तीव्र रोधगलन और हृदय रोग में परिचालित MicroRNAs के लिए डिजिटल पीसीआर
Summary
परिसंचारी microRNAs हृदय रोगों और तीव्र रोधगलन infarctions के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । इस अध्ययन में, हम miRNA निष्कर्षण, रिवर्स प्रतिलेखन, और हृदय रोग के साथ रोगियों के सीरम में miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए डिजिटल पीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Abstract
परिसंचारी सीरम microRNAs (miRNAs) हृदय रोग और तीव्र रोधगलन (अमी) के लिए, हृदय कोशिकाओं से संचलन में जारी किया जा रहा है के लिए रिमार्क्स के रूप में वादा दिखाया है । परिचालित miRNAs अत्यधिक स्थिर होते हैं और quantified जा सकते हैं. विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता दिखाते हैं । हृदय रोगों के लिए उपंयास जैव मार्क्स खोजना चिकित्सा अनुसंधान के लिए महत्व का है । गौरतलब है कि हाल ही में डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (dPCR) का आविष्कार किया गया है । dPCR, फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ संयुक्त, विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । dPCR मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) की तुलना में एक कम परिवर्तनशीलता, उच्च रैखिकता, और उच्च संवेदनशीलता सहित बेहतर तकनीकी गुणों को दर्शाती है । इस प्रकार, dPCR के लिए एक अधिक सटीक और reproducible विधि है सीधे miRNAs को बढ़ाता है, विशेष रूप से बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए । इस प्रकाशन में, हम वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन के लिए सीरम नमूनों में निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या का आकलन करने के लिए ।
Introduction
परिसंचारी miRNAs हृदय रोग1सहित रोगों की एक संख्या के लिए होनहार मार्कर के रूप में पहचान की गई है । miRNAs छोटे हैं, गैर कोडिंग एकल-असहाय आरएनए अणु (लगभग 22 न्यूक्लियोटाइड लांग) दूत आरएनए अनुवाद के परिवर्तन के माध्यम से पोस्ट transcriptional विनियमन में शामिल है और जीन अभिव्यक्ति2को प्रभावित कर रहे हैं, और दोनों शारीरिक और रोग राज्यों में संचलन में जारी कर रहे हैं । विशिष्ट miRNAs की मात्रात्मक अभिव्यक्ति विकृति से जोड़ा जा सकता है, और कुछ miRNAs उच्च ऊतक और रोग विशिष्टता1दिखाते हैं । हृदय रोगों में miRNAs उपन्यास के रूप में आकर्षक उम्मीदवार बन गए हैं क्योंकि वे सीरम में उल्लेखनीय रूप से स्थिर हैं और पीसीआर पद्धति3की मदद से आसानी से quantified जा सकता है. रोधगलन के लिए miRNAs के रूप में संभावित मूल्य छोटे अध्ययनों में मूल्यांकन किया गया है, लेकिन बड़े साथियों में मांयता2कमी है । उदाहरण के लिए, मीर-४९९ अत्यधिक रोधगलन में व्यक्त पाया जाता है, और यह काफी एक अमी4,5,6में वृद्धि होने के लिए दिखाया गया है. इसके अलावा, यह क्रमादेशित सेल मौत (apoptosis) और cardiomyocytes के भेदभाव को नियंत्रित करता है और इस प्रकार एक अमी7के बाद कई तंत्र में शामिल है । अमी के निदान के लिए miRNAs के एक वरिष्ठता और वृद्धिशील मूल्य रिपोर्टिंग कुछ छोटे अध्ययनों के अलावा, उच्च संवेदनशीलता कार्डियक troponins के लिए श्रेष्ठता या समानता अभी तक बड़े पैमाने पर अध्ययन में सिद्ध नहीं किया गया है2,5 ,6,8. बड़े साथियों में अधिक संभावित अध्ययन कर रहे हैं, इसलिए, miRNAs के संभावित नैदानिक मूल्य का आकलन करने की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, miRNA ठहराव के तरीकों को अनुकूलित और तुलनीय प्रोटोकॉल9का उपयोग मानकीकृत की जरूरत है । मानकीकृत परख असंगत परिणाम कम हो सकता है और miRNAs नियमित नैदानिक आवेदन के लिए संभावित उपमार्क्स बनने के लिए मदद कर सकते हैं, के रूप में एक reproducible तरीके से अपने नैदानिक प्रयोज्यता सुनिश्चित करने के लिए quantified की जरूरत है ।
हाल ही में, dPCR एक अंत सूत्री विश्लेषण के रूप में पेश किया गया है । यह लगभग २०,००० व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं में नमूना विभाजन10। dPCR प्रणाली तो फ्लोरोसेंट संकेतों की एक गणितीय Poisson सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग करता है (सकारात्मक और नकारात्मक प्रतिक्रियाओं), एक मानक वक्र के बिना एक निरपेक्ष ठहराव को सक्षम करने10. जब फ्लोरोसेंट hydrolysis जांच के साथ dPCR संयोजन, miRNAs के अत्यधिक विशिष्ट प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव संभव बनाया है । डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया बेहतर तकनीकी गुणों का प्रदर्शन दिखाया गया है (एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन reproducibility, रैखिकता के एक उच्च डिग्री, और एक उच्च संवेदनशीलता सहित) में miRNA के स्तर को बढ़ाता है के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर10,11की तुलना में संचलन । इन बेहतर तकनीकी गुणों के लिए miRNAs के रूप में परिसंचारी प्रयोग पर वर्तमान सीमाओं को कम करने में मदद मिल सकती है और बड़े बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में और एक नैदानिक विधि के रूप में के रूप में miRNAs की स्थापना के लिए नेतृत्व कर सकते है सामान्य. पिछले एक अध्ययन में, हम हाल ही में एक अमी के साथ रोगियों में परिसंचारी miRNAs के निरपेक्ष ठहराव के लिए dPCR लागू किया गया और बेहतर नैदानिक miRNAs के ठहराव की तुलना में क्षमता का प्रदर्शन करने में सक्षम थे12.
इस प्रकाशन में, हम प्रदर्शित करना चाहते है कि dPCR का उपयोग कर सीधे प्रसारित हृदय miRNAs को बढ़ाता है के लिए एक सटीक और reproducible विधि है । सीरम में miRNA स्तर के निरपेक्ष ठहराव, डिजिटल पीसीआर का उपयोग, बड़ी बहु केंद्र हृदय नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए क्षमता से पता चलता है. इस प्रकाशन में, हम विस्तार में वर्णन कैसे प्रभावी ढंग से डिजिटल पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए और सीरम में निरपेक्ष miRNA प्रतिलिपि संख्या का पता लगाने के लिए कैसे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
डिजिटल पीसीआर एक अपेक्षाकृत उपंयास है कि पीसीआर के अंत बिंदु विधि है कि एक नमूने के भीतर न्यूक्लिक एसिड की प्रत्यक्ष निरपेक्ष ठहराव की अनुमति देता है । विधि एक कम परिवर्तनशीलता, एक वृद्धि हुई दिन-दिन repr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों की कोई पावती नहीं है.
Materials
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
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