Summary
Qui, presentiamo le modifiche necessarie a un ben caratterizzato e comunemente usato piccolo indotta da cloruro ferrico (FeCl3) dell'arteria carotica ferita modello animale per l'uso in un modello di grande animale ferita vascolare. Il modello risultante può essere utilizzato per la valutazione pre-clinica prova degli interventi farmacologici e meccanici sia profilattici e trombolitici.
Abstract
Trombosi arteriosa occlusiva che portano a ictus cerebrale di tipo ischemico e infarto miocardico contribuisce a 13 milioni di morti ogni anno a livello globale. Qui, abbiamo tradotto un modello di lesione vascolare da un piccolo animale in un animale di grandi dimensioni (canino), con lievi modifiche che possono essere utilizzate per lo screening pre-clinico di agenti profilattici e trombolitici. Oltre ai metodi chirurgici, il protocollo modificato descrive i metodi dettagliati per valutare la canalizzazione dell'arteria carotica di angiografia, istruzioni dettagliate per elaborare il cervello e la carotide per analisi istologica verificare carotico canalizzazione e l'emorragia cerebrale e parametri specifici per completare una valutazione degli eventi tromboembolici a valle utilizzando la risonanza magnetica (MRI). Inoltre, specifici cambiamenti procedurali da precedentemente consolidato modello animale piccolo necessario tradurre in una lesione vascolare animale di grandi dimensioni (canino) sono discussi.
Introduction
Terapia di colpo in gran parte è modellata dopo il trattamento di malattia dell'arteria coronaria, principalmente perché gli interventi nella malattia cardiovascolare hanno risposto bene al farmaco terapia ed endovascolare interventi1. Questi trattamenti, tuttavia, non sono tradotti con successo ad infarto cerebrale. Le difficoltà con l'attuale trattamento di ictus sono che non può essere invertito il recombinant attivatore tissutale del plasminogeno (rTPA), e che la somministrazione comporta un rischio significativo di 6,4% di conversione emorragica2,3, 4. il risultato la morbosità e la mortalità limita l'utilizzo di una finestra piccola, spesso irraggiungibile5. Inoltre, restenosi e l'occlusione si verifica spesso dopo il thrombolysis iniziale, invertendo il miglioramento neurologico iniziale. In sintesi, c'è una stretta finestra temporale per amministrare rTPA che esclude la grandede maggioranza (~ 90%) dei pazienti che soffrono di insulti cerebrovascolari ischemici.
Il ruolo della terapia antiaggregante endovenosa ha indicato la promessa nel trattamento del colpo ischemico con nave migliorata ricanalizzazione, sopravvivenza e risultato2. Purtroppo, questi farmaci hanno un effetto collaterale prevedibile dell'emorragia intra-cranica ed extra-cranica, in gran parte perché non c'è alcun modo per adeguatamente invertire o controllare la loro attività2. Mentre efficace nell'impedire l'aggregazione della piastrina, il rischio di emorragia e l'incapacità di invertire la loro attività hanno precluso il loro uso nella routine di cura dei pazienti colpiti da ictus. Esiste pertanto, una necessità, per potenti farmaci antitrombotici che agiscono da soli o in combinazioni per prevenire e lisare coaguli ancora hanno un profilo di sicurezza che permette l'uso in uno spazio chiuso, a basso volume come il cervello, dove l'emorragia è mal tollerata.
La comprensione del meccanismo di re-stenosi e trombosi arteriosa e valutando trombolitici e farmaci che impediscono la re-stenosi, richiede modelli piccoli e grandi animali come parte dello sviluppo di farmaci pre-clinica. Lesione vascolare indotta da cloruro ferrico è una tecnica ampiamente utilizzata rapidamente e con precisione indurre la formazione di trombi nei vasi sanguigni esposti dei topi, ratti, cavie ed i conigli6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. queste specie più piccole offrono diversi vantaggi tra cui la facilità di manipolazione genetica, acquisto animali poco costoso e basso costi di alloggio al giorno. Purtroppo, gli esperimenti sugli animali piccoli negano più sangue disegna durante la chirurgia per accesso reattività piastrinica, emogasanalisi e risposta infiammatoria. Ancora più importante, grandi animali molto più strettamente imitano la fisiologia umana della piastrina6,13. Il modello di lesione dell'arteria carotica di FeCl3 ha svolto un ruolo predominante nello studio della fisiopatologia della trombosi, nella validazione di nuovi farmaci antiaggreganti e anticoagulanti e alla scoperta di potenziali trombolitici6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. modelli precedenti in topi, ratti, cavie e conigli hanno fornito la facilità e la flessibilità per la manipolazione genetica, ma traducibili modelli pre-clinici sono fondamentali per studi di tossicità e dosaggio pazienti di terapeutica potenziale6 ,13. Anche se sono stati sviluppati diversi modelli di disordini trombotici nei topi, grandi modelli animali di trombosi che valgono per la malattia vascolare periferica, ictus e infarto miocardico sono pochi e lontani. I primi modelli di trombosi in scimmie, cani e maiali focalizzata sulla stenosi, applicazione emostatiche e cilindri successive ai vasi, comunemente conseguente flusso ciclico riduzioni14,15,16. Invece di un embolo occlusivo presso il sito del danno endoteliale come nel modello di cloruro ferrico, l'embolo in questi modelli ciclica trombosi, embolizzazione distale ha provocato e tornare al normale flusso sanguigno. In confronto, il modello di cloruro ferrico per volta qui in un animale di grandi dimensioni, risultati in un embolo occlusivo al sito di lesione ed è stabilizzato e verificato da angiografia prima del trattamento trombolitico. Condizione che lo sperimentatore ha ampi fondi per diem e acquisto di canini e adeguate competenze chirurgiche, dettagliamo qui un grande modello canino di lesione vascolare per consentire laboratori studiare la trombosi che utilizzano chirurgica, imaging e istologico tecniche.
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Protocol
Le indagini descritte sono conformi alle linee guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e sono state approvate dal comitato di uso (#2015A00000029) e The Ohio State University istituzionale Animal Care. Tutte le manipolazioni chirurgiche sono state eseguite sotto anestesia profonda e gli animali non hanno avvertito dolore in qualsiasi momento durante la procedura. Tutti gli esperimenti descritti erano mancato recupero.
1. preparazione
- Appena preparare 50 mL di cloruro ferrico (FeCl3) al 50% (p/v) diluito in acqua deionizzata.
- Tagliare il nastro ombelicale in pezzi 5,5 cm e immergere in soluzione appena preparata 50% FeCl3 1 settimana prima della procedura.
Nota: Il nastro ombelicale utilizzato è spesso e richiede del tempo per assorbire la soluzione di 50% FeCl3 . - Veloce ogni canino durante la notte prima dell'intervento chirurgico.
- Etichetta cryovials per la raccolta dell'urina e del plasma, provette da centrifuga sterile 50ml per tutto lo storage dell'organo e contenitori di formalina al 10% per la fissazione del cervello e carotico per H & E che macchia con l'identificazione dell'animale, data di nascita, data di chirurgia e il trattamento.
- Preparare 100 mL di ciascuna soluzione per ogni procedura canino: formalina paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4), 10% neutra tamponata e 2% di cloruro di 2, 3,5-triphenyltetrazolium [TTC in PBS (pH 7.4), conservare al buio].
- Acquisire un ampio azoto liquido per cryovials tutti e provette di tessuto da 50 mL per congelamento per il giorno della procedura di flash.
- Acquisire due cartucce di ADP/collagene per reattività piastrinica PFA-100 (analizzatore di funzione della piastrina) per ogni cane per ogni punto di tempo di interesse.
- Acquisire un 4,5 mL di citrato di sodio provetta da prelievo, per ogni prelievo di sangue prima del sacrificio, per la separazione del plasma e deposito. A sacrifice, disegnare 16 provette per prelievo ematico per lo stoccaggio del plasma. Dopo ogni provetta da prelievo è completo, spin a 4.000 x g per 30 s per isolare il plasma ricco di piastrine e trasferimento chiaro strato in cryovials. Freeze Flash in azoto liquido prima della conservazione a-80 ° C.
- Acquisire un 4,5 mL litio eparina provetta da prelievo, per ogni punto del tempo di PFA-100 di interesse per reattività piastrinica record. Presso ogni tiraggio del sangue, è necessario introdurre 800 µ l di sangue intero da un tubi di raccolta del sangue di eparina di litio in ogni cartuccia di ADP/collagene senza bolle d'aria a seguire la reattività piastrinica.
- Acquisire due tubi di raccolta del sangue EDTA K3 (1,8 mg di EDTA anidro per 1 mL di sangue), per esame emocromocitometrico completo (CBC) al basale e al momento del sacrificio.
Nota: Questo volume è adeguato per la maggior parte delle strutture di base eseguire ogni due volte in caso di errore meccanico. Anche se un CBC è stato eseguito in entrambi la linea di base prima della ferita e al momento del sacrificio, gli investigatori possono aggiungere che più sangue disegna come riconosciuti nei loro protocolli animale per ulteriori analisi. Verifica con l'impianto per quanto riguarda volumi e requisiti di consegna per le loro attrezzature. - Preparare una siringa eparinizzata 2ml di riempitivo e copertura della siringa il giorno della procedura per l'analisi di gas del sangue al momento del sacrificio.
Nota: Controllare con l'impianto per quanto riguarda volumi e requisiti di consegna per le loro attrezzature.
2. occlusione dell'arteria carotica canini
- Pesare un adulto (> 18 mesi) cane beagle e pre-Medicare con acepromazina intramuscolare (0.025-,2 mg/kg) seguita da un'iniezione intraperitoneale iniziale di ketamina (5-20 mg/kg) e midazolam (0.01-.25 mg/kg). Inducono anestesia profonda con 1-5% isoflurane basata sulla frequenza cardiaca, respirazioni e tono della mascella.
Nota: Anestesia esatta è dettata dal peso e il protocollo approvato animale. Anche se le iniezioni possono provocare dolore per gli animali, la durata di questo disagio sarà minima (meno di 3 s). - Prima di prendere l'animale alla tabella di chirurgia, rimuovere i capelli di residuo della potatura meccanica. Applicare il lubrificante unguento oftalmico agli occhi dell'animale anestetizzato per prevenire la secchezza.
- Posizionare l'animale in posizione supina usando un sistema di posizionamento e attaccare elettrocardiografia (ECG) conduce al piede pastiglie. Intubare attraverso la trachea con un tubo endotracheale di 6,5 mm con risvolto, meccanicamente ventilare a 14 respiri/min e mantenere ogni cane con un'inalazione continua di isoflurane 1-5% (dipende dal protocollo approvato animale).
- Per determinare l'entità della canalizzazione della carotide e la lunghezza dell'embolo occlusivo, eseguire l'angiografia prima lesione, prima di MRI e al tempo del sacrificio (Vedi sotto per ulteriori istruzioni).
- Inserire una guaina arteriosa femorale e un catetere di plastica e fissare con una sutura 0-seta sciolta. Chiudere temporaneamente la guaina e il catetere durante il trasporto e gli studi di imaging. Vedi angiografia canino sotto per ulteriori istruzioni).
- Per sangue pareggi, inserire un catetere endovenoso 16 x 45 millimetri attraverso la pelle intatta distale della guaina arteriosa femorale tagliare giù il sito. Far avanzare il catetere nell'esposizione chirurgica e visualizzarla come entra nella vena femorale esposta immediatamente adiacente alla guaina arteriosa. Una volta pienamente inserito nella vena, ritirare l'ago, il catetere con un rubinetto a 3 vie di cap e sciacquarlo con 2 mL di soluzione sterile salina 0,9%. Fissare il catetere alla cute con una sutura 0-seta.
- Fare un'incisione di 8-10 cm di pelle direttamente sulla parte superiore della regione dell'arteria carotica comune di destra e sezionare la fascia per isolare il vaso dal tessuto circostante.
- Introdurre con cautela il forcipe tra la carotide e il nervo vago per separare. Evitare di toccare l'arteria carotica più del necessario in quanto può causare costrizione della nave.
- Asciugare l'area esposta dell'arteria con la garza sterile per evitare la diluizione soluzione di FeCl3 .
- Posto il Doppler flusso sonda intorno la carotide permettendo ambio spazio avvolgere il nastro ombelicale intorno la carotide senza toccare la sonda di flusso e iniziare a registrare la velocità di sangue e continuare durante tutta la procedura (Figura 1 Top). Registrare il flusso basale per ~ 5 min prima di applicare il nastro ombelicale.
Nota: Flusso basale prima del posizionamento di FeCl3 nastro ombelicale solitamente medie circa 250 mL/min. - Avvolgere il preparato FeCl3 nastro ombelicale la carotide utilizzando una pinza emostatica immediatamente sotto la sonda di flusso senza toccarlo per 15 minuti, rimuovere e scartare.
Nota: L'occlusione viene designato come zero flusso mL/min. - Stabilizzare l'embolo occlusivo per 45 min. Aggiungi ulteriori saline alla sonda secondo necessità per mantenere un segnale.
Nota: A seconda dell'età, sesso e il tipo di canini, ulteriori posizionamenti del preparato FeCl3 nastro ombelicale potrebbero essere necessari per consentire di 30 min per l'occlusione si verifica prima di ri-applicazione. Sono state osservate differenze nella trombosi da applicazione di cloruro ferrico con sesso in cani da lepre. Non è stato trovato necessario con questo modello per riapplicare un fresco FeCl3 nastro ombelicale più di una volta e mai hanno deviato dal protocollo di preparazione di FeCl3 nastro ombelicale. Se il laboratorio sta usando una razza diversa o età del canino, FeCl3 nastro ombelicale dovrebbe applicarsi ai soggetti iniziali per assicurarsi che il protocollo di trombosi non si discosta, o un gruppo di canini può essere necessario stabilire FeCl3 tempo di applicazione per tale razza o età nel loro studio specifico. I tempi di occlusione, in questo esperimento, vanno da 8-30 min dopo l'applicazione di nastro ombelicale di FeCl3 . - Per determinare il volume ictus o emorragia oltre agli eventi tromboembolici a valle che può derivare da interventi farmacologici, trasporto canini con iniezione di ketamina aggiuntive a una macchina di risonanza magnetica (Vedi sotto per ulteriori elaborazioni).
- Mentre ancora era sotto un piano profondo chirurgico di anestesia da un finale angiogramma/MRI (Vedi sotto per imaging protocol), indicato da una mancanza di risposta agli stimoli nocivi, raccogliere il sangue intero desiderato per un'analisi successiva, quindi aprite la cassa tagliando attraverso le costole a partire dallo sterno e accise cuore tagliando i vasi sanguigni (dissanguamento).
Nota: In questo esperimento, sangue intero (< 10 mL) è stato disegnato al basale, 5 min dopo la somministrazione di agente e 60 min dopo l'infusione dalla guaina femorale e ho visto alcun effetto sul processo di trombolisi. A sacrifice, un volume illimitato può essere disegnato per deposito aggiuntivo al plasma se approvato nel protocollo animale. Analizzare, elaborare e archiviare tutti i sangue intero entro 30 min di sacrificio. Garantire che sangue non viene disegnata oltre la percentuale approvata del peso corporeo dell'animale come dettagliato sul protocollo animale approvato. Tutti gli esperimenti descritti erano mancato recupero. - Sciacquare il cuore con soluzione fisiologica allo 0,9% e flash congelare campioni nell'azoto liquido, se lo si desidera.
- Prima di rimuovere le carotidi, misurare la lunghezza di coagulo ponendo un righello accanto e record. Posizionare l'indicatore del tessuto al centro del grumo e allo stesso posto sulla carotide controlaterale per facilitare il taglio di istologia. Contrassegnare la carotide controlaterale alla stessa lunghezza.
Nota: La lunghezza media del coagulo con questo modello è 1,75 cm. - Rimuovere l'intera lunghezza del grumo su entrambe le navi e fissare in formalina al 10%. Rimuovere la carotide controlaterale entro la lunghezza segnata dal marcatore tessuto. Dimezzare l'arteria carotide controlaterale al centro del grumo. Flash congelare metà della carotide controlaterale in azoto liquido per un'analisi successiva e fissare l'altra metà in formalina al 10% per incorporare accanto la carotide ferita per analisi istologica qui sotto.
- Rimuovere gli organi per qualsiasi analisi desiderata, sciacquare con soluzione fisiologica allo 0,9% e freeze flash in azoto liquido.
- Rimuovere il cranio con una sega circolare dell'osso. Rimuovere lentamente il cranio senza danneggiare il cervello sotto.
- Dopo che il cervello è rimosso dal cranio, sciacquare con soluzione fisiologica 0,9% freddo e tagliare due sezioni di 4 mm dal centro del cervello, taglio lateralmente con un bisturi affilato. Una delle sezioni 4 mm inserire 2% TTC per delimitazione ischemico (Vedi ulteriori elaborazioni per cervello TTC), mentre l'altra fetta inserito in formalina al 10% per 7 giorni per H & E che macchia (Vedi ulteriore elaborazione per cervello H & E).
3. Canino angiografia
Nota: Questo è illustrato nella Figura 2 ed è fatto durante l'intervento chirurgico al tempo punti di interesse.
- Sentire il polso della regione inguinale destra e praticare un'incisione sagittale ventrale di 3-5 cm.
- Esporre l'arteria femorale e separarlo dai tessuti circostanti mediante dissezione smussa.
- Utilizzare una pinza emostatica ad angolo retto per collocare una sutura 0-seta intorno all'estremità distale dell'arteria esposta.
- Legare la sutura 0-Seta distale e applicare leggera tensione all'arteria fissando le estremità allentate 0-seta sutura alla pelle con emostatiche.
- Posizionare una seconda sutura 0-seta intorno all'estremità prossimale del segmento esposto.
- Forare la midway arteria tra i legami di sutura 0-seta prossimale e distale usando un ago introduttore da 18G per passare un filo guida nell'arteria.
- Caricare un assemblato 6Fr guaina e dilatatore sul filo guida, afferrare il filo che esce dall'assembly.
- Avanzare il dilatatore e la guaina sul filo guida. Assicurarsi di mantenere una solida conoscenza del filo come si sporge dal dilatatore mentre si fa avanzare il dilatatore di guaina.
- Dopo l'inserimento completo, legare la sutura prossimale 0-seta intorno alla guaina per mantenere l'emostasi presso il sito di puntura arteriosa.
- Allo stesso tempo rimuovere il dilatatore e il filo guida.
- Aprire la valvola unidirezionale per verificare la presenza di flusso sanguigno pulsante e a filo con 3-5 mL di soluzione fisiologica normale.
- Collegare la valvola unidirezionale di guaina di accesso ad un fluido riempito prolunga collegata ad un trasduttore di pressione per misurazioni di pressione sanguigna invasiva di monitorare e registrare.
- Pre-caricare un filo guida da 0,35" in un catetere angiografico 4Fr. e collegare al collettore di iniezione di contrasto impostato con un adattatore a y Tuohy.
- Tirare la punta del filo guida appena dentro la punta distale del catetere e svuotare tutta l'Assemblea con soluzione fisiologica.
- Inserire il catetere angiografico la valvola emostatica della guaina e quindi far avanzare il filo guida circa 5 cm oltre la punta distale del catetere.
- Sotto guida fluoroscopica e utilizzando un approccio trans-aortica retrogrado, far avanzare lentamente il catetere nell'arco aortico.
- Iniettare 2-3 mL di contrasto agente diluito 1:1 con soluzione salina per identificare il decollo del tronco brachiocefalico.
- Utilizzare il filo guida per dirigere il catetere nel tronco brachiocefalico e poi in modo selettivo nell'arteria carotica comune di destra.
- Rimuovere il filo guida e iniettare 2-3 mL di contrasto diluita per verificare che il catetere viene inserito nella carotide.
- Iniettare 3-4 mL di contrasto non diluito durante la registrazione di esecuzioni angiografiche utilizzando sia sottrazione digitale e tecniche angiografiche standard.
- Ripetere i passaggi da 3,18-3.21 per l'angiografia ripetuta a intervalli di tempo aggiuntivo.
4. risonanza magnetica - Diffusion Weighted Imaging (DWI) e T2 ponderata (T2WI) di imaging del cervello canino
Nota: Questo è mostrato in Figura 3A-3B.
- Assicurarsi che il cane sia in anestesia profonda.
- Verificare che i parametri fisiologici del cane sono monitorati durante la formazione immagine compreso ECG e la frequenza cardiaca.
- Assicurarsi che il cane è sdraiato in posizione supina con la testa nelle aperture bilaterali della bobina del cervello.
- Attivare il magnete di 3 Tesla (3T).
- Eseguire appesantite T2 imaging (T2WI), una sequenze di impulsi di base nel MRI.
Nota: La sequenza utilizza le differenze nel tempo di rilassamento T2 dei tessuti alle diverse condizioni patologiche. - Effettuare localizzatore imaging per acquisire immagini pilota di un cervello di cane prima l'imaging anatomico utilizzando Eco di pendenza T2-weighted sequenza di imaging e di determinare il campo visivo (FOV), numero di fette e spessore della fetta a coprire completamente il cervello.
- Utilizzare i seguenti parametri di T2: affettare spessore = 3mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, matrice di acquisizione = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixel, risoluzione dell'immagine = 2,4615 pixel per mm.
- Eseguire imaging di diffusione appesantita (DWI) utilizzando la sequenza di eco pialla DTI 4 h dopo l'occlusione del MCA e immediatamente prima del sacrificio.
- Utilizzare i seguenti parametri di DWI: b = 1.500 s/mm2, spessore = 3mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, matrice di acquisizione = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, risoluzione dell'immagine = 0.9333 pixel/mm (tabella 1).
5. ematossilina ed eosina (H & E) colorazione del cervello canino
Nota: Questo è mostrato in Figura 3D.
- Dopo 7 giorni in formalina al 10%, è necessario incorporare le sezioni del cervello di 4mm in paraffina.
- Tagliare i blocchi di paraffina fino a quando sono di livello con un microtomo, rimuovendo eventuali ulteriore paraffina dalla parte superiore del tessuto cerebrale, quindi tagliare il tessuto cerebrale a 4 µm e posizionare una sezione del cervello su ogni diapositiva pollici 2 "x 3".
Nota: Prima della colorazione, inserire tutte le soluzioni in contenitori separati affinché diapositive possono essere spostati da una soluzione a altra senza seccare. - De-paraffinize ogni diapositiva di cervello e idratare con acqua del rubinetto.
- Posizionare ogni diapositiva di cervello in ematossilina 560 per 8 min.
- Sciacquare ogni diapositiva di cervello in acqua di rubinetto.
- Differenziare ogni diapositiva di cervello con 1% acido alcol per 1 s tre volte.
- Sciacquare ogni diapositiva di cervello in acqua di rubinetto.
- Blu ogni diapositive di cervello con idrossido di ammonio 1% per 1 s.
- Sciacquare ogni diapositiva di cervello in acqua corrente per 2 min.
- Disidratare ogni diapositiva di cervello in 70% etanolo (EtOH) per 1 s dodici volte.
- Colorante di contrasto ogni diapositiva di cervello in eosina per 1 min.
- Disidratare ogni diapositiva di cervello nel 95% EtOH per 1 s dodici volte.
- Disidratare ogni diapositiva di cervello in 100% EtOH.
- Cancellare ogni diapositiva di cervello in xilene e quindi applicare un 2 "x 3" pollici vetrino coprioggetto sopra la diapositiva di cervello, rimozione di bolle d'aria con mezzi di montaggio resinoso.
Nota: Tutte le soluzioni vengono riutilizzate ad eccezione di acqua ed etanolo per più giorni di macchiatura e più diapositive. Tutte le elaborazioni dopo sezioni del cervello sono disposti su diapositive sono fatte in vetro vaschette per colorazione, ma colorazione contenitori in plastica sono disponibili in commercio anche. Sostituire qualsiasi soluzione quando esso si scolorisce e tenerli ben coperti.
6. ematossilina ed eosina (H & E) macchiatura delle carotidi canini
Nota: Questo è mostrato in Figura 1 (a sinistra).
- Dopo 24-72 h in formalina al 10%, tagliato la carotide ferita a metà a metà del grumo e incorporare ~ 1cm della carotide feriti e ~ 1 cm del controllo controlaterale nella stessa cassetta di paraffina.
Nota: Il coagulo di sangue all'interno la carotide è fragile. Attendere fino a quando il vaso è stato risolto in formalina al 10% prima del taglio, così che il coagulo non è disturbato. L'incorporamento di entrambi i feriti e controllare le arterie carotiche nella paraffina stessa blocco permetterà taglio allo stesso tempo nello stesso luogo nel vaso sanguigno. - Tagliare blocchi di paraffina fino a livello con un microtomo, rimuovendo eventuali ulteriore paraffina. Quindi tagliare sezioni a 4 µm a 25 x 75 mm x 1 diapositive mm senza ruotare il blocco di paraffina in modo che le sezioni di carotide controlaterale sono collocate nella parte superiore della diapositiva.
Nota: Tre sezioni carotiche sono stati collocati su ogni diapositiva, ma si può aggiungere dipendendo macchie di interesse. - De-paraffinize ogni diapositiva carotica e idratare in acqua di rubinetto.
Nota: A differenza dello scivolo di cervello che deve essere elaborato individualmente, carotiche diapositive possono essere elaborate in massa inserendo nei vasetti che misura diverse diapositive alla volta senza toccare un l'altro. - Macchia di ogni diapositiva carotica in ematossilina per 8 min.
- Sciacquare ogni vetrino carotica in acqua di rubinetto.
- Differenziare ogni diapositiva carotica con 1% acido alcol per 1 s tre volte.
- Sciacquare ogni vetrino carotica in acqua di rubinetto.
- Blu ogni diapositiva carotica con idrossido di ammonio 1% per 1 s.
- Sciacquare ogni diapositiva carotica in acqua corrente per 2 min.
- Disidratare ogni diapositiva carotica in 70% EtOH per 1 s dodici volte.
- Colorante di contrasto ogni diapositiva carotica in eosina o 1 min.
- Disidratare ogni diapositiva carotica in 95% EtOH per 1 s x 12.
- Disidratare ogni diapositiva carotica in 100% EtOH.
- Deselezionare ciascuna diapositiva carotica in xilene e aggiungere un coprioggetto 24 x 50 mm con supporti di montaggio resinoso per rimuovere le bolle d'aria.
7. 2, 3,5-Trifenil-2h-tetrazolio cloruro (TTC) la macchiatura del cervello canino
Nota: Questo è mostrato in Figura 3.
- Posto l'altra sezione di 4 mm rimosso dal centro del cervello immediatamente prossimale alla sezione H & E in precedenza preparato 2% TTC (occlusione dell'arteria carotica). Incubare al buio a 37 ° C per almeno 20 minuti, girando sopra la sezione del cervello per la macchiatura anche ogni 5 min.
Nota: Dopo 20 min, la sezione dovrebbe essere ciliegia rossa su entrambi i lati. Tempo supplementare può essere necessaria basata sulla freschezza TTC e lo spessore della sezione del tessuto. - Rimuovere la soluzione TTC e sostituirlo con paraformaldeide al 4% in PBS, pH 7.4 per ottimizzare il contrasto di colore.
- Quando il contrasto tra bianco e rosso colorazione è ottimo, posizionare fette del cervello TTC tra fogli di plastica trasparente, a secco di liquidi in eccesso e scansione ad alta risoluzione per l'analisi delle regioni ischemiche.
Nota: Sezioni possono essere memorizzati indefinitamente in soluzione di paraformaldeide, ma colorazione svanirà.
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Representative Results
Seguendo le procedure dettagliate nel presente documento si tradurrà nello sviluppo di un modello che può essere utilizzato per la valutazione del profilattico o trombolitico degli interventi arteriosi occlusivi. Figura 1A Mostra velocità di flusso basale e la velocità di flusso sanguigno risultante prima, durante e dopo il trattamento registrati da un software commerciale. Dati da questa registrazione possono essere utilizzati per determinare la percentuale di ri-perfusione con lesione dell'arteria carotica e trattamento in questo modello canino. Figura 1B fornisce un esempio del controlaterale (in alto) e feriti (in basso) canini carotica sezioni colorate con H & E che verifica lo stato di ri-canalizzazione al momento del sacrificio. Una moltitudine di programmi software sono disponibili per analizzare la zona irrorata del vaso tracciando il vaso sanguigno (senza trombo) che può essere diviso per la superficie totale della nave per arrivare a una percentuale di canalizzazione con ogni trattamento. La figura 2 Mostra diversi esempi di angiografia dell'arteria carotica dettagliate in questo protocollo che può essere utilizzato per determinare se il trombo è occlusivo di imaging di Canino. Inoltre, usando la sonda di flusso quadrati come indicatore, gli investigatori possono determinare la lunghezza dell'embolo in ciascun punto di tempo che l'angiogramma è preso. Anche se, qui abbiamo presentato immagini prima lesione, 60 min dopo trattamento del veicolo e al momento del sacrificio, il ricercatore è in grado di adattare alle loro esigenze di formazione immagine. Nella figura 3 è il risultato dei parametri di imaging magnetici applicato al cervello canino ~ 4 h dopo l'occlusione dell'arteria carotica immediatamente prima del sacrificio, utilizzando sia la diffusione ponderato (Figura 3A) e T2 weighted imaging (Figura 3B) dettagliata nella sezione 4 del presente protocollo. Anche se abbiamo solo mostrare una foto dell'intera matrice presa a diversi livelli nel cervello, la dimensione del volume l'emorragia ed il colpo può essere identificata in diversi livelli e aree del cervello e quantificata in ciascun punto di tempo desiderato dallo sperimentatore. La quantificazione viene completata utilizzando lo specifico software di macchina di MRI specifico dispositivo di imaging dello sperimentatore. Il TTC risultati di colorazione, come mostrato nella Figura 3 può essere utilizzato per delineare il tessuto cerebrale in cui le cellule sono ancora metabolicamente attive oltre a quelli che non sono. TTC sarà ridotto enzimaticamente per risultare cellule vive macchiate rosse mentre le cellule morte non manterrà il TTC e così non sarà rosse. Infine, l'ematossilina ed eosina tecnica dimostrata nel cervello canino in Figura 3D si tradurrà in globuli rossi di colorazione rosso brillante che può essere utilizzato per verificare le aree dove si è verificato l'emorragia.
Figura 1: monitoraggio del flusso sanguigno carotico. (A) velocità di sanguigno rappresentativo dell'arteria carotica (mL/min) registrato da Doppler sonda dalla linea di base prima della ferita attraverso il sacrificio. (B) rappresentante H & E colorazione di entrambi ha occluso dell'arteria carotica (in basso) e controllo controlaterale (in alto). L'ingrandimento è a 20x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: monitoraggio del flusso sanguigno carotico da angiografia. Vista di angiografia rappresentativo della carotide destra canini. Immagini sono state scattate alla linea di base prima dell'infusione di veicolo (A), 60 min dopo l'infusione del veicolo (B)e al momento del sacrificio, 4.5 h dopo l'occlusione (C). Le frecce rosse indicano la posizione della nave di FeCl3-ha indotto la lesione dove è stato posizionato il nastro ombelicale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: immagini rappresentative del cervello canino dopo trattamento del veicolo. Imaging a risonanza magnetica (MRI) eseguita ~ 4 h dopo l'occlusione, immediatamente prima del sacrificio, utilizzando imaging di diffusione appesantita (DWI, (A) e T2 appesantito la formazione immagine (B). TTC macchiatura della sezione mediale al momento del sacrificio di delineare in diretta dal tessuto morto (C). H & E macchiatura della mediale sezione, immediatamente prossimale alla sezione TTC, al momento del sacrificio per delineare il tessuto che sono metabolicamente attivo (rosso) da quelli che non sono TTC è ridotta a un prodotto rosso quando preso da cellule vive e di conseguenza, si tradurrà in sezioni che possono essere quantificati con una moltitudine di software per traccia live regioni morto vs. (D). fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametro sperimentale | T2-weighted | Diffusion weighted |
| Ripetizione di tempo (TR) ms | 4000 | 4600 |
| Echo time (TS) ms | 75 | 86 |
| Angolo, gradi di vibrazione | 180 | 90 |
| Matrice di acquisizione | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Numero di medie | 2 | 4 |
| Nella risoluzione sul piano immagine (pixel/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tabella 1: parametri di Imaging a risonanza magnetica (MRI). Parametri di MRI che sono stati sviluppati per canini T2 - e diffusione-appesantita immagini per massimizzare per valutazione di misurazione del volume ictus e l'emorragia nel modello di trombosi dell'arteria carotica canini.
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Discussion
Il modello di lesione vascolare indotta di FeCl3 è ampiamente usato per studiare le trombosi nei piccoli animali ed è facile da tradurre in un modello animale, pre-clinico grande con una moltitudine di vantaggi. Lievi modifiche per adattare il protocollo in un canino consentono l'utilizzo di entrambi la risonanza magnetica per valutare i volumi di ictus e l'emorragia dopo un intervento farmacologico e l'angiografia per valutare la canalizzazione di nave prima, durante, e dopo il trattamento. Altri modelli animali grandi trombotici non hanno studiato stabilizzati trombi occlusivi presso il sito della ferita e pertanto non è possibile utilizzare l'angiografia e l'istologia dell'arteria carotica per valutare l'entità di ri-canalizzazione per ogni profilattico o trombolitici trattamento. Oltre ai vantaggi di un animale di grandi dimensioni che comprendono un ampio tessuto per l'analisi (plasma, urina, organi per gli studi di tossicità, ecc.), il grande modello animale imita molto più molto attentamente la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna e la cascata di coagulazione in esseri umani rispetto ai modelli del roditore. Dimensioni adeguate delle arterie carotide sia il cervello, risultato in materiale istologico e biologico che possa essere utilizzato per una pletora di indagini infiammatorie e biochimiche su ogni animale sperimentale. Un altro vantaggio di modificare il FeCl3-modello vascolare indotto in un canino è che un maggiore volume di sangue può essere estratta durante l'esperimento senza modificare la reattività o embolo PIASTRINOGENESI tali che il sangue di gas e sangue completa conteggi possono essere monitorati per tutta la ferita e la droga infusione. Inoltre, il pregiudizio di cloruro ferrico è stato attribuito al danno dell'ossidante; Pertanto, esso sarà imitare danno aterosclerotico che precede molto più strettamente di quanto pubblicato gli altri tipi di lesione arteriosa modelli7clinica dell'ictus e infarto miocardico. Infine, interventi meccanici quali thrombectomy, che sono abitualmente utilizzati clinicamente, possono seguire trattamento farmacologico in modo che re-stenosi e lo stato della salute endoteliale della parete possono essere affrontate con un ampio tessuto istologico per multiplo indagini sul canino stesso.
Limitazioni di questo modello sono poche ma devono essere considerati. Primo, anche se il punto di tempo e il trattamento scelto in questa pubblicazione (sacrificare 4,5 h dopo la lesione dell'arteria carotica, veicolo) non ha provocato un ictus misurabili o emorragia, questo metodo è clinicamente rilevante per l'indagine del romanzo anti-trombotica e agenti trombolitici per determinare l'efficacia e dosaggio. Infatti, sia il colpo e/o emorragia con l'iniziale trombotica insulta o con trattamento farmacologico (cioè, rTPA) si verificano con questo modello. In secondo luogo, canini costi per l'acquisto, spedizione, manipolazione genetica e diaria sono piuttosto elevati e costano proibitivi, fino a quando un farmaco è ben caratterizzato nei modelli del roditore.
Fasi critiche al centro del protocollo sull'attivazione piastrinica, aggregazione e adesione, il nocciolo della trombosi. Poiché l'analizzatore di funzione della piastrina (PFA-100) possono essere eseguita con 1600 µ l di sangue intero in duplice copia, questo metodo è semplice e facile tenere traccia di reattività piastrinica durante tutta la procedura senza alterare l'omeostasi sanguigna. Ulteriori studi ex vivo in attività piastrinica tramite impedenza o lumi-aggregometria possono essere eseguiti prima ferita vascolare senza intaccare la trombosi sperimentale finché l'ultimo prelievo è > 1 settimana prima dell'intervento chirurgico oltre a dopo la ferita e trattamento al momento del sacrificio. Come precedentemente discusso, applicazioni aggiuntive del nastro ombelicale imbevuto di 50% FeCl3 può essere necessario a seconda di sesso, razza, o l'età di ogni cane. Abbiamo consentito 30 minuti dopo la ferita per l'occlusione e ri-applicato fresco 50% FeCl3 per un altro 15 min se necessario. Questo processo non ha provocato una differenza significativa nella deviazione trombolitica con età o sesso utilizzando beagles adulto. In questo studio, abbiamo Abbiamo delucidato la diffusione critica e state-of-the-art ponderata (DWI), la formazione immagine a risonanza magnetica basata sulla misura del moto browniano (diffusione casuale delle particelle) di molecole d'acqua all'interno del voxel di tessuto. Questa tecnica è utile nella rilevazione del colpo ischemico acuto tra altre patologie quali tumori da risultati diffusione nei tessuti iper-cellulare o quelli con il gonfiamento cellulare è basso con maggiore diffusione coefficiente17,18 ,19. Mappe di diffusione variano con la diffusione delle molecole di acqua nel cervello del tessuto17,18,19. Il valore-B misura il gradiente per la diffusione delle molecole di H2O. Nel sito di lesione ischemica l'acqua gratuita esperienze più forte attenuazione del segnale a più alti valori di B19.
Oltre all'utilizzo di questo protocollo canino per studi a dosaggio, la tossicità e l'efficacia di agenti profilattici e trombolitici, la dimensione di un canino fa esperimenti in thrombectomy meccanico clinicamente rilevanti e facilmente realizzabile. Carotidi possono essere facilmente lavorati, macchiato e valutate utilizzando protocolli per l'istologia umana per lo studio dell'infiltrazione delle cellule immuni dopo ricupero del coagulo. Questi studi sarà la nostra prossime protocolli dettagliati.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il centro per Cognitive e comportamentali Brain Imaging presso la Ohio State University per il loro sostegno finanziario e scientifico sviluppare ed eseguire canini per risonanza magnetica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
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