Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.
Zirkulierende Serum Mikro-RNAs (MiRNAs) haben gezeigt, dass Versprechen als Biomarker für die Herz-Kreislauf-Krankheiten und akutem Myokardinfarkt (AMI), wird von den Herz-Kreislauf-Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Zirkulierenden MiRNAs sind sehr stabil und quantifiziert werden kann. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs kann mit der Pathologie und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität verknüpft werden. Neue Biomarker für Herz-Kreislauf-Krankheiten zu finden ist von Bedeutung für die medizinische Forschung. Vor kurzem wurde digital Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) erfunden. dPCR, kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht eine spezifische direkte absolute Quantifizierung. dPCR stellt überlegene technische Eigenschaften, einschließlich eine geringe Variabilität, hohe Linearität und hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu den quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Somit ist dPCR eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der MiRNAs, speziell für den Einsatz in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf-direkt. In dieser Publikation beschreiben wir, wie effektiv digitale PCR durchzuführen, um die absolute Kopienzahl in Serumproben zu beurteilen.
Zirkulierenden MiRNAs wurden als vielversprechender Marker für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit1identifiziert. Die MiRNAs sind klein, nicht-kodierenden einsträngige RNA-Moleküle (ca. 22 Nukleotide lang) engagieren sich in der Posttranskriptionale Verordnung über die Änderung der Boten-RNA Übersetzung und beeinflussende Gene Expression2, und in den Blutkreislauf in physiologischen und pathologischen Zuständen freigegeben werden. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs der Pathologie zugeordnet werden kann, und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität1. Im Herz-Kreislauf-Krankheiten sind MiRNAs attraktive Kandidaten geworden, da neue Biomarker weil sie bemerkenswert stabil im Serum sind und leicht können mit Hilfe der PCR Methode3quantifiziert werden. Der potenzielle Wert der MiRNAs als Biomarker für Myokardinfarkt wurde in kleinen Studien ausgewertet, aber eine Validierung in großen Kohorten fehlt2. Zum Beispiel MiR-499 findet man hoch in den Herzmuskel zum Ausdruck gebracht, und es hat gezeigt, dass ein AMI4,5,6deutlich erhöht werden. Darüber hinaus regelt es programmierte Zelltod (Apoptose) und die Differenzierung von Kardiomyozyten und engagiert sich daher in mehrere Mechanismen, die nach einem AMI-7. Abgesehen von einigen kleinen Studien Berichterstattung eine Überlegenheit und inkrementellen Wert von MiRNAs für die Diagnose von AMI Überlegenheit oder Gleichheit zu hoher Empfindlichkeit kardiale Troponins nicht noch in groß angelegten Studien2,5 nachweislich ,6,8. Weitere prospektiven Studien in großen Kohorten sind daher erforderlich, um die mögliche diagnostische Wertigkeit von MiRNAs zu beurteilen. Darüber hinaus Methoden zur Quantifizierung der MiRNA optimiert werden müssen und standardisierte Verwendung vergleichbarer Protokolle9. Standardisierte Tests möglicherweise inkonsistente Ergebnisse reduzieren und können helfen MiRNAs, potenzielle Biomarker für die routinemäßige klinische Anwendung werden als Biomarker müssen reproduzierbar Sicherstellung ihrer klinischen Anwendbarkeit quantifiziert werden.
Vor kurzem, hat dPCR als eine Endpunktanalyse eingeführt. Es Partitionen die Probe in etwa 20.000 individuelle Reaktionen10. Das dPCR System nutzt dann eine mathematische Poisson statistische fluoreszierende Signale (positive und negative Reaktionen), wodurch eine absolute Quantifizierung ohne eine Standardkurve10. Bei der Kombination von dPCR mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden wird die hochspezifische direkte absolute Quantifizierung von MiRNAs ermöglicht. Digitalen Polymerase-Kettenreaktion hat gezeigt, dass überlegene technische Eigenschaften (einschließlich eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit, ein hohes Maß an Linearität und eine hohe Empfindlichkeit) zur Quantifizierung der MiRNA-Ebenen in weisen die Zirkulation im Vergleich zu quantitative Echtzeit-PCR-10,11. Diese überlegene technische Qualitäten könnte dazu beitragen, um aktuelle Beschränkungen bei der Verwendung von zirkulierenden MiRNAs als Biomarker zu mildern und führen zur Gründung der MiRNAs als Biomarker in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf- sowie eine diagnostische Methode in allgemeine. In einer früheren Studie haben wir vor kurzem angewendet dPCR für die absolute Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs bei Patienten mit einem AMI und konnten überlegene diagnostische Potenzial im Vergleich zu der Quantifizierung von MiRNAs qPCR12zeigen.
In dieser Publikation wollen wir zeigen, dass mit dPCR ist eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der zirkulierenden Herz-Kreislauf-MiRNAs direkt. Die absolute Quantifizierung der MiRNA-Niveaus im Serum, mit digitalen PCR zeigt Potenzial für den Einsatz in großen multizentrischen Herz-Kreislauf-klinische Studien. In dieser Publikation beschreiben wir ausführlich, wie Sie digitale PCR effizient zu erfüllen und um die absolute MiRNA Kopienzahl im Serum zu erkennen.
Digitale PCR ist ein relativ neuer Endpunkt-Methode von PCR, die die direkte absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren innerhalb einer Probe ermöglicht. Die Methode besitzt bestimmte Vorteile, wie eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität11,12. Darüber hinaus durch die Partitionierung der Probe in etwa 20.000 einzelne Reaktionen und Endpunkt Analysen dPCR ist robuster, störender Substanzen in…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Bestätigungen.
RNA-Extraction | |||
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
Reverse Transcription | |||
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
Droplet Digital PCR | |||
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
Software | |||
QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |