respons. Stolpene angir standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Β-CCM, en GABAA NAM reduserer sammen-puls hemming i hippocampus skiver. (A) dette panelet viser en skjematisk fremstilling av en rotte hippocampus skive. Schaffer materiell (Sch C) som stammer fra CA3 pyramideformet celle axons prosjektet på de dendrittiske arborization av CA1 pyramidale nevroner. Mikropipetter ble plassert i stratum pyramidale (str pyramidale) registrere befolkningen toppene (PS) og stratum radiatum (str radiatum) dendrittiske opptak av feltet eksitatoriske postsynaptic potensialer (epsp). Stimulering elektroden ble plassert i Schaffer materiell. (B) dette panelet viser PSs fremkalt av sammenkoblede stimuli brukt gjennom samme stimulerende elektroden med 20 ms intervaller. Befolkningen svaret i andre stimulans (PS2) er mindre amplituden enn svaret første stimulans (PS1). (C) PSs ble registrert i fravær (svart bar) og tilstedeværelsen av β-CCM, en ikke-selektive GABAA reseptor NAM (grønne linjen). Β-CCM forbedret amplituden til andre PS2 med delvis blokkerer noen feed-forward GABAergic hemming. Stolpene angir standard feil av gjsnitt og *** at data er svært viktig med en p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: typisk bindende resultatene i en konkurransedyktig (hemming eller forskyvning) analysen. Forskyvning bindende kurver genereres fra som IC50 og Ki kan bestemmes. IC50 er konsentrasjonen av en konkurrerende ligand som fortrenger 50% av bestemte binding av radioligand og Ki (hemming konstanten for et stoff) er konsentrasjonen av en konkurrerende ligand som ville okkupere 50% av reseptorer hvis ingen radioligand var tilstede. Ki beregnes fra IC50 hjelp av Cheng-Prusoff ligning:
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Konkurransedyktige forskyvning binding ble utført med ligander bindende på store GABAA reseptor subtyper. Slektskap (nM) ble målt ved hjelp av en [3H] flumazenil-bindende analysen og membraner fra HEK293 celler transfekterte transiently med ulike menneskelige GABAA reseptor delenhet kombinasjoner. Histogrammet representasjon tydelig illustrerer differensial følsomheten observert i den sammensatte RO493851 med lavest Ki på α5β3γ2 reseptorene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Differensiell GABA følsomhet av reseptorer. En tomt reseptoren GABA EF50 på spider tomten og en representasjon av antatte delenhet sammensetningen gir effektive måter å sammenligne rollen annerledes underenheter. Merk at innføringen av γ2 underenheter er forbundet med en reduksjon i følsomheten reseptor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 : Leting effekten av en modulator. (A) dette panelet viser ikonet sekvensen brukt for å kontrollere det automatiserte systemet. Merk at de to (A/D) ikonene tilsvarer innspillingen i kontrollen (grønn) og under modulator eksponering (rød). (B) dette panelet viser typisk strøm i en celle uttrykke GABAA reseptoren under slike en sekvens. For å evaluere effekten av en modulator, ble en rekke måle første svaret fremkalt av eksponering for en fast konsentrasjon av GABA (grønn trace), etterfulgt av eksponeringen først til GABA og deretter til GABA pluss modulator (rød trace), utført. Posisjonering trådkors pekere (cyan og blå) skiller målinger, og blå kors angir den maksimale forskjellen mellom de to opptak forholdene. Forholdet mellom betingelsen kontroll og modulator beregnes automatisk i analyseprogramvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 12 : Varme med tre gjentak tomt. Dette panelet viser en varme tomt tilsvarer tre gjentak modulator effekter innhentet for 96 forbindelser på menneskelige α5β3γ2 GABAA receptors. Prosenter av testen svar over kontrollen varierer mellom 0,5 og 1.2 ble ansett som ikke vesentlig forskjellig fra kontrollen og representeres av en grønn prikk. Ratio under 0,5 ble ansett som en hemmende effekt og vises som blå prikker. Prosenter over 1.2 ble ansett som styrke svaret og representeres av røde prikker. Merk likhet mønster mellom tre uavhengige opptakene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 13 : Counter screening ved α1β2γ2. (A) dette panelet viser en representasjon av antatte delenhet organisasjon. Følgende paneler show (B-D) en evaluering av virkningene av en positiv allosteric modulator på menneskelig α5β3γ2 og (F-H) på α1β2γ2, ved hjelp av sammenlignbare konsentrasjoner av GABA og lignende konsentrasjoner (100 µM) av den modulator, som markere spesifisiteten av sammensatt testet i disse eksperimentene. (E) dette panelet viser også en representasjon av antatte delenhet organisasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 14 : PAM følsomhet og reseptor komposisjon. Fastsettelse av virkningene av en rekke konsentrasjoner av diazepam effekter (A-D) på α1β2γ2 og (E-H) α5β3γ2 reseptorer avslører nesten en 10 ganger forskjell i tilsynelatende affinitet. Merk også påvirkning av delenhet sammensetningen på svar time course med en raskere desensitization på α1β2γ2 reseptorer (se, for eksempel paneler D og H). Merk at som α1β2γ2 og α5β3γ2 reseptorer vise forskjellige interesseområder for GABA (se Figur 10), konsentrasjonen av Agonistiske ble justert mellom to receptors i mange sammenlignbare aktivisering. (I) dette panelet representerer et plott av fold økning i en gjeldende amplitude normalisert til enhet versus betingelsen kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 15 : Uttrykk plasmider inkludert T7 og CMV promotor. Disse skjermbildene viser plasmider for uttrykket i en Xenopus oocyte (øvre høyre panel) og i en celle linje. I nederste høyre panel illustrerer en typisk HEK-293 celle transfekterte med en plasmider som inneholder også genet for en grønn fluorescerende protein (GFP) med patch-klemme opptak elektroden. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Utviklingen av romanen forbindelser aktive på en ligand-gated ion kanal som GABAA receptors krever bruk av flere metoder. Vanligvis er første skritt ofte utført med bindende analyser; men er slike målinger utilstrekkelige for å karakterisere fysiologiske aktiviteten til sammensatt eller sin presise farmakologi. Spesielt en forbindelse som binder seg til en reseptor kan forbedre eller hemme funksjonen eller selv produsere ingen funksjonell effekt (være stille) (dvs., binder seg til reseptoren uten å endre dens funksjon). Dermed kreves en funksjonell test for full sammensatte karakteristikk.
Bindende analyser:
Den største fordelen med bindende analysen er at det kan bli effektivt gjennomført på en rekke prøver opp til flere tusen, og at det gir bindende slektskap for den aktive molekyler. Som beskrevet her, består det første trinnet for å etablere en metode for vurdering av ønsket reseptor subtyper. Nemlig, mens binding kan gjennomføres på innfødt reseptorer brøker eller hele hjernen, slik metode vil hindre fastsettelse av slektskap på bestemte reseptor undertyper. Det er derfor nødvendig å bruke rekombinant systemer til skjermen molekyler på ønsket målet. I dag, tilbyr en forbigående eller stabil transfection av ønsket reseptor delenhet cDNAs i cellelinjer en effektiv og pålitelig metode for å uttrykke reseptor subtyper av interesse (f.eks, GABAA α5β3γ2). Tradisjonelle bindende analyser gjør bruk av radioligands, men i dag teknikker er tilgjengelig som unngå ulempen ved håndtering av radioaktivitet (f.eks, kvantitativ fluorescens-baserte ligand-bindende).
Funksjonelle uttrykk i et vertssystem:
For å uttrykke genene i et vertssystem, må koding sekvensen rundt settes inn i en plasmider som inneholder de tilstrekkelig promoterere. Vanligvis for i vitro mRNA syntese brukes bakteriell T7 eller T6 promoterere. For en cDNA uttrykk, må transkripsjon av genet av interesse være regulert av en eukaryoter utbyggeren som CMV (cytomegalovirus) eller tilsvarende. I dag, er flere plasmider, inkludert de to promoterere (dvs., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA) tilgjengelig slik at enten en i vitro syntese av mRNA eller et cDNA uttrykk som vist i Figur 15. Et uttrykk av GABAA reseptorer kan fås trofast i cellelinjer eller i Xenopus oocytes. De viktigste fordelene med sistnevnte er mangelen på en endogen reseptor uttrykk, enkelheten av manipulasjoner og tilgjengeligheten av et automatisert system for mikro-injeksjoner og opptak. Fremgangsmåtene i denne protokollen illustrerer effektiviteten av automatiserte system som kan injeksjon av 96 oocytes i ca 7 minutter og krever ingen micromanipulation ferdigheter. Husker at en enkelt eggstokk fra en Xenopus inneholder mellom 10000-30000 oocytes, er det klart at mange celle målinger kan gjennomføres på en enkelt forberedelse. Videre, som et uttrykk kan gjennomføres bruke cDNA injeksjoner, samme plasmider inneholder gener av interesse som er utviklet for bindingen eksperimenter kan brukes for funksjonell karakteristikk uten behov for ytterligere molekylærbiologi manipulasjoner.
Gitt sin store størrelse og høy overflate uttrykk, gir en enkelt oocyte en rekke reseptorer som omtrent tilsvarer confluent cellene i 35 mm Petriskål. Men representerer en oocytes forberedelse og injeksjon en brøkdel av kostnaden for en celle linje, som eksperimenter ikke krever en bestemt kultur medium og sterile manipulasjoner. Aktivering av én GABAA kanal gir noen picoamperes (10-12) og strømmer alt i titalls microampere (10-6) er lett registreres i en enkelt oocyte, som bekrefter samtidig aktiviteten til flere millioner av reseptorer i et enkelt svar.
Et første skritt i karakterisering av ligand-gated ionekanaler er ofte fastsettelse av tilsynelatende affinitet av reseptorer. Eksperimenter som må gjennomføres består av å bruke en rekke kort Agonistiske test pulser og plotte amplituden til den vakte gjeldende eller, i enkelte tilfeller området under kurven (AUC) som en funksjon av logaritmen av Agonistiske konsentrasjonen. Som det er lett mulig å microinject ulike plasmider konsentrasjoner og forhold i den samme gruppen av oocytes, er denne uttrykket spesielt egnet for slike karakteristikk. Videre avslørte en parti til parti sammenligning en høy grad av stabilitet for ulike EF50s. Påvirkning av delenhet sammensetningen på reseptorens tilsynelatende affinitet er lett visualisert bruker en edderkopp tomten, som eksemplifisert i Figur 10.
Resultatene av to elektrode spenning klemmen innhentet i Xenopus oocytes er ofte sammenlignet med opptak gjort med oppdateringen klemme elektroder. Mens det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å gå inn i en detaljert sammenligning mellom disse to systemene, kan noen punkter undersøkes. Mens en patch klemme i celler tilbyr fordeler for Biofysiske karakteristikk med en rask medikament programmet, er dens krav mer komplekse enn to elektrode opptak i Xenopus oocytes. Et første og ikke-ubetydelig problemer er uttrykk for en gitt protein med nødvendigheten av en cellekultur, en forbigående eller stabil transfection og identifikasjon av celler som uttrykker den ønskede konstruere. I tillegg er det uunnværlig å undersøke mulige bidrag av endogene uttrykket i regnes cellen. Videre krever en patch klemme innspilling en dyktig person til å utføre micromanipulation under en høy forstørrelse mikroskop, mens vedkommende må også utføre en tilstrekkelig analyse under å vurdere, for eksempel kvaliteten på selen, tilgang motstanden etc. derimot en to-elektrode spenning klemme opptak, spesielt en ved hjelp av et automatisk elektrofysiologiske system, krever ikke noen spesielle ferdigheter og kan bli utført av laboratorium teknikere.
Da anskaffe en elektrofysiologiske oppsett, er pris vurdering sikkert en viktig faktor som må analyseres nøye. For eksempel, mens kostnaden for et automatisert system er relativt høy, avslører en nærmere sammenligning at installasjon av en fullstendig elektrofysiologiske rigg inkluderer kjøpe utstyr som god micromanipulators, en kikkert linse, en forsterker, en system, og en anti-vibrasjon tabell samtidig henter og utfører en analyse. En pris sammenligning mellom en to elektrode spenning klemme satt opp mot en patch klemme oppsett avslører ytterligere avvik. Videre er det automatiserte systemet tilbyr fordelen av fullt automatisert utstyr og kjører uovervåket dag og natt.
Farmakologiske egenskaper av et sammensatt bestemmes av modus for action på reseptoren. For eksempel er konkurrerende hemmere molekyler som kan angi samme binding lomme eller orthosteric området, som agonist selv forårsaker en konkurranse. Ikke-konkurrerende hemmere er forbindelser som hemmer receptors ved å kommunisere på et annet område og, i tilfellet en ligand-gated ion kanal, kan angi og blokkere ioniske pore, for eksempel. Det ville gå utenfor omfanget av dette arbeidet å undersøke ulike mekanismer for samhandling, men ytterligere informasjon kan fås fra en farmakologisk lærebok og/eller fra annet arbeid som Bertrand og Bertrand's22.
Ved allosteric modulatorer endrer de sammensatte binder på et område som er forskjellig fra orthosteric området, men tilstedeværelsen av molekylet energien barrieren mellom aktive og andre statene. Positiv allosteric modulatorer (PAMs) er forbindelser som reduserer energien barrieren fra hvile til aktiv tilstand, og derfor forsterke effekten av Agonistiske. Betegner mulig PAM effekter, er det derfor nødvendig for å fastslå om en eksponering til sammensatt forbedrer svaret Agonistiske og hvis så, på hvilke konsentrasjon. Eksperimenter i Figur 11 og figur 14 illustrerer protokoller som kan brukes med hell for karakterisering av PAMs på GABAA receptors.
I noen tilfeller kan eksponering til PAM alene være nok å aktivere receptors. Slik aktivitet kan bestemmes av en liten endring av eksperimentelle protokollen presenteres her. Nemlig, i stedet for en co-anvendelse av modulator under eksponeringen av GABA, protokollen kan endres for anvendelse av første sammensatte alene og i nærvær av GABA. Karakteristikk av direkte Agonistiske aktiviteten vil bli gjort ved fastsettelse av amplituden til svaret fremkalt av sammensatt selv og i forhold til gjeldende GABA-fremkalt.
Eksperimenter utført i hjernen skiver, som illustrert i figur 7brukes til å bekrefte sammensatte aktiviteten på innfødt reseptorer i en bestemt hemmende krets før du går videre i dyremodeller og langs veien mot kliniske studier. Relativt enkle data innspillingen og analyse protokollen tillater at rangeringen av flere forbindelser ved å evaluere deres differensial modulatory effekt på PS amplitude. Non-spesifikke effekter av forbindelser som ikke er relatert til GABA systemet kan også være oppdaget (f.eksnår endringer i PS figuren er observert). Direkte, GABAergic neurotransmission kan vurderes i disse tilfellene ved å måle effekten av forbindelser på hemmende postsynaptic strøm (IPSCs) bruker hele-celle oppdateringen klemme teknikk8.
Disclosures
Forfatterne Frédéric Knoflach og Maria-Clemencia Hernandez er ansatte i F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel i Sveits et farmasøytisk selskap. Forfatteren Daniel Bertrand er ansatt i HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Geneve, Sveits, gir screening fasiliteter til farmasøytiske selskaper.
Acknowledgments
Forfatterne takker Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, og Marie Claire Pflimlin fra Roche og Tifany Schaer og Deborah Paolucci fra HiQScreen for deres utmerket kundestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General equipment | |||
| 96 well cell harvester -(Filtermate 196) | Packard | To filter membranes with bound radioligand | |
| Microtiter plate liquid scintillation counter (Top Count NXT) | Packard | Microplate Scintillation and Luminescence counter | |
| Vial liquid scintillation counter (Beta-Couter 2500 TR) | Packard | Vial Scintillation and Luminescence counter | |
| Liquid handler (Biomek 2000) | Beckman coulter | To prepare compound dilutions | |
| Vortex (Vortex Genie 2) | Scientific industries Inc. | To mix compound stock solutions | |
| Tissue homogenizer (Polytron PT1200E) | Kinematica AG | To resuspend the membrane preparations | |
| XLfit5 software | Microsoft Excel add-on by IDBS |
Curve fitting software | |
| Smart Pull | UniPix | - | Electrode Puller |
| RoboInject | MultiChannel Systems | - | Automated Injection (Xenopus Oocytes) |
| HiClamp | MultiChannel Systems | - | Automated Voltage Clamp (Xenopus Ooocytes) |
| DataMining | MultiChannel Systems | - | Data Analysis Software |
| DataMerger | MultiChannel Systems | - | Data Processing Software |
| Digidata 1550 | Molecular Devices | Low noise data acquisition system | |
| CyberAmp 380 or equivalent | Axon Instruments | Programmable Signal Conditioner | |
| pClamp program suite | Molecular Devices | Software for data acquisition and analysis software | |
| Antivibraton table | TMC | To avoid microelectrode vibrations | |
| Patchstar Micromanipulators | Scientifica | To accurately position microelectrodes in brain slices | |
| Faraday Cage | Sutter Instruments | To isolate recordings from noise | |
| McIlwain Tissue Chopper | Campden Instruments LTD | To prepare brain slices | |
| Borosilicate glass micropipette | Warner Instruments | GC150TF-10 | To record extracellular potentials in brain slices |
| Twisted pair, platinum iridium wires stimulation electrode | World Precision Instruments | To stimulate the brain slices with current | |
| Stimulus generator for current and voltage driven stimulation | MultiChannel Systems | STG4000 | Delivers the current to the stimulation electrode |
| Plasticware | |||
| Microtiter plate round bottom | Corning | #3365 | Used for the binding assay |
| GF/C glassfibre filter-bottom 96-well microplate with 1.2 µm poresize, for cell harvesting assays using a vacuum manifoldwell filter | Packard | #6005174 | used for the binding assay |
| 50 mL Tubes | Falcon | #352070 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 1.5 mL | Eppendorf | #0030 120086 | used for the binding assay |
| Safe-lock tubes 2 mL | Eppendorf | #0030 120094 | used for the binding assay |
| Shipping tubes 180 mL | Semadeni Europe AG | #3722 | used for the binding assay |
| Pony vial Polyethylene 6 mL | Perkin Elmer | #6013329 | used for the binding assay |
| Top Seal | Perkin Elmer | #60051859 | used for the binding assay |
| Spinner Flask | Bellco | BELLCO # 1965-00100 | Spinner Flask |
| 96 Well Plate (Conical) | Thermo Scientific Milian | 56368 | Injection plate for the oocytes |
| 96 Well Plate (Flat bottom) | Corning (Vitaris Switzerland) | 3364-cor | Compound Plate for the HiClamp |
| Glass capillary | Hilgenberg (Germany) | - | borosilicate glass 1.2 O.D. 0.76 I.D. with filament |
| RNA preparation | |||
| Ambion mMessage mMachine | Thermo Fisher Scientific | for the in vitro synthesis | |
| Chemicals | |||
| Assay buffer: KCl 5 mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM pH adjust with HCl to 7.4; store up to 3 months at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Washing buffer: Tris 50 mM -HCl pH 7.4; store at 4 °C. | Used for binding assay | ||
| Stock solution of test compounds 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Flumazenil (RO0151788) 10 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| Diazepam 4 mM in DMSO | Used for binding assay | ||
| [3H]-Flumazenil 60-85 Ci/mmol in Ethanol; store at -20 °C | Used for binding assay | ||
| Microscint 40 | Packard | #6013641 | Used for binding assay |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | #6013329 | Used for binding assay |
| MS-222 | Sigma | Sigma # A5040 | MS-222 |
| AB/AM | Sigma | Sigma # A5955 | antibiotics / antimycotics |
| Collagenase | Sigma | Sigma # C1030 | Collagenase Type I |
| Rnase | Sigma | Sigma # R2020-250 mL | RNaseZAP |
| EndoFree Plasmid maxi Kit | Qiagen | Qiagen # 12362 | |
| Salts for artificial cerebrospinal fluid (NaCl, KCl, etc.) | Sigma | ||
| Membranes | |||
| Frozen membrane preparations from transient or stably transfected HEK293 overexpressing different human GABAA receptor subtypes: α1β3γ2, α2β3γ2, α3β3γ2, α5β3γ2. See Ballard et al. 2009 for detailed methods. | Used for binding assay |
References
- Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 685-697 (2011).
- Sieghart, W. Structure and pharmacology of g-aminobutyric acidA receptor subtypes. Pharmacological Reviews. 47, 181-234 (1995).
- Liu, J., et al. A high-throughput functional assay for characterization of g-aminobutyric acidA channel modulators using cryopreserved transiently transfected cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 781-786 (2008).
- Mennerick, S., et al. Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function. Journal of Neuroscience. 30, 2871-2879 (2010).
- Hevers, W., Luddens, H. The diversity of GABAA receptors. Pharmacological and electrophysiological properties of GABAA channel subtypes. Molecular Neurobiology. 18, 35-86 (1998).
- Macdonald, R. L., Olsen, R. W. GABAA receptor channels. Annual Review of Neuroscience. 17, 569-602 (1994).
- Kemp, J. A., Marshall, G. R., Wong, E. H., Woodruff, G. N. The affinities, potencies and efficacies of some benzodiazepine-receptor agonists, antagonists and inverse-agonists at rat hippocampal GABAA-receptors. British Journal of Pharmacology. 91, 601-608 (1987).
- Prenosil, G. A., et al. Specific subtypes of GABAA receptors mediate phasic and tonic forms of inhibition in hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 96, 846-857 (2006).
- Ballard, T. M., et al. RO4938581, a novel cognitive enhancer acting at GABAA a5 subunit-containing receptors. Psychopharmacology. 202, 207-223 (2009).
- Knoflach, F., Hernandez, M. C., Bertrand, D. GABAA receptor-mediated neurotransmission: Not so simple after all. Biochemical Pharmacology. 115, 10-17 (2016).
- Gielen, M. C., Lumb, M. J., Smart, T. G. Benzodiazepines modulate GABAA receptors by regulating the preactivation step after GABA binding. Journal of Neuroscience. 32, 5707-5715 (2012).
- Bergmann, R., Kongsbak, K., Sorensen, P. L., Sander, T., Balle, T. A unified model of the GABAA receptor comprising agonist and benzodiazepine binding sites. PLoS One. 8, 52323 (2013).
- Richter, L., et al. Diazepam-bound GABAA receptor models identify new benzodiazepine binding-site ligands. Nature Chemical Biology. 8, 455-464 (2012).
- Rudolph, U., Crestani, F., Mohler, H. GABAA receptor subtypes: dissecting their pharmacological functions. Trends in Pharmacological Sciences. 22, 188-194 (2001).
- Wisden, W., Seeburg, P. H. GABAA receptor channels: from subunits to functional entities. Current Opinion in Neurobiology. 2, 263-269 (1992).
- Davies, C. H., Davies, S. N., Collingridge, G. L. Paired-pulse depression of monosynaptic GABA-mediated inhibitory postsynaptic responses in rat hippocampus. The Journal of Physiology. 424, 513-531 (1990).
- Karnup, S., Stelzer, A. Temporal overlap of excitatory and inhibitory afferent input in guinea-pig CA1 pyramidal cells. The Journal of Physiology. 516, Pt 2 485-504 (1999).
- Turner, D. A. Feed-forward inhibitory potentials and excitatory interactions in guinea-pig hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 422, 333-350 (1990).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. 391, 85-100 (1981).
- Adelsberger, H., Brunswieck, S., Dudel, J. Block by picrotoxin of a GABAergic chloride channel expressed on crayfish muscle after axotomy. European Journal of Neuroscience. 10, 179-187 (1998).
- Hapfelmeier, G., et al. Isoflurane slows inactivation kinetics of rat recombinant a1b2g2L GABAA receptors: enhancement of GABAergic transmission despite an open-channel block. Neuroscience Letters. 307, 97-100 (2001).
- Bertrand, S., Bertrand, D. Overview of electrophysiological characterization of neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 11, Unit11 17 (2004).
