Summary
大型動物の血管損傷モデルの利用にも特徴とし、一般的に使用される小さな動物塩化第二鉄誘起 (した FeCl3) 頚動脈損傷モデルに必要な変更を紹介します。予防、血栓溶解の薬理学的・機械的介入の前臨床試験評価のため、結果として得られるモデルを利用できます。
Abstract
世界的に、毎年、虚血性脳卒中や心筋梗塞につながる閉塞性動脈血栓症が 1300 万の死に貢献します。ここでは、我々 は大規模な動物 (犬) に予防や血栓溶解剤の前臨床スクリーニングのため使用することができますわずかな修正と小動物から血管損傷モデルを翻訳しています。手術方法に加えては、修正されたプロトコルは、脳と頚動脈を確認する組織学的解析のための頚動脈の両方を処理するための詳細な手順について、血管造影による頸動脈運河を評価するためにステップバイ ステップ方法をについて説明します。運河と、脳出血や磁気共鳴画像 (MRI) を用いて下流の血栓塞栓イベントの評価を完了するための特定のパラメーター。さらに、大規模な動物 (犬) の血管損傷に翻訳する必要以前老舗の小さな動物モデルから特定の手順の変更を説明します。
Introduction
主な理由は心血管系疾患での介入は薬物療法と血管内治療介入1によく反応が主、脳卒中治療は冠動脈疾患治療後モデル化します。これらの治療法は、しかしが適切に変換できなかった脳梗塞に。現在の脳卒中治療の難しさは、遺伝子組換え組織プラスミノーゲン活性化因子 (当社) が逆ことはできませんと出血性変換2,3,の重大な 6.4% リスクを管理に運ぶ4. 結果罹患率と死亡率はしばしば実現不可能の小さいウィンドウ5の使用を制限します。また、閉塞と再狭窄発生初期の神経学的改善を逆転させる初期の血栓溶解療法後しばしば。要約すると、虚血性脳血管障害の侮辱に苦しむ患者の大多数 (~ 90%) を除く当社を管理する狭い時間窓があります。
静脈内投与の抗血小板療法の役割は、改良された血管再開通、生存の結果2と虚血性脳卒中の治療に約束を示しています。残念ながら、これらの薬内頭蓋と余分な頭蓋内出血の予測可能な副作用を持って、主な理由は十分にする方法はありませんが逆にまたは彼らの活動2を制御します。血小板凝集を防止に効果的な中の出血とその活動を逆にすることができないリスクが脳卒中患者ケア ルーチンでの使用を排除します。必要がある、したがって、単独または組み合わせを防止し、血栓を溶解する作用はまだ出血が容認されて悪い、脳など閉鎖、低ボリュームの領域で使用できるようになります安全性プロファイルを持っている強力な抗血栓薬の存在します。
動脈血栓症と再狭窄のメカニズムを理解し、血栓溶解剤との再狭窄を防ぐ薬の評価は、前臨床試験の医薬品開発の一部として両方の小規模および大規模な動物モデルを必要があります。塩化第二鉄による血管障害は迅速かつ正確には、マウス、ラット、モルモット、露出血管の血栓の形成を誘導するために広く利用技術、ウサギ6,7,8,9,10,11,12. これらの小さい種が遺伝的操作、安価な動物購入および低日当住宅費の使いやすさを含むいくつかの利点を提供します。残念ながら、小動物実験は、術中アクセス血小板反応性、血液ガス分析、および炎症性応答に複数の血の描画を否定します。もっと重要なは、大型の動物は大いにもっと密接にひと血小板生理6,13を模倣します。血栓症の病態生理の研究、新規抗血小板剤や抗凝固薬の検証および潜在的な血栓溶解剤6の発見した FeCl3頚動脈損傷モデルは支配的な役割を果たしています。,7,8,9,10,11,12です前モデルのマウス、ラット、モルモット、ウサギは、使いやすさと遺伝的操作の柔軟性を提供している、翻訳可能な前臨床モデル、潜在的な治療6 の患者の投与と毒性の研究に重要な。 ,13。血栓性疾患のいくつかのモデルは、マウス、血栓症の末梢血管疾患に適用される大型の動物モデルで開発されている心筋梗塞や脳卒中はいくつかと遠い。猿、犬、豚で最初の血栓症モデルは狭窄、船舶、一般流の周期性削減14,15,16の結果に止血剤と後シリンダーを適用することに焦点を当てた。塩化第二鉄のモデルのように血管内皮細胞障害のサイトにて閉塞性血栓、代わりにこれらのモデル内の血栓は繰返し血栓症、遠位部塞栓に起因した、通常の血流に戻る。比較では、塩化第二鉄モデル大型動物は、損傷部位の閉塞血栓の結果でここで変更安定化及び血栓溶解治療前に血管造影を行いです。Diem、イヌ科動物および十分な外科的専門知識の購入あたり私たちの詳細ここで血栓症を手術、イメージングおよび組織学的利用を研究する研究所を許可するように血管損傷の大きい犬モデルの調査官が潤沢な資金供給を持ってテクニック。
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Protocol
記載されている調査はケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドラインに準拠し、オハイオ州立大学機関動物ケアおよび使用委員会 (#2015A00000029) によって承認されました。深麻酔下ですべての手術操作を行ったし、動物がプロシージャの間に任意の段階で痛みを経験しなかった。説明すべての実験は、非回復でした。
1. 準備
- 新鮮な 50 mL の脱イオン水で希釈した 50% (w/v) で塩化第二鉄 (した FeCl3) を準備します。
- 臍帯テープを 5.5 cm に切るし、作りたての 50% した FeCl3ソリューションの手順の前に 1 週を浸します。
注: 使用される臍帯テープは厚いと 50% した FeCl3溶液を吸収するいくつかの時間がかかります。 - 各犬は、手術前に一晩を高速です。
- クリオバイアル血漿および尿のコレクションのため、すべての臓器保存用 50 mL 滅菌遠心管、H & E 染色動物の個体識別, 生年月日, 年月日手術、及び治療の脳と頚動脈の固定のための 10% ホルマリン容器にラベルを付けます。
- 各犬のプロシージャの各溶液 100 mL を準備: バッファー 4% のパラホルムアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) 10% 中性ホルマリンと 2% 塩化 2,3,5 トリフェニルテトラゾリウム [PBS (pH 7.4) で TTC を暗闇の中で保存]。
- すべてクリオバイアルの十分な液体窒素および 50 mL 組織チューブ フラッシュ凍結手術の日を取得します。
- 興味の時間ポイントごとにそれぞれの犬の PFA 100 (血小板機能アナライザー) 血小板反応性の 2 つの ADP/コラーゲン カートリッジを取得します。
- 1 つ 4.5 mL クエン酸ナトリウム採血管、プラズマ分離そして貯蔵のための犠牲の前に各血液を取得します。犠牲でプラズマ ストレージ 16 採血管を描画します。各採血管がいっぱい、4,000 x g 30 でスピン クリオバイアルに多血小板血漿と転送を分離するクリア層。フラッシュは-80 ° C で保管する前に液体窒素で凍結します。
- 1 つ 4.5 mL リチウム ヘパリン採血管、レコード血小板反応性に関心の各 PFA 100 時間ポイントを取得します。各血液で血小板反応性に従う気泡なし各 ADP/コラーゲン カートリッジに、リチウム ヘパリン採血管から 800 μ L の全血を導入します。
- ベースライン時および犠牲の時に完全な血計算 (CBC) の 2 EDTA K3 採血管 (無水 edta の血液 1 mL あたり 1.8 mg) を取得します。
注: このボリュームは、各 2 回の機械的なエラー場合を実行するほとんどの中核施設に適しています。CBC は、怪我する前に両方のベースラインに、犠牲の時に実行された、捜査官は、追加の分析のための動物のプロトコルで承認されたとしてより多くの血液を描画します追加できます。ボリュームや、機器の納期の要求として施設に確認してください。 - 2 mL のヘパリン注射を準備するには、充填と血液ガス分析のプロシージャの日犠牲の時間に注射器をコーティングします。
メモ: は、ボリューム、納期、機器の設備を確認します。
2. 犬の内頚動脈閉塞症
- 大人の重量を量る (> 18 ヶ月) ビーグル犬と事前に筋肉アセプロマジンと薬 (0.025-.2 mg/kg) ケタミン (5-20 mg/kg) とミダゾラムの初期の腹腔内投与が続く (0.01-.25 mg/kg)。心拍数、呼吸、および顎の調子に基づいて 1-5% イソフルランと深い麻酔を誘導します。
注: 正確な麻酔は、重量および承認された動物のプロトコルによって決まります。動物のための苦痛で、注射がありますがこの不快感の持続時間が最小限に抑えられます (未満 3 s)。 - 手術テーブルに動物を撮影する前にクリップで髪を削除します。乾燥を防ぐための麻酔下の動物の目に眼軟膏を潤滑油に適用します。
- 測位システムを使用して仰臥位に動物を入れ、足に心電図検査 (ECG) リードを添付パッド。6.5 mm かふ付け気管内チューブを気管を通して挿管、機械的に 14 呼吸/分、換気および 1-5% イソフルラン (承認された動物のプロトコルに依存) の連続的な吸入とそれぞれの犬を維持します。
- 頸動脈の運河と閉塞性血栓の長さの範囲を決定するには、傷害、MRI の前に、犠牲 (の詳細については下記参照) の時の前に血管造影を行った。
- 大腿動脈鞘とプラスチック製のカテーテルを挿入し、緩い 0 シルク縫合糸で固定します。一時的に画像検査や輸送中にシースとカテーテルを閉じます。追加の指示の下犬血管造影を参照)。
- 血液を描画します、そのままサイトを減らす大腿動脈鞘の遠位の皮膚を通して 16 × 45 mm の静脈のカテーテルを挿入します。手術手技にカテーテルを進めるし、むき出しの大腿静脈動脈鞘に隣接に入るとそれを視覚化します。静脈に挿入されると完全に、針を撤回、三方活栓とカテーテルのキャップ、2 ml の 0.9% 生理食塩水のフラッシュします。0 絹糸縫合で皮膚にカテーテルを固定します。
- 右の内頚動脈領域の上に直接皮膚の 8-10 cm の切開をして周囲の組織から血管を分離する筋膜を解剖します。
- 慎重に頚動脈とを分離する迷走神経の鉗子をご紹介します。頸動脈の血管収縮を引き起こす可能性があります必要以上に触れないでください。
- 乾燥した FeCl3ソリューション希釈を避けるために滅菌ガーゼで動脈の露出した領域。
- ドップラー プローブ フロー プローブに触れることがなく、頸動脈に臍帯テープを巻いて、血流速度を記録を開始してぶらぶら歩くスペースが広く頸動脈周囲をフローし、手順 (図 1 トップ) を通して継続場所です。記録の基準フロー 〜 臍帯テープを適用する前に 5 分。
注: ベースライン流した FeCl3臍帯テープ配置される前に通常平均約 250 mL/分です。 - 15 分、削除、および破棄のためそれに触れることがなく直下流プローブ止血を用いた頸動脈に準備した FeCl3臍帯テープを巻いてください。
注: オクルー ジョンは、ゼロの流れ mL/min として指定されます。 - 45 分追加追加プローブの信号を維持するために必要に応じて生理食塩水の閉塞性血栓を安定化します。
注: 年齢に応じて、ジェンダーと準備した FeCl3臍帯テープの犬、その他のプレースメントの種類必要があります再申請の前に発生する咬合の 30 分を許可します。差は認められなかった血栓症のビーグル犬におけるジェンダーと塩化第二鉄による。それは新鮮なした FeCl3臍帯テープを複数回再適用し、した FeCl3臍帯テープの準備のプロトコルから逸脱していることをモデルに必要な見つかりませんでした。別の品種または犬、血栓症プロトコルが逸脱しない、またはイヌ科動物のグループは確立した FeCl3する必要があることを確認する最初の被験者に3臍帯テープを適用した FeCl の時代に、研究室を使用する場合その品種または彼らの特定の研究で年齢のアプリケーション時間。この実験した FeCl3臍帯テープ塗布後 8-30 分の範囲でオクルー ジョン回。 - 薬理学的介入から生じる下流の血栓塞栓性イベントだけでなく脳卒中や出血量を決定するには、磁気共鳴イメージング マシン (下図参照に追加ケタミン注射イヌ科動物を輸送します。追加の処理)。
- 最終造影/MRI (イメージング プロトコルは以下参照)、有害な刺激への応答の欠乏によって示されているから麻酔の深い外科平面、下にいながら、後で分析に必要な全血を収集し、肋骨を介して切断して胸を開く血管 (デスメタル) を切断することによって胸骨、消費税中心で始まります。
注: この実験での全体で血 (< 10 mL) 大腿骨シースからベースライン、エージェントの管理後、5 分と注入後 60 分で描いた、血栓溶解の過程に及ぼす影響を見た。犠牲の動物のプロトコルで承認された場合追加プラズマ ストレージの容量無制限を描画できます。分析、処理および犠牲の 30 分以内のすべての全血を格納します。承認された動物のプロトコルの詳細として動物の体重の承認割合を超える血は描画されませんを確認します。説明すべての実験は、非回復でした。 - 0.9% 生理食塩水で心を洗い、フラッシュが必要な場合、液体窒素でサンプルを凍結します。
- 頸動脈を削除する前にそのレコードの横にある定規を置くことによって血栓の長さを測定します。血栓と組織トリミングに容易に対側内頸動脈に同じ場所で途中組織マーカーを配置します。同じ長さで対側内頸動脈をマークします。
注: このモデルで平均血栓長さは 1.75 cm です。 - 両方の血管に血栓の全体の長さを削除し、10% ホルマリンで固定します。組織マーカーでマーク長さ内で対側内頚動脈を削除します。対側内頚動脈を血栓の真ん中で半分にカットします。フラッシュは、後で分析のため液体窒素の半分の対側頸動脈を凍結し、組織学的解析以下の負傷した頸動脈の横に埋め込むには 10% ホルマリンで残りの半分を修正します。
- 目的分析のための器官を削除、0.9% 生理食塩水と液体窒素で凍結ですすいでください。
- 円形骨のこぎりで頭蓋骨を削除します。ゆっくりと下に脳を損傷することがなく頭蓋骨を削除します。
- 頭蓋骨から脳が削除された後、冷たい 0.9% 生理食塩水で洗い流して、鋭いメスを横方向に切断、脳の中央から 2 つの 4 mm のセクションをカットします。2% に 4 mm のセクションの 1 つを配置 (追加の TTC の脳の処理を参照してください)、虚血性の分界の TTC 他のスライスは、H & E 染色 (H & E の脳のための追加の処理を参照してください) の 7 日間 10% ホルマリンで置かれる間。
3. イヌの血管造影
注: これは図 2に示すように、興味の時点で手術中に行われます。
- 3-5 cm の腹矢状切開し、右鼠径部のパルスを感じる。
- 大腿動脈を公開し、鈍的切離を使用して周囲の組織から分離します。
- 直角止血を使用して露出した動脈の遠位端の周り 0 絹糸縫合します。
- 遠位 0 シルク縫合糸を結ぶ、止血剤で皮膚に緩い 0 シルク縫合糸の末端をクランプでわずかな緊張を動脈に適用します。
- 公開されているセグメントの近位端の周り 2 番目 0 絹糸縫合を配置します。
- イントロデューサー、18 G の針を使用して動脈にガイドワイヤーを通過する近位および遠位 0 絹糸縫合関係中間の動脈を穿刺します。
- 組み立て 6Fr シースとアセンブリからから出るワイヤーを把握、ガイドワイヤーに散大をロードします。
- ガイドワイヤー散大と鞘を進めます。散大シース組み立てを進めながら、散大から突出ワイヤーのしっかりした把握を維持することを確認します。
- 完全挿入後動脈穿刺部位の止血を維持するためにシースを近位 0 シルク縫合糸を結ぶ。
- 同時に、ガイドワイヤーやガイド線を削除します。
- 拍動血流の存在を確認し、フラッシュの 3-5 mL の生理食塩水入りの一方通行のバルブを開きます。
- いっぱい延長線を監視および記録の観血的血圧測定に圧力トランスデューサーに接続されている流体のアクセス シースの一方向バルブを接続します。
- 4 fr. 血管造影カテーテルをガイドワイヤー 0.35"を事前に読み込む、Tuohy y アダプターに設定コントラスト噴射マニホルド接続します。
- ガイドワイヤー、カテーテルの遠位端のすぐ内側の先端を引っ張るし、生理食塩水でアセンブリ全体をフラッシュします。
- 鞘の止血弁に血管造影用のカテーテルを挿入し、ガイドワイヤー遠位カテーテル先端を越えて約 5 cm を進めます。
- 透視と逆行性トランス大動脈アプローチを使用して、ゆっくりとカテーテルを大動脈弓に進出します。
- 腕頭動脈の離陸を識別する生食によるコントラスト剤希釈 1:1 の 2-3 mL を注入します。
- 腕頭動脈にカテーテルを直接にガイド線を使用し、右総頚動脈に選択的に。
- ガイド線を削除し、頚動脈にカテーテルが配置されていることを確認する希薄のコントラストの 2-3 mL を注入します。
- 血管造影実行してデジタル減算血管造影手技を記録しながら原液コントラストの 3-4 mL を注入します。
- 追加時点で繰り返し造影の 3.18 3.21 の手順を繰り返します。
4. 磁気共鳴-拡散加重イメージング (飲酒運転) と T2 加重イヌ脳イメージング (T2WI)
注: これは、図 3 aに示すように-3B 。
- 深麻酔下で犬が確実します。
- 犬の生理学的パラメーターは、心電図、心拍数などイメージングを通じて監視されていることを確認します。
- 犬は脳コイルの両側の開口部にその頭を仰臥位で横たわっていることを確認します。
- 3 テスラ (3 t) 磁石を有効にします。
- T2 強調画像 (T2WI)、MRI の基本的なパルス シーケンスを実行します。
注: シーケンスは、異なる病理学的条件下で組織の T2 緩和時間の差を使用します。 - ローカライザー T2 強調グラジエント エコー シーケンスをイメージングを用いた解剖学的イメージングの前に犬の頭脳のパイロットのイメージを取得するイメージングを行い、視野 (FOV) は、スライスとスライス厚脳を完全にカバーするための数を特定します。
- 以下 T2 パラメーターを使用: スライス厚 = 3 mm、TR 4,000 ミリ秒、TE = 75 ms、ETL を = = 7、取得マトリックス = 320 x 256、FA = 180ᵒ、FOV = 320 x 320 ピクセル、イメージの解像度 = mm あたりのピクセル数 2.4615。
- MCA 閉塞後と犠牲の直前にエコー平面 DTI 系列 4 h を用いた拡散強調画像 (DWI) を実行します。
- 次の飲酒運転パラメーターを使用: b 1,500 s/mm2スライス厚を = = 3 mm、TR = 4,600 ms、ET 86 ms、ETL を = = 55、買収マトリックス = 140 × 140、FA = 90ᵒ、FOV = 231 x 257、画像の解像度 = 0.9333 ピクセル/mm (表 1)。
5. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) が犬の脳の染色
注意: これは3 D 図で表示します。
- 10% ホルマリンで 7 日後パラフィンに 4 mm の脳のセクションを埋め込みます。
- 彼らは、脳組織の上から任意の追加のパラフィンを取り外し、ミクロトームでレベル 4 μ m で脳組織をカットし、各 2"× 3" インチのスライドに 1 つの脳のセクションを配置するまでは、パラフィン ブロックをトリムします。
注: 染色する前にすべてのソリューションに置いて別の容器、スライド移動できる 1 つのソリューションから別に乾燥せず。 - 各脳のスライドをデ paraffinize し、水道水で水和物します。
- ヘマトキシリン 560 に 8 分各脳スライドを配置します。
- 各脳のスライドを水道水ですすいでください。
- 1% とそれぞれの脳のスライドを区別するため酸アルコール 1 s 3 回。
- 各脳のスライドを水道水ですすいでください。
- 青の 1 のための 1% 水酸化アンモニウムと各脳スライド s。
- 各脳スライド 2 分の水道の流水ですすいでください。
- 70% でそれぞれの脳のスライドを脱水エタノール (エタノール) 1 s 12 回。
- 脳、各スライドで 1 分のエオシンを counterstain します。
- 脳、各スライドで 95% の脱水 1 江藤 s 12 回。
- 100% の各脳スライドを脱水エタノール。
- キシレンの各脳スライドをオフにし、樹脂製マウント メディアで空気の泡を削除する脳スライド上に 2"× 3" インチ coverslip を適用します。
注: すべてのソリューションが染色の複数日、複数のスライドの水とエタノールを除いて再利用されます。ガラス瓶を染色で行われる脳のセクションをスライドに配置した後ですべての処理が、プラスチックの染色容器も市販されています。それが変色になるとき任意のソリューションに置き換えるし、しっかりと覆っておきます。
6. ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色犬頸動脈
注意: これは図 1 (左) に表示します。
- 10% ホルマリンで 24-72 時間後負傷した頚動脈は血栓の真ん中で半分にカットし、埋め込む ~ 負傷した頸動脈の 1 cm と 〜 同じパラフィン カセットで対側の制御の 1 cm。
注: 内頸動脈血栓は壊れやすいです。血栓が邪魔されないように、切断する前に 10% ホルマリンで容器が修正されるまでを待ちます。両方負傷者を埋め込むと、頚動脈を制御で同じパラフィン ブロックを許可切断同時に血管内の同じ場所で。 - 任意の追加のパラフィンを取り外し、ミクロトームのレベルまでパラフィン ブロックをトリミングします。その後対側頸動脈のセクションは、スライドの上部に配置され、パラフィン ブロックを回転せず 25 mm x 75 mm x 1 mm スライドに 4 μ m でのセクションをカットします。
注: 各スライドに置かれた 3 つの頚セクションですが関心の汚れに応じて 1 つを追加することができます。 - デ頸動脈各スライドを paraffinize し、水道水で水和物します。
注: とは異なり、個別に処理する必要があります脳のスライド、頸動脈のスライドで処理できる一括に互いに触れることがなく同時に複数のスライドを合わせての瓶を置くことによって。 - 各頸動脈スライド 8 分のヘマトキシリンで染色します。
- 各頸動脈スライドを水道水ですすいでください。
- 1% を各頸動脈のスライドを区別するため酸アルコール 1 s 3 回。
- 各頸動脈スライドを水道水ですすいでください。
- 青の 1 のための 1% 水酸化アンモニウムを各頸動脈スライド s。
- 各頸動脈スライド 2 分の水道の流水ですすいでください。
- ステータス退避を各頸動脈スライド 70% で 1 の EtOH s 12 回。
- エオシンと 1 分では頸動脈各スライドを counterstain します。
- ステータス退避を各頸動脈スライド 95% で 1 の EtOH s x 12。
- 100% の各頸動脈スライドを脱水エタノール。
- キシレンの各頸動脈スライドをオフにし、樹脂製マウントの空気の泡を削除するメディアを 24 ミリメートル x 50 mm の coverslip を追加します。
7 2,3,5-トリフェニル-2 H-テトラゾリウム塩 (TTC) が犬の脳の染色
注: これを図 3に示します。
- 4 mm の他のセクションは脳に H & E セクションにすぐに近位部から取り外した場所準備 2 %ttc (頸動脈閉塞症)。5 分ごとの汚損のための脳のセクションめくり、少なくとも 20 分の 37 ° C で暗闇の中で孵化させなさい。
注: 20 分後セクションは両側に赤チェリーをする必要があります。追加の時間は、TTC 鮮度と組織切片の厚さに基づいて必要ことがあります。 - TTC のソリューションを削除し、pH 7.4 色のコントラストを最適化するために、PBS で 4% パラホルムアルデヒドで置き換えます。
- 染色白と赤のコントラストが最適であれば、虚血領域のトレースの高解像度で透明なプラスチック シート、余分な水分の乾燥とスキャンの間の TTC 脳スライスを配置します。
注: セクション格納できますが無期限にパラホルムアルデヒド溶液、染色フェードされます。
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Representative Results
本明細書の詳細な手順は、閉塞動脈の介入の予防や血栓の評価のために使用できるモデルの開発になります。図 1 aは、商業ソフトウェアによって記録された治療中、前後の基準流速と結果の血流速度を示しています。この録音からのデータは、この犬の治療と頚動脈損傷を再灌流の割合を判断する使用できます。図 1 bは、対側 (上) と H & E 犠牲の時に再の衛生状態を確認すると汚れる負傷 (下) 犬頸動脈セクションの両方の例を示します。各治療で運河の % に到着する船の総面積によって分けることができる (血栓) なし血管をトレースして血管の灌流領域を分析するソフトウェア プログラムの多数があります。図 2は、このかどうか血栓は閉塞性を決定するために使用できるプロトコルをイメージングにおける詳細な頚動脈造影法のいくつかの例を示しています。さらに、マーカーとして正方形流プローブを使用して、研究者は血管造影は取られる各時点で血栓の長さを決定できます。とはいえ、ここで我々 は傷害、車両処理の後、犠牲の時間に 60 分前に、画像を提示している捜査官は自分のニーズに画像を調整できます。図 3は、犬の脳に適用される磁気イメージング パラメーターの結果 〜 拡散 (図 3 a) と T2 の両方を利用した犠牲の直前に内頚動脈閉塞後 4 h 加重 (図 3 b) をイメージングこのプロトコルのセクション 4 で詳しく説明します。配列全体が脳の異なるレベルで撮影の写真を 1 枚だけ紹介が出血とストローク ボリュームのサイズをさまざまなレベルで脳の領域を特定し、希望調査官による各時点で量的に表わされることがことができます。定量は捜査員のイメージャーと特定特定の MRI マシンのソフトウェアを使用して完了します。染色の結果を図 3に示すように、TTC は、脳細胞がまだされていないに加えて代謝活性を記述する使用できます。TTC は、死んだ細胞、TTC は保持されません、したがってされません赤に対し赤いステンド グラス生細胞における結果を酵素によって削減されます。最後に、ヘマトキシリンとエオシン染色図 3 Dでイヌ脳で示す技法になります赤の血液細胞を染色真っ赤な出血が発生した領域を確認するために使用できます。
図 1: 頸動脈血流を監視します。(A)代表的な頸動脈血流速度 (mL/分) 記録ドップラーからプローブの犠牲によって傷害前にベースラインから。((B))代表 H & E は、閉塞頸動脈 (下) と対側のコントロール (top) の染色。倍率は 20 倍です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 血管造影による頸動脈血流を監視します。右側犬歯の頚動脈の代表的な血管造影のビュー。車輸液(A)、車両投与(B)、60 分前にベースラインと犠牲、4.5 閉塞(C)におけた後 h の時、画像が撮影されました。赤い矢印がした FeCl3の船の位置を示す-臍帯テープが置かれた障害。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 車両治療後イヌ脳の代表的なイメージです。磁気共鳴イメージ投射 (MRI) は拡散イメージングによる犠牲の直前に、閉塞後 〜 4 h を実行 (飲酒運転、 (A)と T2 強調画像(B) です。TTC 染色内側のセクションを記述する犠牲の時に壊死した組織から住んでいる(C).H & E 染色の内側のセクション、TTC のセクションにすぐに近位、代謝である組織を記述するために犠牲の時にアクティブ (赤) TTC ではないから生きた細胞によってとら赤製品に削減されます、したがってになりますトレースするソフトウェアの多数で定量化することができますセクションには、vs 死んだ地域が住んでいます。(D). この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 実験的パラメーター | T2 強調 | 拡散 |
| 繰り返し時間 (TR) ms | 4000 | 4600 |
| エコー時間 (TS) ms | 75 | 86 |
| 度の角度を反転します。 | 180 | 90 |
| 買収マトリックス | 320 x 256 | 231 × 257 |
| 平均回数 | 2 | 4 |
| 平面画像の解像度 (ピクセル/mm) で | 2.4615 | 0.9333 |
表 1: 磁気共鳴イメージング (MRI) パラメーター 。犬の頚動脈血栓症モデルにおける脳卒中と出血の容積測定の評価の最大化する画像 T2-拡散強調の犬用に開発された MRI パラメーター。
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Discussion
した FeCl3誘導血管損傷モデル小動物における血栓症の研究に用い、利点の多数の大きい動物、臨床前モデルに変換するは簡単です。プロトコルを犬に合わせて若干の変更により薬理学的介入とする前に、容器の衛生を評価するために血管造影後の脳卒中と出血のボリュームを評価するために両方の磁気共鳴イメージングの利用中に、後の治療。他の血栓の大動物モデル損傷部位で安定した閉塞性血栓を検討していない、そのため再 canalization 各予防や血栓の程度を評価するために頚動脈の血管造影学を利用できません。治療。(血漿、尿、臓器毒性試験等の) 分析のための十分な組織を含む大規模な動物の利点に加えて大動物モデルより密接に心拍数、血圧、および人間の凝固カスケードを模倣します。齧歯動物モデル。各実験動物に炎症性および生化学的調査の茄多のため使用することができます組織学的および生物学的材料の結果脳と頚動脈の十分なサイズ。した FeCl3の変更の別の利点-犬に誘導血管モデルははるかに大きい血液量が血液ガスと完全な血血小板反応性または血栓の形成数のような変更することがなく実験中に得ることができます。カウントは、けがや薬の注入で監視できます。さらに、塩化第二鉄の傷害は酸化損傷; に起因しています。したがって、それは心筋梗塞や脳卒中の臨床に大いにもっと密接に他の種類の公開動脈損傷モデル7先行動脈損傷を模倣します。複数の十分な組織学的組織再狭窄及び内皮壁健康状態で対処することができます。 ので、最後に、臨床的に使用される定期的に、血栓摘除術など機械的介入が薬理学的治療に従うことができます。同じ犬の調査。
このモデルの制限事項がいくつか考慮する必要があります。最初が時点と本書で選択した治療 (頸動脈傷害の後の 4.5 h の犠牲車) 測定可能な脳卒中や出血で起因しなかった、この方法は臨床的に関連する抗血栓の小説の調査のため血栓溶解薬効果と投与量を決定します。確かに、ストロークや出血、血栓症の初期を侮辱または薬理学的治療法 (すなわち当社) はこのモデルで発生する可能性があります。第二に、購入、配送、遺伝子操作、日当の犬コストは非常に高いし、薬が齧歯動物モデルで特徴になるまでコストがかかりすぎます。
血小板の活性化、集約および付着性、血栓症の核心にプロトコル センターで重要な手順です。血小板機能解析 (PFA 100) は、重複して全血の 1600 μ L で実行できますが、このメソッドはシンプルで簡単に血液の恒常性に影響を与えずにプロシージャ全体で血小板の反応性を追跡します。最後の血液がある限り実験的血栓症影響を与えずに血管損傷前にインピー ダンスまたはルミ aggregometry を使用して血小板活性にさらに前のヴィヴォ研究を実行できます > 傷害後に術前に、1 週間犠牲の時に治療。前述したように、50% した FeCl3 、性別に応じて必要があります繁殖や各犬の年齢に浸した臍帯テープの追加アプリケーション。我々 は閉塞症外傷後 30 分の許可し、新鮮な 50% した FeCl3必要に応じて別の 15 分間を再適用。このプロセスでは、年齢や性別大人のビーグル犬を用いた血栓溶解の偏差の差されませんでした。本研究では組織ボクセル内の水の分子のブラウン運動 (粒子のランダム拡散) の測定に基づく重み付き画像 (DWI)、MRI、重要かつ最新の拡散を解明しました。このテクニックはハイパーの細胞組織を示す拡散による腫瘍など他の疾患の中で急性期脳梗塞の検出に有用または細胞の腫脹を伴うそれらが高い拡散係数17,18 と低い、19。拡散マップは脳組織17,18,19における水分子の拡散によって異なります。B 値は、H2O の分子の拡散の勾配を測定します。虚血性損傷部位では、無料の水は高い B 値19で最も強い信号の減衰を経験します。
投与、毒性、および予防・血栓溶解剤の有効性の研究のためこの犬のプロトコルの使用、に加えて犬のサイズは、実験力学的血栓摘除術臨床的に関連性の高い、容易に達成可能。頸動脈は、処理されます簡単に、ステンド グラスと血栓検索後の免疫細胞の浸潤の研究のための組織学のプロトコルの利用評価。これらの研究は、私たちの次の詳細なプロトコルになります。
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Disclosures
どれも
Acknowledgments
認知と行動の脳開発を犬の磁気共鳴イメージングを実行する彼らの財務および科学サポートのオハイオ州立大学で中心を感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
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