Cirkulerande mikroRNA har visat lovande resultat som biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar och akut hjärtinfarkt. I denna studie beskriver vi ett protokoll för miRNA utvinning, omvänd Transkription och digital PCR för absolut kvantifiering av MicroRNA i serum hos patienter med kardiovaskulär sjukdom.
Cirkulerande serum mikroRNA (Mirna) har visat lovande resultat som biomarkörer för kardiovaskulär sjukdom och akut hjärtinfarkt (AMI), släpps ut från hjärt-celler i cirkulationen. Cirkulerande MicroRNA är mycket stabila och kan kvantifieras. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologi, och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet. Att finna nya biomarkörer för hjärt-kärlsjukdomar är av betydelse för medicinsk forskning. Digitala polymeras-kedjereaktion (dPCR) har helt nyligen uppfunnits. dPCR, kombinerat med fluorescerande hydrolys sonder, kan särskild direkt absolut kvantifiering. dPCR uppvisar överlägsna tekniska egenskaper, inklusive en låg variabilitet, hög linjäritet och hög känslighet jämfört med kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR). DPCR är således en mer exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering MicroRNA, särskilt för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I denna publikation beskriver vi hur du effektivt utför digital PCR för att bedöma antalet absoluta kopia i serumprov.
Cirkulerande MicroRNA har identifierats som lovande markörer för ett antal sjukdomar, däribland hjärt-kärlsjukdom1. MicroRNA är små, icke-kodande enkelsträngat RNA molekyler (cirka 22 nukleotider långa) är inblandade i den post-transcriptional förordning via ändring av budbärar-RNA översättning och påverkande gene expression2, och släpps ut i cirkulationen i både fysiologiska och patologiska stater. Det kvantitativa uttrycket för specifika MicroRNA kan kopplas till patologin och vissa MicroRNA Visa hög vävnad och sjukdom specificitet1. I hjärt-kärlsjukdomar, har MicroRNA blivit attraktiva kandidater som nya biomarkörer eftersom de är anmärkningsvärt stabil i serum och kan enkelt kvantifieras med hjälp av PCR-metod3. Det potentiella värdet av MicroRNA som biomarkörer för hjärtinfarkt har utvärderats i mindre studier, men en validering i stora kohorter saknas2. Till exempel miR-499 finns starkt uttryckt i hjärtinfarkt muskeln, och det har visat sig öka avsevärt i en AMI4,5,6. Ytterligare, det reglerar programmerad celldöd (apoptos) och differentiering av hjärtmuskelceller och således är involverad i flera mekanismer efter en AMI7. Bortsett från några små studier rapporterar en överlägsenhet och tillkommande värdet av MicroRNA för diagnos av AMI, har den överlägsenhet eller jämställdhet till hög känslighet hjärt troponins inte ännu bevisat i storskaliga studier2,5 ,6,8. Fler prospektiva studier i stora kohorter, därför behövs för att bedöma potentiella diagnostiska värdet av microRNA. Dessutom metoder miRNA rapporteringsgräns behöver optimeras och standardiserade med jämförbara protokoll9. Standardiserade analyser kan minska inkonsekventa resultat och kan hjälpa MicroRNA att bli potentiella biomarkörer för rutinmässig klinisk tillämpning, som biomarkörer behöver kvantifieras på ett reproducerbart sätt att säkerställa deras kliniska tillämpligheten.
DPCR har nyligen införts som en slutpunkt analys. Det partitioner provet till ungefärligt 20.000 enskilda reaktioner10. DPCR systemet utnyttjar sedan en matematisk Poisson statistisk analys av fluorescerande signaler (positiva och negativa reaktioner), möjliggör en absolut kvantifiering utan en standardkurva10. När man kombinerar dPCR med fluorescerande hydrolys sonder, är mycket specifika direkt absolut kvantifiering av MicroRNA möjlig. Digitala polymeraskedjereaktion har visat för att uppvisar överlägsna tekniska egenskaper (inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet, en hög grad av linjäritet och hög känslighet) för att kvantifiera miRNA nivåer i den omsättning jämfört med kvantitativ realtids PCR-10,11. Dessa överlägsna tekniska egenskaper kan bidra till att mildra nuvarande begränsningar med cirkulerande MicroRNA som biomarkörer och kan leda till inrättandet av MicroRNA som biomarkörer i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar och som en diagnostisk metod i Allmänt. I en tidigare studie, vi nyligen tillämpas dPCR för absolut kvantifiering av cirkulerande MicroRNA hos patienter med en AMI och kunde påvisa överlägsen diagnostisk potential jämfört med kvantifiering av MicroRNA av qPCR12.
I denna publikation vill vi visa att använda dPCR är en exakt och reproducerbar metod för direkt kvantifiering av cirkulerande kardiovaskulära microRNA. Absolut kvantifiering av miRNA nivåer i serum, använder digital PCR, visar potential för användning i stora multicenter hjärt-kliniska prövningar. I den här skriften beskriver vi i detalj hur du effektivt utför digital PCR och hur man upptäcker absoluta miRNA kopienumret i serum.
Digital PCR är en relativt ny slutpunkten metod av PCR som tillåter direkt absolut kvantifiering av nukleinsyror inom ett urval. Metoden besitter speciella fördelar, inklusive en minskad variabilitet, en ökad dagliga reproducerbarhet och en överlägsen känslighet11,12. Vidare, på grund av uppdelningen av provet till ungefärligt 20.000 enda reaktioner och endpoint analyser, dPCR är mer robust till interfererande substanser i PCR jämfört med kvantitativ …
The authors have nothing to disclose.
Författarna har inga bekräftelser.
RNA-Extraction | |||
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
Reverse Transcription | |||
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
Droplet Digital PCR | |||
100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
Software | |||
QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |