Summary
Aqui, apresentamos as modificações necessárias para um bem caracterizado e comumente usado pequenos induzida por cloreto férrico (FeCl3) artéria carótida lesão modelo animal para uso em um modelo de grandes animais de lesão vascular. O modelo resultante pode ser utilizado para avaliação experimental pré-clínicos profilática e trombolítica intervenções farmacológicas e mecânica.
Abstract
Trombose arterial oclusiva, levando a isquemia cerebral e infarto do miocárdio contribui para 13 milhões de mortes todos os anos globalmente. Aqui, traduzimos um modelo de lesão vascular de um pequeno animal em um animal grande (canino), com pequenas modificações que podem ser usadas para a seleção pré-clínica de agentes profiláticos e trombolíticos. Além dos métodos cirúrgicos, o protocolo modificado descreve os métodos passo a passo para avaliar a canalização de artéria carótida por angiografia, instruções detalhadas para processar o cérebro e a artéria carótida para análise histológica verificar a carótida canalização e hemorragia cerebral e parâmetros específicos para completar uma avaliação de eventos tromboembólicos a jusante, utilizando a ressonância magnética (MRI). Além disso, alterações processuais específicas do modelo animal pequeno bem estabelecida anteriormente necessário para traduzir em uma lesão vascular animal grande (canino) são discutidas.
Introduction
Terapia de acidente vascular cerebral em grande parte é modelada após o tratamento de doença arterial coronariana, principalmente porque intervenções na doença cardiovascular tem respondido bem ao medicamento terapia e endovascular intervenções1. Estes tratamentos, no entanto, não com êxito traduzidas para infarto cerebral. São as dificuldades com o atual tratamento de acidente vascular cerebral que o ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rTPA) não pode ser revertido, e que a administração carrega um risco significativo de 6,4% de conversão hemorrágica2,3, 4. a morbimortalidade resultante limita seu uso para uma janela pequena, muitas vezes inatingível,5. Também, reestenose e oclusão ocorrem frequentemente após trombólise inicial, invertendo melhora neurológica inicial. Em resumo, há uma estreita janela temporal para administrar rTPA que exclui a grande maioria (90%) dos pacientes que sofrem insultos cerebrovasculares isquêmicos.
O papel da Terapia antiplaquetária intravenosa se mostrou promissor no tratamento do acidente vascular cerebral isquêmico com recanalização do vaso melhorada, sobrevivência e resultado2. Infelizmente, estas drogas têm um efeito colateral previsível de hemorragia intracraniana e extra-craniana, em grande parte porque não há nenhuma maneira para adequadamente reverter ou controlar sua atividade2. Ao mesmo tempo eficaz na prevenção da agregação plaquetária, o risco de hemorragia e a incapacidade de reverter sua atividade impedido o seu uso na rotina de cuidados a pacientes com AVC. Portanto, existe uma necessidade, para medicamentos anti-coagulantes potentes que agir sozinhos ou em combinações para prevenir e lisar coágulos ainda têm um perfil de segurança que permitirá o uso em um espaço fechado, baixa o volume, como o cérebro, onde a hemorragia é mal tolerada.
Compreendendo o mecanismo da trombose arterial e re-estenose e avaliação dos trombolíticos e drogas que impedem a re-estenose, requerem modelos animais pequenos e grandes, como parte do desenvolvimento pré-clínico. Lesão vascular induzida por cloreto férrico é uma técnica amplamente utilizada para rapidamente e com precisão, induzir a formação de trombos nos vasos expostos de camundongos, ratos, cobaias e coelhos6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. estas espécies menores oferecem várias vantagens, incluindo a facilidade de manipulação genética, compra animal de baixo custo e baixa diárias custos de habitação. Infelizmente, as experiências com animais pequenas negam vários empates de sangue durante a cirurgia de acesso plaquetas reatividade, gasometria arterial e resposta inflamatória. Mais importante ainda, animais de grandes porte muito mais pròxima imitam plaquetária humana fisiologia6,13. O modelo de lesão de artéria carótida3 FeCl tem desempenhado um papel predominante no estudo da fisiopatologia da trombose, na validação de novos medicamentos anti-plaquetários e anti-coagulante e na descoberta de potenciais trombolíticos6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. Previous modelos em camundongos, ratos, cobaias e coelhos forneceram facilidade e flexibilidade para a manipulação genética, mas traduzíveis modelos pré-clínicos são essenciais para pacientes estudos de dosagem e toxicidade da terapêutica potencial6 ,13. Apesar de vários modelos de distúrbios trombóticos foram desenvolvidos em ratos, grandes modelos animais de trombose que são aplicáveis para a doença vascular periférica, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio são poucos e distante. Os primeiros modelos de trombose em macacos, cachorros e porcos focada na estenose, aplicando hemostatos e cilindros posteriores aos navios, geralmente resultando em fluxo cíclico reduções14,15,16. Em vez de um trombo oclusivo no local do dano endotelial como no modelo de cloreto férrico, o trombo nesses modelos resultou em trombose cíclica, embolização distal e retornar para o fluxo de sangue normal. Em comparação, o modelo de cloreto férrico modificado aqui em um animal grande, resulta em um trombo oclusivo no local da lesão e é estabilizado e verificado por angiografia antes do tratamento trombolítico. Desde que o investigador tem fundos amplos para per diem e compra de caninos e perícia cirúrgica adequada, detalhamos aqui um grande modelo canino de lesão vascular para permitir que os laboratórios estudar trombose utilizando cirúrgica, imagiologia e histológicas técnicas.
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Protocol
As investigações descritas de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde e foram aprovadas pelo Comitê de uso (#2015A00000029) e The Ohio estado Universidade institucional Cuidado Animal. Todas as manipulações cirúrgicas foram realizadas sob anestesia profunda e os animais não se sentiu dor em qualquer altura durante o procedimento. Todos os experimentos descritos foram não-cobrança.
1. preparação
- Recentemente, prepare 50 mL de cloreto férrico (FeCl3) em 50% (p/v), diluído em água deionizada.
- Corte a fita umbilical em pedaços de 5,5 cm e mergulhe em solução recentemente preparada 50% FeCl3 1 semana antes do procedimento.
Nota: A fita umbilical usada é grossa e leva algum tempo para absorver a 50% FeCl3 solução. - Rápido cada canino durante a noite antes da cirurgia.
- Etiqueta cryovials para coleta de plasma e urina, tubos de centrífuga estéril 50 mL para todo o armazenamento de órgãos e recipientes de formol a 10% para fixação do cérebro e carótida por H & E mancha com a identificação dos animais, data de nascimento, data da cirurgia e tratamento.
- Preparar 100 mL de cada solução para cada procedimento canino: formol 4% paraformaldeído em solução salina tampão fosfato (pH 7,4), 10% neutro tamponado e 2% de cloreto de 2,3,5-triphenyltetrazolium [TTC em PBS (pH 7,4), armazenar no escuro].
- Adquira amplo nitrogênio líquido para todos os cryovials e tubos de tecido 50 mL para flash congelamento para o dia do procedimento.
- Adquira dois cartuchos de ADP/colágeno para reatividade plaquetária de PFA-100 (analisador de função plaquetária) para cada canino para cada ponto de tempo de interesse.
- Adquira um 4,5 mL citrato de sódio tubo coleta de sangue, para cada sorteio de sangue antes do sacrifício, para separação do plasma e armazenamento. Em sacrifício, desenhe 16 tubos de colheita de sangue para o armazenamento de plasma. Depois de cada tubo de coleta de sangue é completo, rotação a 4.000 x g, durante 30 s para isolar plasma rico plaquetas e transferência clara camada em cryovials. Flash congelamento em nitrogênio líquido antes de armazenamento a-80 ° C.
- Adquira um 4,5 mL de lítio heparina tubo coleta de sangue, para cada ponto de tempo de PFA-100 de interesse para reatividade plaquetária recorde. Em cada sorteio do sangue, introduza 800 µ l de sangue total de um tubos de colheita de sangue de heparina de lítio em cada cartucho de ADP/colágeno sem bolhas de ar a seguir a reatividade plaquetária.
- Adquira dois tubos de colheita de sangue EDTA K3 (1,8 mg de EDTA anidro por 1 mL de sangue), para hemograma completo (CBC) na linha de base e a hora do sacrifício.
Nota: Este volume é adequada para a maioria das instalações de núcleo executar cada um duas vezes em caso de erro de mecânico. Embora um CBC foi executado em ambos da linha de base antes da lesão e no momento do sacrifício, os investigadores podem adicionar que mais sangue desenha como aprovado nos seus protocolos de animais para análises adicionais. Verifique com a facilidade de volumes e as condições de entrega para seus equipamentos. - Prepare uma seringa heparinizada 2ml por enchimento e revestimento a seringa no dia do procedimento para análise de gás de sangue na hora do sacrifício.
Nota: Verifique com a facilidade de volumes e as condições de entrega para seus equipamentos.
2. oclusão da artéria carótida canina
- Pesar um adulto (> 18 meses) canino de beagle e pre-medicar com acepromazina intramuscular (0.025-.2 mg/kg) seguido por uma injeção intraperitoneal inicial de cetamina (5-20 mg/kg) e midazolam (0,01-.25 mg/kg). Induzi anestesia mais profunda com 15% de isoflurano baseado o ritmo cardíaco, respiração e Tom de mandíbula.
Nota: Anestesia exata é ditada pelo peso e o protocolo aprovado de animais. Embora as injeções podem resultar em dor para os animais, a duração deste desconforto seja mínima (menos de 3 s). - Antes de tomar o animal para a mesa de cirurgia, remova pelos por recorte. Aplique lubrificante pomada oftálmica aos olhos do animal anestesiado para evitar ressecamento.
- Coloque o animal em posição supina, usando um sistema de posicionamento e eletrocardiograma (ECG) prenda o pé almofadas. Entubar através da traqueia com um tubo endotraqueal de 6,5 mm algemado, mecanicamente ventilar em 14 respirações por minuto e manter cada cão com uma inalação contínua de 1-5% de isoflurano (varia de acordo com o protocolo aprovado animal).
- Para determinar a extensão da canalização de carótida e o comprimento do trombo oclusivo, realize angiografia antes da lesão, antes de MRI e a hora do sacrifício (veja abaixo para obter instruções adicionais).
- Insira uma bainha arterial femoral e um cateter plástico e prenda com uma sutura 0-seda solta. Feche temporariamente a bainha e o cateter durante o transporte e estudos de imagem. Ver canina angiografia abaixo para obter instruções adicionais).
- Para sangue empates, inserir um cateter intravenoso 16 x 45 milímetros através da pele intacta distal da bainha arterial femoral reduzir o local. Avance o cateter para a exposição cirúrgica e visualizá-lo quando ele entra na veia femoral exposta imediatamente adjacente à bainha arterial. Uma vez totalmente inserido na veia, retirar a agulha, cap do cateter com uma torneira de 3 vias e nivelá-lo com 2 mL de solução salina estéril 0,9%. Fixe o cateter na pele com uma sutura de seda-0.
- Fazer uma incisão de 8 a 10 cm da pele diretamente no topo da região da artéria carótida comum direita e dissecar a fáscia para isolar os vasos no tecido circundante.
- Cuidadosamente, introduza pinças entre a artéria carótida e o nervo vago para separar. Evite tocar mais do que necessário como pode causar constrição do vaso a carótida.
- Seca a área exposta da artéria com a gaze estéril para evitar a diluição de solução FeCl3 .
- Lugar do Doppler fluxo sonda ao redor da artéria carótida permitindo amble espaço enrolar a fita umbilical em torno da artéria carótida sem tocar a sonda de fluxo e começar a gravar a velocidade do sangue e continuar durante todo o procedimento (Figura 1 Top). Gravar o fluxo da linha de base para ~ 5 min antes de aplicar a fita umbilical.
Nota: Fluxo de base antes da colocação de fita umbilical FeCl3 geralmente médias cerca 250 mL/min. - Envolva a preparado FeCl3 fita umbilical em torno da artéria carótida utilizando uma pinça hemostática imediatamente abaixo da sonda de fluxo sem tocá-lo por 15 minutos, retire e descarte.
Nota: Oclusão é designado como zero fluxo mL/min. - Estabilize o trombo oclusivo por 45 min. Adicionar solução salina adicional à sonda conforme necessário para manter um sinal.
Nota: Dependendo da idade, gênero e o tipo de colocações caninas, adicionais da preparado FeCl3 fita umbilical podem ser necessários para permitir que 30 min para oclusão deve ocorrer antes de re-aplicação. Não foram observadas diferenças em trombose pela aplicação do cloreto férrico com sexo em beagles. Não foi encontrado necessário com este modelo para reaplicar uma fita umbilical fresca de FeCl3 mais uma vez e nunca se desviaram o protocolo de preparação do FeCl3 fita umbilical. Se o laboratório é usando uma raça diferente ou a idade do canino, o FeCl3 fita umbilical deve ser aplicada às matérias iniciais para certificar-se que o protocolo de trombose não se afastar, ou um grupo de caninos pode ser necessário estabelecer FeCl3 tempo de aplicação para que a raça ou idade em seu estudo específico. Os tempos de oclusão, neste experimento, variam de 8-30 min após a aplicação de fita umbilical FeCl3 . - Para determinar o volume de acidente vascular cerebral ou hemorragia além dos eventos tromboembólicos a jusante, que possam resultar da intervenções farmacológicas, transportar os caninos com injeção de cetamina adicionais para uma máquina de ressonância magnética (veja abaixo para processamento adicional).
- Enquanto ainda sob um avião profundo cirúrgico de anestesia de uma final angiografia/RM (veja abaixo para protocolo de imagem), indicada por uma falta de resposta a estímulos nocivos, colher o sangue total desejado para posterior análise e, em seguida, abra o baú, cortando as costelas começando no esterno e impostos especiais de consumo o coração cortando os vasos sanguíneos (hemorragia).
Nota: Neste experimento, todo sangue (< 10 mL) foi desenhado na linha de base, 5 min após a administração de agente e 60 minutos após a infusão da bainha femoral e não vi nenhum efeito sobre o processo de trombólise. No sacrifício, um volume ilimitado pode ser desenhado para armazenamento adicional de plasma se aprovado no protocolo de animais. Analisar, processar e armazenar todos os sangue total dentro de 30 min de sacrifício. Certifique-se de que sangue é desenhado não superior à percentagem de aprovados do peso do animal, conforme detalhado no protocolo animal aprovado. Todos os experimentos descritos foram não-cobrança. - Enxágue o coração com soro fisiológico a 0,9% e flash congelar amostras em nitrogênio líquido, se desejado.
- Antes de remover as carótidas, medir o comprimento de coágulo, colocando uma régua ao lado- e o registro. Coloque o marcador de tecido no meio do coágulo e no mesmo lugar sobre a carótida contralateral para a facilidade na remoção de histologia. Marca a carótida contralateral no mesmo comprimento.
Nota: O comprimento médio do coágulo com este modelo é 1,75 cm. - Remover todo o comprimento do coágulo em ambas as naves e corrigir em formol a 10%. Remova a artéria carótida contralateral dentro do comprimento marcado pelo marcador de tecido. Corte a artéria carótida contra-lateral ao meio no meio do coágulo. Flash congelar metade da artéria carótida contralateral em nitrogênio líquido para posterior análise e corrigir a outra metade em formol a 10% para incorporar-se ao lado da carótida ferida para análise histológica abaixo.
- Remover os órgãos para qualquer análise desejada, enxaguar com soro fisiológico a 0,9% e flash congelamento em nitrogênio líquido.
- Remova o crânio com uma serra circular. Remova lentamente o crânio sem danificar o cérebro abaixo.
- Depois que o cérebro é retirado do crânio, enxaguá-lo em soro fisiológico a 0,9% frio e corte duas seções de 4 mm do centro do cérebro, cortando lateralmente com um bisturi afiado. Coloque uma das seções 4 mm em 2% TTC para demarcação isquêmica (ver adicional de processamento para cérebro TTC), enquanto a outra fatia colocado em formol a 10% por 7 dias para a H & E mancha (consulte processamento adicional para o cérebro, H & E).
3. canina angiografia
Nota: Isto é mostrado na Figura 2 e é feito durante a cirurgia em pontos de tempo de interesse.
- Sentir o pulso na região inguinal direita e faça uma incisão sagital ventral de 3 a 5 cm.
- Expor a artéria femoral e separá-lo dos tecidos circunvizinhos usando dissecção romba.
- Utilize uma pinça hemostática ângulo reto para colocar uma sutura 0-seda em torno da extremidade distal da artéria exposta.
- Amarre a sutura de seda 0 distal e aplicar uma ligeira tensão à artéria, fixando as extremidades soltas 0-seda de sutura da pele com hemostatos.
- Coloque uma segunda sutura 0-seda em torno da extremidade proximal do segmento exposto.
- Perfure a midway artéria entre os laços de sutura de seda 0 proximal e distal, usando uma agulha introdutora de 18G para passar um fio-guia na artéria.
- Carrega uma bainha 6Fr montado e dilatador sobre o fio-guia, agarrando o fio que sai do assembly.
- Avance o dilatador e a bainha sobre o fio-guia. Certifique-se de manter um firme aperto do fio à medida que sobressaia do dilatador enquanto avança o dilatador de bainha.
- Após a completa inserção, amarre a sutura proximal de 0-seda em torno da bainha para manter a hemostasia no local da punção arterial.
- Simultaneamente, retire o dilatador e o fio-guia.
- Abra a válvula unidirecional para verificar a presença de fluxo sanguíneo pulsátil e irrigue com 3-5 mL de solução salina.
- Conecte a válvula unidirecional da bainha de acesso a um fluido preenchido ramal ligado a um transdutor de pressão para monitorar e gravar as medições de pressão arterial invasiva.
- Pré-carregar um fio-guia 0,35" em um cateter angiográfico 4Fr. e ligar para o colector de injeção de contraste definido com um adaptador em y Tuohy.
- Puxe a ponta do fio guia no interior da ponta distal do cateter e irrigue todo o conjunto com soro fisiológico.
- Inserir o cateter angiográfico na válvula hemostática da bainha e em seguida, avance o fio-guia cerca de 5 cm além da ponta distal do cateter.
- Sob orientação fluoroscópica e usando uma abordagem trans-aórtica retrógrada, avance lentamente o cateter para o arco aórtico.
- Injecte 2-3 mL de contraste agente diluído 1:1 com solução salina normal para identificar a decolagem do tronco Braquiocefálica.
- Usar o fio-guia para direcionar o cateter no tronco Braquiocefálica e então seletivamente na artéria carótida comum direita.
- Retire o fio-guia e Injete 2-3 mL de contraste diluído para verificar que o cateter é colocado na carótida.
- Injecte 3-4 mL de contraste diluído durante a gravação de angiográfico é executado usando técnicas padrão angiográficas e subtração digital.
- Repita as etapas 3.18-3.21 para a angiografia repetida em pontos de tempo adicional.
4. ressonância magnética - difusão ponderada Imaging (DWI) e T2 ponderado de imagem (T2WI) do cérebro canino
Nota: Isto é mostrado na Figura 3A-3B.
- Certifique-se de que o cão está sob anestesia profunda.
- Certifique-se de que os parâmetros fisiológicos do cão são monitorados em toda a imagem incluindo ECG e frequência cardíaca.
- Certifique-se de que o cão está numa posição supina com a cabeça nas aberturas bilaterais da bobina do cérebro.
- Habilite o ímã de 3 Tesla (3T).
- Execute T2 ponderado de imagem (T2WI), uma sequências de pulso básica no MRI.
Nota: A sequência usa as diferenças entre o tempo de relaxação de T2 de tecidos em diferentes condições patológicas. - Localizador de imagem para adquirir imagens do piloto de um cérebro de cachorro antes da imagem anatômica usando ponderado T2 gradiente eco imagem sequência de executar e determinar o campo de visão (FOV), número de fatias e a espessura da fatia para cobrir completamente o cérebro.
- Use os seguintes parâmetros-T2: espessura de corte = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, matriz de aquisição = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixels, resolução de imagem = 2,4615 pixels por milímetro.
- Execute a imagem latente difusão-tornada mais pesada (DWI) usando eco plaina DTI sequência 4 h após a oclusão do MCA e imediatamente antes do sacrifício.
- Use os seguintes parâmetros de DWI: b = 1.500 s/mm2, espessura da fatia = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, matriz de aquisição = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, resolução de imagem = 0.9333 pixels/mm (tabela 1).
5. hematoxilina e eosina (H & E) coloração do cérebro canino
Nota: Isto é mostrado na Figura 3D.
- Após 7 dias em formol a 10%, incorpore as seções do cérebro de 4 mm em parafina.
- Apare os blocos de parafina até são nível com um micrótomo, removendo qualquer parafina adicional da parte superior do tecido cerebral, em seguida, cortar o tecido cerebral em 4 µm e coloque uma seção de cérebro em cada 2 "x 3" polegadas slide.
Nota: Antes de coloração, Coloque todas as soluções em recipientes separados para que os slides podem ser movidos de uma solução para outro sem dessecar. - Paraffinize de cada slide de cérebro e hidratar com água da torneira.
- Coloque cada slide de cérebro em hematoxilina 560 por 8 min.
- Lave cada slide de cérebro na água da torneira.
- Diferenciar cada slide de cérebro com 1% ácido álcool para 1 s três vezes.
- Lave cada slide de cérebro na água da torneira.
- Azul cada slides de cérebro com 1% de hidróxido de amônio por 1 s.
- Lave cada slide de cérebro em água corrente por 2 min.
- Desidratar cada slide de cérebro em 70% etanol (EtOH) para 1 s doze vezes.
- Counterstain cada slide de cérebro em eosina por 1 min.
- Desidratar cada slide de cérebro em 95% EtOH para 1 s doze vezes.
- Desidratar cada slide de cérebro em 100% EtOH.
- Limpar cada slide de cérebro em xilol e em seguida uma lamela 2 "x 3" polegadas em cima o slide de cérebro, removendo as bolhas de ar com mídia de montagem resinoso.
Nota: Todas as soluções são reutilizadas exceto água e etanol para vários dias de coloração e vários slides. Todo processamento após seções do cérebro são colocadas nos slides são feitos em vidro frascos de coloração, mas recipientes plásticos de coloração também estão disponíveis comercialmente. Substituir qualquer solução quando se torna descolorido e mantê-los firmemente coberto.
6. hematoxilina e eosina (H & E) coloração de carótidas caninas
Nota: Isto é mostrado na Figura 1 (à esquerda).
- Após 24-72 h em formol a 10%, cortar a carótida ferida pela metade no meio do coágulo e incorporar ~ 1cm de carótida ferida e ~ 1 cm do controle contralateral na mesma gaveta parafina.
Nota: O coágulo de sangue dentro da artéria carótida é frágil. Espere até que o navio foi fixado em formol a 10% antes de cortar para que o coágulo não seja perturbado. Incorporando os feridos e controlar as artérias carótidas na parafina mesma o bloco permitirá corte ao mesmo tempo no mesmo lugar no vaso sanguíneo. - Apare os blocos de parafina até nível com um micrótomo, removendo qualquer parafina adicional. Então corte seções em 4 µm para 25 x 75 mm x 1 slides mm sem girar o bloco de parafina, para que as seções da carótida contralaterais são colocadas na parte superior do slide.
Nota: Três seções carótidas foram colocadas para cada slide, mas pode-se adicionar dependendo manchas de interesse. - Paraffinize de cada slide da carótida e hidratar na água da torneira.
Nota: Ao contrário do slide de cérebro que deve ser processado individualmente, carótidas slides podem ser processados em massa colocando em potes que se encaixam vários slides de cada vez sem tocar um ao outro. - Mancha de cada slide da carótida em hematoxilina durante 8 min.
- Lave cada slide carótida na água da torneira.
- Diferenciar cada slide carótida com 1% ácido álcool para 1 s três vezes.
- Lave cada slide carótida na água da torneira.
- Azul cada slide carótida com 1% de hidróxido de amônio por 1 s.
- Lave cada slide carótida em água corrente por 2 min.
- Desidratar cada slide carótida em 70% EtOH para 1 s doze vezes.
- Counterstain cada slide carótida em eosina ou 1 min.
- Desidratar cada slide carótida em 95% EtOH para 1 s x 12.
- Desidratar cada slide carótida em 100% EtOH.
- Limpar cada slide carótida em xilol e adicionar uma lamela de 24 mm x 50 mm com mídia de montagem resinoso para remover as bolhas de ar.
7. 2,3,5-trifenil-2h-tetrazólio cloreto (TTC) coloração do cérebro canino
Nota: Isto é mostrado na Figura 3.
- Lugar seção outras 4 mm retirada no meio do cérebro imediatamente proximal à seção em H & E previamente preparado 2% TTC (oclusão da artéria carótida). Incube no escuro a 37 ° C pelo menos 20 min, virando a seção de cérebro para coloração mesmo a cada 5 min.
Nota: Depois de 20 min, a seção deve ser cereja vermelha em ambos os lados. Pode ser necessário um tempo adicional baseado no TTC frescura e espessura do tecido. - Remover a solução TTC e substituí-lo com paraformaldeído 4% em PBS, pH 7,4 para otimizar o contraste de cores.
- Quando o contraste entre a coloração branca e vermelha é ideal, coloque fatias de cérebro TTC entre folhas de plástico transparente, secas de excesso de líquido e digitalização em alta resolução para rastreamento das regiões isquêmicas.
Nota: Podem ser armazenadas indefinidamente seções de resíduos em solução de paraformaldeído, mas mancha vai desaparecer.
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Representative Results
Seguindo os procedimentos detalhados neste documento resultará no desenvolvimento de um modelo que pode ser usado para avaliação profiláctica ou trombolítica das intervenções arteriais oclusivas. A figura 1A mostra a velocidade de fluxo da linha de base e a velocidade de fluxo de sangue resultante antes, durante e após o tratamento, gravado por um software comercial. Dados de gravação podem ser usados para determinar o percentual de re-perfusão com lesão da artéria carótida e tratamento neste modelo canino. Figura 1B fornece um exemplo de ambos os contralateral (topo) e seções de carótida canino feridos (inferior), coradas com H & E que verifica o status de re-canalização no momento do sacrifício. Uma infinidade de programas de software estão disponíveis para analisar a área perfundida do navio traçando o vaso sanguíneo (sem trombo) que pode ser dividido pela área total da embarcação para chegar a um por cento de canalização com cada tratamento. A Figura 2 mostra vários exemplos de angiografia de carótida detalhadas neste canino de imagem protocolo que pode ser usado para determinar se o trombo oclusivo. Além disso, utilizando a sonda de fluxo quadrado como um marcador, investigadores podem determinar o comprimento de trombo em cada ponto de tempo que o angiograma é tomado. Embora, aqui apresentamos imagens antes da lesão, 60 min após o tratamento do veículo e no momento do sacrifício, o investigador pode adaptar a imagem para suas necessidades. A Figura 3 é o resultado dos parâmetros da imagem latente magnéticos aplicada ao cérebro canino ~ 4h após a oclusão da artéria carótida imediatamente antes do sacrifício, utilizando tanto a difusão ponderada (Figura 3A) e T2 ponderado de imagem (Figura 3B) detalhadas na seção 4 do presente protocolo. Embora só mostramos uma foto de toda a matriz tomada em diferentes níveis no cérebro, o tamanho do volume tanto hemorragia e acidente vascular cerebral pode ser identificado em diferentes níveis e áreas do cérebro e quantificado em cada ponto de tempo desejado pelo investigador. A quantificação é concluída usando o software específico MRI máquina específico para Imageador do investigador. O TTC manchando os resultados, conforme mostrado na Figura 3 pode ser usado para delinear o tecido cerebral, em que as células ainda estão metabolicamente ativas além daqueles que não são. TTC será reduzido enzimaticamente para resultar em células vivas manchadas vermelhas, Considerando que as células mortas não reterá o TTC e, portanto, não será vermelhas. Por último, a hematoxilina e eosina coloração técnica demonstrada no cérebro canino em Figura 3D resultará na coloração de células vermelhas do sangue vermelho brilhante que pode ser usado para verificar áreas onde ocorreu a hemorragia.
Figura 1: monitoramento do fluxo de sangue da carótida. (A) velocidade de sangue da artéria carótida representativa (mL/min) gravado a partir do Doppler sonda da linha de base antes da lesão através de sacrifício. (B) representante H & E mancha de ambos obstruído da artéria carótida (inferior) e controle contralateral (topo). Ampliação é a 20 X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: monitoramento do fluxo sanguíneo da carótida por angiografia. Vista de representante angiografia da artéria carótida direita canina. Imagens foram tomadas em linha de base antes da infusão do veículo (A), 60 min após a infusão de veículo (B)e a hora do sacrifício, 4.5 h após oclusão (C). Setas vermelhas indicam o local a bordo do navio do FeCl3-induzido por lesão, onde a fita umbilical foi colocada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: imagens representativas do cérebro canino após tratamento veículo. Ressonância magnética (MRI) realizada ~ 4 h após a oclusão, imediatamente antes do sacrifício, utilizando a imagem latente difusão-tornada mais pesada (DWI, (A) e T2 ponderado de imagem b. TTC coloração da seção medial no momento do sacrifício para delinear vivo de tecido morto (C). H & E mancha de medial seção, imediatamente proximal à seção TTC, a hora do sacrifício para delinear o tecido que são metabolicamente ativo (vermelho) daqueles que não são TTC é reduzido a um produto vermelho quando ocupados por células vivas e, portanto, irá resultar em seções que podem ser quantificadas com uma infinidade de programas para rastreamento vivem morto regiões vs. (D). , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetro experimental | T2-weighted | Difusão-tornado mais pesado |
| Ms de tempo (TR) de repetição | 4000 | 4600 |
| Echo (TS) de tempo ms | 75 | 86 |
| Inverter o ângulo, em graus | 180 | 90 |
| Matriz de aquisição | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Número de médias | 2 | 4 |
| Em resolução de imagem de avião (pixels/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tabela 1: parâmetros de imagem latente de ressonância magnética (MRI). Parâmetros de MRI que foram desenvolvidos de canino T2 e difusão-ponderada de imagens para maximizar para avaliação de medição de volume de acidente vascular cerebral e hemorragia no modelo de trombose da artéria carótida canina.
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Discussion
O modelo de lesão vascular induzida FeCl3 é amplamente utilizado para estudar a trombose em pequenos animais e é fácil de se traduzir em um modelo animal, pré-clínicos grande com uma infinidade de vantagens. Pequenas modificações para adaptar o protocolo em um canino permitem a utilização de ambas as imagens de ressonância magnética para avaliar volumes de acidente vascular cerebral e hemorragia após uma intervenção farmacológica e a angiografia para avaliar a canalização de navio antes, durante, e após o tratamento. Outros modelos animais grandes trombóticos não estudei trombos oclusivos estabilizados no local da lesão e, portanto, não podem utilizar a angiografia e histologia da artéria carótida para avaliar o grau de re-canalização para cada profilático ou trombolítica tratamento. Além das vantagens de um animal grande incluem amplo tecido para análise (plasma, urina, órgãos para estudos de toxicidade, etc.), o modelo animal grande muito mais estreitamente imita a frequência cardíaca, pressão arterial e cascata de coagulação em seres humanos do que os modelos de roedores. Tamanho adequado das artérias do cérebro e a artéria carótida, resultado em material histológico e biológico que pode ser usado para uma infinidade de investigações bioquímicas e inflamatórias sobre cada animal experimental. Outra vantagem de modificar o FeCl3-modelo vascular induzida em um canino é que um volume muito maior de sangue pode ser extraído durante o experimento sem modificar plaquetas reatividade ou trombos formação tal que o sangue de gás e sangue completo contagens podem ser monitoradas durante a infusão de lesão e drogas. Além disso, a lesão de cloreto férrico tem sido atribuída ao dano oxidante; Portanto, ela imitará aterosclerótico danos que precede clínica acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio, muito mais perto do que os outros tipos de publicado lesão arterial modelos7. Por último, intervenções mecânicas como trombectomia, que são rotineiramente usadas clinicamente, podem acompanhar tratamento farmacológico para que re-estenose e o status de saúde da parede endotelial podem ser tratadas com amplo tecido histológico para múltiplas investigações sobre o canino mesmo.
As limitações deste modelo são poucos, mas precisam ser considerados. Primeiro, embora o ponto de tempo e o tratamento escolhido nesta publicação (sacrificar 4,5 h após a lesão da artéria carótida, veículo) não resultou em um acidente vascular cerebral mensurável ou hemorragia, esse método é clinicamente relevante para a investigação de romance anti-trombótica e agentes trombolíticos para determinar a eficácia e a dosagem. Na verdade, acidente vascular cerebral e/ou hemorragia com a inicial trombótica insulta ou com tratamento farmacológico (i.e., rTPA) ocorrem com este modelo. Em segundo lugar, caninos custos para aquisição, transporte, manipulação genética e diárias são bastante elevados e custam proibitivos, até que a droga é bem caracterizada em modelos de roedores.
Passos críticos no centro de protocolo na Ativação plaquetária, a agregação e a adesão, o cerne da trombose. Desde que o analisador de função plaquetária (PFA-100) podem ser executado com 1600 µ l de sangue total em duplicado, este método é simples e fácil de controlar a reatividade plaquetária durante todo o procedimento sem afetar a homeostase do sangue. Mais estudos ex vivo em atividade plaquetária usando impedância ou lumi-aggregometry podem ser realizados antes da lesão vascular sem afetar a trombose experimental, enquanto a última recolha de sangue é > 1 semana antes da cirurgia, além de, após lesão e o tratamento na hora do sacrifício. Como já discutido, aplicações adicionais de fita umbilical embebido em 50% FeCl3 pode ser necessário em função do sexo, raça ou idade de cada canino. Nós permitido 30 minutos após a lesão para oclusão e reaplicado fresco 50% FeCl3 por mais 15 minutos se necessário. Este processo não resultou em uma diferença significativa no desvio trombolítica com idade ou sexo usando beagles adultos. Neste estudo, podemos ter elucidado a difusão crítica e estado-da-arte imagem ponderada (DWI), um Sr. imagem latente baseada na medição de movimento browniano (difusão aleatório de partículas) de moléculas de água dentro do voxel de tecido. Essa técnica é útil para detecção de isquemia aguda, entre outras patologias tais como tumores por difusão mostrando em tecidos de hipercelular ou aqueles com inchaço celular é baixa com maior difusão coeficiente17,18 ,19. Mapas de Difusão variam com a difusão das moléculas de água no cérebro tecido17,18,19. O valor de B mede o gradiente para a difusão de moléculas de H2O. No local da lesão isquêmica, a água livre experiências mais forte atenuação de sinal no mais elevado valores B19.
Além da utilização deste protocolo canino para estudos na dosagem, toxicidade e eficácia dos agentes profiláticos e trombolíticos, do tamanho de um canino faz experimentos em trombectomia mecânica clinicamente relevantes e facilmente atingíveis. Carótidas podem ser facilmente processadas, manchada e avaliados utilizando protocolos para histologia humana para estudo da infiltração de células imunes após a recuperação do coágulo. Estes estudos serão nossos protocolos detalhados na próxima.
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Disclosures
Nenhum
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer o centro cognitiva e comportamental cérebro Imaging no The Ohio State University, pelo apoio financeiro e científico desenvolver e executar a canina imagiologia por ressonância magnética.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
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