Summary

तीव्र रोधगलन और हृदय रोग में परिचालित MicroRNAs के लिए डिजिटल पीसीआर

Published: July 03, 2018
doi:

Summary

परिसंचारी microRNAs हृदय रोगों और तीव्र रोधगलन infarctions के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । इस अध्ययन में, हम miRNA निष्कर्षण, रिवर्स प्रतिलेखन, और हृदय रोग के साथ रोगियों के सीरम में miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए डिजिटल पीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

परिसंचारी सीरम microRNAs (miRNAs) हृदय रोग और तीव्र रोधगलन (अमी) के लिए, हृदय कोशिकाओं से संचलन में जारी किया जा रहा है के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । परिचालित miRNAs अत्यधिक स्थिर होते हैं और quantified जा सकते हैं. विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता दिखाते हैं । हृदय रोगों के लिए उपंयास जैव मार्क्स खोजना चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्व का है । गौरतलब है कि हाल ही में डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (dPCR) का आविष्कार किया गया है । dPCR, फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त, विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । dPCR मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) की तुलना में एक कम परिवर्तनशीलता, उच्च रैखिकता, और उच्च संवेदनशीलता सहित बेहतर तकनीकी गुणों को दर्शाती है । इस प्रकार, dPCR के लिए एक अधिक सटीक और reproducible विधि है सीधे miRNAs को बढ़ाता है, विशेष रूप से बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए । इस प्रकाशन में, हम वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन के लिए सीरम नमूनों में निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का आकलन करने के लिए ।

Introduction

परिसंचारी miRNAs हृदय रोग1सहित रोगों की एक संख्या के लिए होनहार मार्कर के रूप में पहचान की गई है । miRNAs छोटे हैं, गैर कोडिंग एकल-असहाय आरएनए अणु (लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड लांग) दूत आरएनए अनुवाद के परिवर्तन के माध्यम से पोस्ट transcriptional विनियमन में शामिल है और जीन अभिव्यक्ति2को प्रभावित कर रहे हैं, और दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में संचलन में जारी कर रहे हैं । विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता1दिखाते हैं । हृदय रोगों में miRNAs उपन्यास के रूप में आकर्षक उम्मीदवार बन गए हैं क्योंकि वे सीरम में उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं और पीसीआर पद्धति3की मदद से आसानी से quantified जा सकता है. रोधगलन के लिए miRNAs के रूप में संभावित मूल्य छोटे अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन बड़े साथियों में मांयता2कमी है । उदाहरण के लिए, मीर-४९९ अत्यधिक रोधगलन में व्यक्त पाया जाता है, और यह काफी एक अमी4,5,6में वृद्धि होने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, यह क्रमादेशित सेल मौत (apoptosis) और cardiomyocytes के भेदभाव को नियंत्रित करता है और इस प्रकार एक अमी7के बाद कई तंत्र में शामिल है । अमी के निदान के लिए miRNAs के एक वरिष्ठता और वृद्धिशील मूल्य रिपोर्टिंग कुछ छोटे अध्ययनों के अलावा, उच्च संवेदनशीलता कार्डियक troponins के लिए श्रेष्ठता या समानता अभी तक बड़े पैमाने पर अध्ययन में सिद्ध नहीं किया गया है2,5 ,6,8. बड़े साथियों में अधिक संभावित अध्ययन कर रहे हैं, इसलिए, miRNAs के संभावित नैदानिक मूल्य का आकलन करने की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, miRNA ठहराव के तरीकों को अनुकूलित और तुलनीय प्रोटोकॉल9का उपयोग मानकीकृत की जरूरत है । मानकीकृत परख असंगत परिणाम कम हो सकता है और miRNAs नियमित नैदानिक आवेदन के लिए संभावित उपमार्क्स बनने के लिए मदद कर सकते हैं, के रूप में एक reproducible तरीके से अपने नैदानिक प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए quantified की जरूरत है ।

हाल ही में, dPCR एक अंत सूत्री विश्लेषण के रूप में पेश किया गया है । यह लगभग २०,००० व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में नमूना विभाजन10। dPCR प्रणाली तो फ्लोरोसेंट संकेतों की एक गणितीय Poisson सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करता है (सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाओं), एक मानक वक्र के बिना एक निरपेक्ष ठहराव को सक्षम करने10. जब फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ dPCR संयोजन, miRNAs के अत्यधिक विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव संभव बनाया है । डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया बेहतर तकनीकी गुणों का प्रदर्शन दिखाया गया है (एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन reproducibility, रैखिकता के एक उच्च डिग्री, और एक उच्च संवेदनशीलता सहित) में miRNA के स्तर को बढ़ाता है के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर10,11की तुलना में संचलन । इन बेहतर तकनीकी गुणों के लिए miRNAs के रूप में परिसंचारी प्रयोग पर वर्तमान सीमाओं को कम करने में मदद मिल सकती है और बड़े बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में और एक नैदानिक विधि के रूप में के रूप में miRNAs की स्थापना के लिए नेतृत्व कर सकते है सामान्य. पिछले एक अध्ययन में, हम हाल ही में एक अमी के साथ रोगियों में परिसंचारी miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए dPCR लागू किया गया और बेहतर नैदानिक miRNAs के ठहराव की तुलना में क्षमता का प्रदर्शन करने में सक्षम थे12.

इस प्रकाशन में, हम प्रदर्शित करना चाहते है कि dPCR का उपयोग कर सीधे प्रसारित हृदय miRNAs को बढ़ाता है के लिए एक सटीक और reproducible विधि है । सीरम में miRNA स्तर के निरपेक्ष ठहराव, डिजिटल पीसीआर का उपयोग, बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए क्षमता से पता चलता है. इस प्रकाशन में, हम विस्तार में वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए और सीरम में निरपेक्ष miRNA प्रतिलिपि संख्या का पता लगाने के लिए कैसे ।

Protocol

1. प्लाज्मा/सीरम से miRNA का निष्कर्षण नोट: आदेश में उचित रूप से miRNAs यों तो, प्लाज्मा/सीरम से सही microRNA अलगाव एक महत्वपूर्ण कदम है । एक महत्वपूर्ण बात को ध्यान में रखने के लिए, विशेष रूप से, क्योंकि विभिं…

Representative Results

डिजिटल फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त पीसीआर को सीधे प्रतियां में विशिष्ट miRNAs की निरपेक्ष मात्रा को मात्रा में बढ़ाता है शोधकर्ताओं/µ l dPCR में नमूना लगभग २०,००० व्यक्तिगत पीसीआर प्रतिक?…

Discussion

डिजिटल पीसीआर एक अपेक्षाकृत उपंयास है कि पीसीआर के अंत बिंदु विधि है कि एक नमूने के भीतर न्यूक्लिक एसिड की प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव की अनुमति देता है । विधि एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन repr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों की कोई पावती नहीं है.

Materials

RNA-Extraction
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland 217184 Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript)  and RPE (called number two in manuscript).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland 219610 Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4366597 Kit for microRNA reverse transcription
TaqMan MicroRNA Assays M Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assays used in reverse transcription
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assay Number 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assay Number 000200
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA AB0900 96 well plate for reverse transcription
Microseal ‘B’ seal Seals Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA MSB1001 Foil to ensure proper storage
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1851196 Cycler used for reverse transcription
Droplet Digital PCR
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p Integrated DNA Technologies Custom Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863024 Supermix used in droplet generation
TaqMan MicroRNA Assays Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe)
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assay Number 001352, commercial primers
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA 4440887 Assay Number 000200, commercial primers
DG8 Cartridges and Gaskets Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1864007 Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation
DG8 Cartridge Holder Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863051 Holds cartridges in droplet generation
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863005 Oil used in droplet generation
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 12001925 96 well plate for ddPCR
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1814040 Pierceable foil, compatible with droplet reader
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863004 Oil used in droplet reading
QX100 or QX200 Droplet Generator Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863002 Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1814000 Seals the plate before PCR
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1851196 Cycler used for ddPCR
QX100 or QX200 Droplet Reader Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863003 Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1863052 Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette
Software
QuantaSof Software Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA 1864011 Program for droplet reading
Prism Windows 5 GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA Program for statistical analysis

References

  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease – summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D’Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).

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Cite This Article
Benning, L., Robinson, S., Follo, M., Heger, L. A., Stallmann, D., Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I., Hortmann, M. Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease. J. Vis. Exp. (137), e57950, doi:10.3791/57950 (2018).

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