Summary
Este papel describe un protocolo detallado y muy eficaz para las grabaciones de solo sensillum de la basiconica sensilla en los palpos de partes bucales de insectos.
Abstract
Los palpos de piezas bucales de la langosta se consideran órganos gustativos convencionales que juegan un papel importante en la selección de alimentos de una langosta, especialmente para la detección de señales químicas no volátil por sensilla chaetica (anteriormente llamado terminal sensilla o sensillo crested). Hay creciente evidencia de que estos palpos tienen también una función olfatoria. Un receptor odorante (LmigOR2) y una proteína odorante (LmigOBP1) han sido localizados en las neuronas y células de accesorio, respectivamente, en el basiconica sensilla de los palpos. Sensillum sola grabación (SSR) se utiliza para registrar las respuestas de las neuronas receptoras del olor, que es un método eficaz para la detección de ligandos activos sobre los receptores de olor específico. SSR se utiliza en estudios funcionales de receptores odorantes en sensillo palp. La estructura de la basiconica sensilla situado en la cúpula de los palpos difiere un poco de la estructura de los de las antenas. Por lo tanto, cuando se realiza un SSR provocada por olores, algunos consejos específicos pueden ser útil para la obtención de resultados óptimos. En este papel, se presenta un protocolo detallado y altamente eficaz para un SSR de insectos palpo sensilla basiconica.
Introduction
Los animales han desarrollado una serie de órganos quimiosensoriales que detecta señales químicas exógenas. En los insectos, los órganos quimiosensoriales más importantes son las antenas y los palpos. En estos órganos, varios tipos de pelos quimiosensoriales, llamados chemosensory sensilla, están inervados por neuronas quimiosensoriales (CSNs) dentro de los pelos. CSNs en sensilla chemosensory reconocen señales químicas específicas a través de la transducción de estímulos químicos a potenciales eléctricos que posteriormente se transfieren hasta el sistema nervioso central1,2,3 .
CSNs expresan receptores quimiosensoriales varios [p. ej., receptores de olor (ORs)], ionotrópicos (IRs) de los receptores y los receptores gustativos (GRs) en sus membranas, que codifican señales químicos exógenos asociados con diferentes tipos de chemosensation 4,5,6. La caracterización de CSNs es clave para el esclarecimiento de los mecanismos celulares y moleculares de insectos quimiorrecepción. Ahora solo sensillum grabación (SSR) es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización de insecto CSNs en la sensilla antenal de muchos insectos, incluyendo moscas7,8de polillas, escarabajos de9,10de áfidos, langostas11, y las hormigas12. Sin embargo, pocos estudios han aplicado un SSR a palpos insectos13,14,15,16,17, ya que las estructuras particulares de su sensillo un grabación electrofisiológica difícil18.
Enjambres de langostas (Orthoptera) a menudo causan graves daños y pérdidas económicas19. Los palpos se creen que juegan un papel importante en la selección del alimento de langosta20,21,22,23,24. Dos tipos de chemosensory sensilla son investigados por un microscopio electrónico de barrido (SEM). Generalmente, se observan en cada cúpula de langosta palpos18350 sensilla chaetica y sensilla basiconica de 7-8. Chaetica sensillo son sensillo gustativo que detecta señales químicas no volátil, mientras que sensillo basiconica tienen una función olfativa, detección de señales químicas volátiles.
En palpos de la langosta, los diámetros de las tomas del pelo de la basiconica de la sensilla (ca. 12 μm), son mucho mayores que los de sensilla chaetica (ca. 8 μm)18,25. La pared cuticular de la basiconica sensilla en los palpos es mucho más gruesa que el de sensillo antenal18. Además, la cúpula de la palpo tiene líquido contenido dentro de una cutícula flexible. Estas características significan que una penetración con un microelectrodo y adquisición de señales electrofisiológicas buena es más difícil que para sensillo antenal. En este documento, un protocolo SSR detallado y altamente eficaz para langosta palpo sensilla basiconica se presenta con un video.
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Protocol
1. preparación de instrumentos y del insecto
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Preparación de tungsteno electrodos y estímulos soluciones
- Fijar un nuevo alambre de tungsteno (0,125 mm de diámetro, longitud de 75 mm) en un micromanipulador y afilar en una solución de nitrito (NaNO2) de sodio 10% (p/v) en una jeringa de 10 V proporcionado por una fuente de alimentación para 1 min. bajo un estereomicroscopio (aumento de X 40).
- Sumerja el alambre de tungsteno afilada repetidamente en la NaNO2 solución al 10%, aproximadamente de 4 mm a 5 V en < 1 minuto (figura 1A).
- Examinar el diámetro de la punta de tungsteno afilada con frecuencia bajo el estereomicroscopio hasta que esté lo suficientemente fina para penetrar la cutícula de un sensillum olfativa del palpo de langostas (figura 1B).
- Preparar las soluciones de estímulo. Diluir cada uno de la sustancia de estímulo químico en aceite mineral. Diluir 1-nonanol y ácido nonanoico en diluciones de 10%. Diluir E-2-hexenal y hexanal en 10-2, 10-3, 10-4y 10-5.
- Preparar Pasteur los tubos que llevan los estímulos: Inserte las tiras de papel de filtro (de 2 cm de largo, de 0,5 cm de ancho) en los tubos de Pasteur, agregar las soluciones diluidas de estímulo (cada 10 μl) a las tiras de papel de filtro y luego conecte los tubos de Pasteur con pipetas (1 ml).
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Preparar el insecto
- Posterior las langostas (Locusta migratoria) con plántulas de trigo fresco bajo condiciones de hacinamiento en una humedad relativa de 60%, una temperatura de 28-30 ° C y un fotoperíodo de 18:6 h (luz: oscuridad). Elija de 1 a 3 días de edad: 5º instar ninfas de langosta y quitar las antenas con tijeras finas para evitar cualquier interferencia durante la grabación.
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Preparar el soporte del palpo maxilar langosta
- Utilizar un portaobjeto (25 x 75 mm) como la base del soporte del palpo maxilar (MPH). Póngale un trozo de plástico (1 mm de altura, 10 mm de ancho, 35 mm de longitud) en una esquina de la diapositiva de cristal con cinta adhesiva de doble cara y finalmente fijar un cubierta de vidrio (18 mm x 18 mm) encima de la pieza de plástico con cinta adhesiva de doble cara. Coloque un pedazo pequeño de cinta de goma roja en la cubierta de vidrio como una capa de antideslizante. La pieza de plástico y el vidrio de la cubierta constituyen la plataforma para el palpo de langosta. La altura de la plataforma es de aproximadamente 1,5 mm.
- Instalar un alambre de tungsteno (diámetro de 0,125 mm, 36 mm de longitud) a una distancia de 1,5 mm paralelo al interior borde de la plataforma. Fijar los dos extremos del cable a la plataforma con cinta adhesiva de doble cara.
2. preparación de palpos maxilares de langosta
- Cortar un tubo de centrífuga (1.5 ml) verticalmente por la mitad y cortar la parte inferior. Ponga la langosta en el tubo preparado. Salir de la región ventral y la cabeza de la langosta expuesta. Fijar el conjunto a la diapositiva de cristal con cinta adhesiva de doble cara (figura 2A).
- Tire el palpo maxilar derecho en la plataforma.
- Poner el alambre de tungsteno en el cuarto segmento de la palpo. Coloque masilla adhesiva a cada lado del alambre de tungsteno, unos 2 mm de la palpo maxilar (figura 2A y 2B).
3. solo Sensillum grabaciones
- Colocar la preparación de langosta palpo maxilar bajo un microscopio a bajo aumento (100 X). Ajuste la posición de la preparación hasta que el palpo es perpendicular al electrodo de la grabación (Figura 3A).
- Insertar el electrodo de referencia (electrodo de tungsteno) en el ojo de la langosta mediante un micromanipulador. Mover el electrodo de la grabación (electrodo de tungsteno) cerca el palpo maxilar con el instrumental quirúrgico (figura 3B y 3C).
- Ajuste el dispositivo de entrega de olor a aproximadamente 1 cm desde el palpo maxilar (figura 3B).
- Abra el software de grabación Auto punto 32. Configurar los parámetros de grabación como sigue: la escala de grabación 500 μV; el alta corte del filtro de 300 Hz, el límite baja a 200 Hz; y pretrigger en 10 s.
- Conectar el electrodo de la grabación a un 10 x amplificador de AC/DC universal.
- Interruptor del microscopio a un aumento alto de (500 X). Insertar el electrodo de registro en la base de un sensillum de basiconic en el palpo maxilar y delicadamente ajustar el electrodo de la grabación para obtener buena picos espontáneos (figura 3D).
- Abra el controlador de estímulo para entregar una corriente de aire continua a 20 ml/s. establecer el tiempo de estimulación 1 señales de registro s. para 10 s, a partir de 10 s antes de la aparición del pulso del estímulo.
- Utilice un amplificador de AC/DC universal de 10 x para amplificar las señales. Alimentan las señales de los 4 de IDAC. Analizar las señales con el software Auto punto 32. Señales de CA son band-pass filtrada entre 200 a 300 Hz. uso Auto punto 32 para distinguir las amplitudes pico a través de ruidos. Calcular las respuestas de las neuronas como los aumentos en la frecuencia del potencial de acción (espigas por segundo) sobre las frecuencias espontáneas. Realizar un análisis estadístico utilizando GraphPad Prisma 7.
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Representative Results
Se identifican dos subtipos sensilla (pb1 y pb2) en el palpo maxilar de langosta basado en dinámica de respuesta a olores químicos (10% 1-nonanol y 10% de ácido nonanoico). Las neuronas en pb1 producen significativamente más picos 1-nonanol de ácido nonanoico mientras las neuronas en pb2 son significativamente que menos activa 1-nonanol comparado con ácido nonanoico (figura 4). Hexanal y E-2-Hexenal pueden evocar un palpo langosta apertura respuesta (POR)26. Hexanal es una anfitrión abundante verde de la planta hoja volátil que puede contribuir a una confirmación adicional a la fuente de alimentos26. Los puntos sacados en las neuronas de pb1 último más de largo que los de pb2 cuando son estimulados por E-2-hexenal (figura 4). Las neuronas en pb1 y pb2 exhiben igualmente sólidas respuestas a hexanal (figura 4). Comparar los cambios promedios de todos los puntos entre los períodos 5 antes y 5 s después de que el estímulo indica que la respuesta a 1-nonanol es significativamente superior al ácido nonanoico en pb1, sino por el contrario en pb2 (figura 5). Las neuronas en estos dos subtipos de sensilla respondan dosis dependiente a E-2-hexenal y hexanal y sus patrones de respuesta a estas dos aldehídos diferencian (figura 6A y 6B).
Figura 1. Preparación del electrodo. (A) este panel muestra un general ve del aparato de afilado del electrodo. La jeringa que contiene 10% NaNO2 (izquierda) se utiliza para afilar el electrodo (derecha). (B) este panel muestra una vista cercana de la punta del electrodo (a: adecuado, b: inadecuados). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Sostenedor del palpo maxilar langosta (MPH). (A) el MPH y una langosta están montados sobre el portaobjetos de vidrio antes de colocar bajo el microscopio. (B) este panel muestra un primer plano de la palpo maxilar de langosta, fijada por el alambre de tungsteno en la plataforma. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Solo grabaciones de sensillum. (A) este panel muestra una vista de la configuración de la electrofisiología. (B) este panel muestra una vista cercana de la preparación de langosta en el microscopio. (C) esta imagen muestra el palpo maxilar de langosta con 100 aumentos. (D) esta imagen muestra el palpo con 500 aumentos. La flecha indica un sensillum de basiconic. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Rastros de la respuesta de grabaciones solo sensillum del palpo maxilar langosta. En este panel, pb1 está parado para el subtipo 1 de la basiconica sensilla de palpo; PB2 está parado para el subtipo 2 de la palpo sensilla basiconica. Las barras sobre las huellas indican la duración del estímulo (1 s). Para estas grabaciones, en diluciones de 10% excepto E-2-hexenal y hexanal, que son diluidas al 1% se utilizan todos los olores. Esta figura ha sido modificada de Zhang et al. 26. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Comparación de medios números de espigas en las neuronas pb1 y pb2 estimulada por ácido nonanoico y 1-nonanol. El número promedio de los picos se calcula en los períodos 5 s antes y después del estímulo. En pb1, la cantidad media de los picos en las neuronas en respuesta a 1-nonanol aumenta significativamente más altos que los de las puntas de las neuronas en respuesta a ácido nonanoico (n = 11 palpos; ANOVA con post hoc prueba t; p < 0.0001), en contraste con pb2 (n = 10 palpos; ANOVA con post hoc prueba t; p = 0.0110). La barra de error representa SEM. Esta figura ha sido modificada de Zhang et al. 26. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Los patrones de las neuronas en pb1 y pb2 dosis dependiente responde a E-2-hexenal y hexanal. (A) este panel muestra los patrones de las neuronas en pb1 (± SEM; n = 12 palpos). (B) este panel muestra los patrones de las neuronas en pb2 (± SEM; n = 10 palpos). Esta figura ha sido modificada de Zhang et al. 26. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Insectos dependen de palpos para detectar olores de alimentos y los palpos se creen que juegan un papel importante en la especiación13,27. Los palpos son órganos olfativos simples y están recibiendo una atención creciente como un modelo atractivo para la exploración de la neuromolecular redes subyacentes chemosensation28.
Insectos labellar y palpo SSRs se han realizado con éxito en Drosophila melanogaster, gambiae de los Anophelesy Culex quinquefasciatus13,14,15,16 , 17 pero se han divulgado raramente en la forma de un vídeo de presentación16,29. Por el contrario, hay datos videos en SSRs antenales de Drosophila, la polilla del orangeworm del ombligo (Amyeloistransitella), Schistocerca Americanay la chinche (Cimex lectularius)16, 30 , 31 , 32 , 33.
Locust palpo sensilla basiconica tienen una estructura particular que difiere de la de sensillo antenal de langosta y muchos otros insectos sensilla. Utilizando el método descrito aquí, potenciales de acción generados por langosta palpo sensilla basiconica subtipos pb1 y pb2 pudo ser grabado y discriminadas (figura 4 y figura 5).
El paso crítico es la penetración de los electrodos de la grabación. El electrodo de la grabación debe ser insertado en la base de la sensillum y avanzado hasta que se adquieren buenas señales. Además, es importante evitar que la cúpula de la palpo que se derrumban cuando el electrodo de registro se inserta en la base de la sensillum. Para ello, establecer una plataforma que incluye un sostenedor del palpo maxilar langosta especial (MPH) y utiliza un alambre de tungsteno para comprimir el cuarto segmento de la palpo. Muchas repeticiones de este procedimiento muestran que es efectiva. Basado en los patrones de respuesta de las neuronas en la sensilla a varios odorantes, hemos, por primera vez, identificado dos subtipos de basiconica sensillo en el palpo maxilar de la langosta, es decir, pb1 y pb2.
La limitación de la técnica se describe en esta publicación es que podría ser utilizado para grabar grandes insectos (e.g., polillas, escarabajos y langostas) mientras no para grabar pequeños insectos (por ejemplo, moscas y mosquitos), que tienen sus propias plataformas y técnicas13,14,15,16,17. Esta técnica es complementaria a los métodos existentes.
En conclusión, un protocolo muy eficaz de un SSR de insectos palpo sensilla basiconica se describe en detalle. Este protocolo podría proporcionar los investigadores con una técnica útil en el estudio de mecanismos moleculares y celulares de insectos del olfato en el mouthpart. Este método con cromatografía de gases puede utilizarse para identificar ligandos naturales electrophysiologically activo en extractos de recursos alimenticios favorables.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (No.31472037). Cualquier mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica una recomendación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | ADVENT | W559504 | Used for making the electrode and fixing the palp |
| NaNO2 | Sigma-aldrich | 563218-25G | Used for sharpening the tungsten wire |
| AC Power Supply | Syntech | A2-70 | Providing the voltage in sharpening the tungsten wire |
| Stereoscope | Motic | SMZ-163 | Used for observing the sharpening of tungsten wire |
| Microscope | Olympus | W-51 | Used for observing the sensilla on locust maxillary palp |
| Intelligent Data Acquisition Controller | Syntech | IDAC-4 | Real-time on screen display of all signals before and during recording |
| Stimulus controller | Syntech | CS-55 | Used for controlling the stimulus application |
| Electronic micromanipulator | C.M.D.T | CFT-8301D | Used for minor movement of the recording electrode |
| Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Used for minor movement of the reference electrode |
| Speaker | EDIFIER | R101T06 | Connected with IDAC-4 and providing sound for the signal |
| Magnetic base | PDOK | PD-101 | Used to hold the electrode, and stimulus delivery tube |
| Vibration Isolation Table | TianHe | HAP-100-1208 | Used for isolating the vibration from the equipment |
| Glass slide | CITOGLAS | ZBP-407 | Used for making the base for the MPH |
| Blu-tack | Bostik | Blu-tack-45g | Fixing the tungsten wire |
| Pasteur tube | YARE | WITEG | Placing the filter paper containing stimuli stimulus solutions |
References
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