Summary
Burada, bir büyük hayvan vasküler yaralanma modelinde kullanım için de karakterize ve yaygın olarak kullanılan küçük bir hayvan ferrik klorid kaynaklı (FeCl3) karotis arter yaralanması model için gerekli değişiklikler mevcut. Elde edilen modeli profilaktik ve trombolitik farmakolojik ve mekanik müdahaleler önceden klinik deneme değerlendirilmesi için yararlı olabilir.
Abstract
Serebral iskemik inme ve miyokard infarktüsü yol tıkayıcı arteryel tromboz, genel olarak her yıl ~ 13 milyon ölüme katkıda bulunur. Burada, biz küçük bir hayvan bir vasküler yaralanma modeli büyük bir hayvan (köpek), profilaktik ve trombolitik ajanların önceden klinik tarama için kullanılan hafif değişiklikler ile tercüme var. Cerrahi yöntemlere ek olarak, değiştirilmiş Protokolü anjiyografi, karotid arter kanalizasyon değerlendirmek için adım adım yöntemler beyin ve karotid arter karotis doğrulamak histolojik analizler için işlemek için ayrıntılı yönergeler anlatılmaktadır. kanalizasyon ve beyin kanaması ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanarak aşağı akım tromboembolik olaylar bir değerlendirmesini tamamlamak için belirli parametreleri. Ayrıca, daha önce köklü küçük hayvan modeli büyük hayvan (köpek) vasküler yaralanma çevirmek gerekli belirli yordam değişiklikleri ele alınmıştır.
Introduction
Esas olarak kardiyovasküler hastalık müdahaleler de ilaç tedavisi ve endovasküler müdahaleler1' e tepki vermiş çünkü felç tedavisi büyük ölçüde koroner arter hastalığı tedaviden sonra modellenmiştir. Bu tedaviler, ancak, başarıyla için beyin enfarktüsü tercüme var değil. Geçerli kontur tedavi zorluklarla rekombinant doku plazminojen aktivatör (rTPA) geri alınamaz ve yönetim hemorajik dönüşüm2,3, bir % 6.4 risk taşıyan vardır 4. elde edilen morbidite ve mortalite sınırlar kendi kullanımı için bir küçük, genellikle ulaşılamaz bir pencere5. Ayrıca, restenoz ve tıkanıklığı ilk nörolojik gelişme tersine kez ilk thrombolysis sonra ortaya. Özetle, iskemik serebrovasküler hakaret muzdarip hastaların büyük çoğunluğu (~ %90) hariç rTPA yönetmek için dar bir zamansal pencere var.
İntravenöz antiplatelet tedavi rolü gelişmiş gemi recanalization, hayatta kalma ve sonucu2ile iskemik inme tedavisinde söz göstermiştir. Ne yazık ki, bu ilaçların intra-kranyal ve ekstra kranial kanama tahmin edilebilir bir yan etkisi, büyük ölçüde yolu çünkü yeterince ters ya da onların etkinlik2kontrol. Trombosit toplama önlemede etkili, kanama ve faaliyetlerini tersine çevirmek için yetersizlik riski inme hastalarında bakım rutin kullanımları engellemiştir. Bir ihtiyaç, bu nedenle, tek başına veya kombinasyonlarda önlemek ve pıhtıları koşullar için hareket henüz nerede kanama kötü tolere edilir beyin gibi kapalı, düşük birim alanı kullanımda sağlayacak bir emanet profile sahip güçlü Antitrombotik ilaçlar için bulunmaktadır.
Arteryel tromboz ve re-stenoz mekanizmasını anlamak ve değerlendirmek trombolitik ve re-stenoz, engelleyen ilaçlar hem küçük hem de büyük hayvan modelleri önceden klinik ilaç geliştirme bir parçası olarak gerektirir. Vasküler yaralanma ferrik klorid kaynaklı olu_umu fare, sıçan, eskiden şiling şimdi pigs, maruz kalan kan damarları oluşumunu hızla ve doğru bir şekilde ikna etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve6,7,8, tavşan 9 , 10 , 11 , 12. küçük bu türlerin genetik manipülasyon, ucuz hayvan satın alma ve başına harcırah konut maliyetleri düşük kolaylığı dahil olmak üzere birkaç avantaj sunar. Ne yazık ki, küçük hayvan deneyleri erişim trombosit reaktivitesini, kan gazı analizi ve inflamatuar yanıt için ameliyat sırasında birden çok kan berabere inkâr. Daha da önemlisi, büyük hayvanlar çok daha yakından insan trombosit fizyolojisi6,13taklit. FeCl3 karotis arter yaralanması modeli trombozu Patofizyoloji incelenmesi, roman Anti-trombosit ve anti-koagulant uyuşturucu doğrulanmasını ve potansiyel trombolitik6 keşfi baskın bir rol oynamıştır , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. önceki modelleri farelerde, sıçanlar, eskiden şiling şimdi pigs ve tavşan olması koşuluyla kolaylığı ve esnekliği genetik manipülasyon için ama çevrilebilir önceden klinik modelleri hasta dozaj ve toksisite çalışmaları potansiyel therapeutics6 için kritik ,13. Farelerde periferik damar hastalığı için geçerlidir büyük hayvan kan pıhtılaşması modelleri trombotik bozuklukları çeşitli modeller geliştirilmiştir kontur ve miyokard infarktüsü az ve uzak olmakla birlikte. İlk kan pıhtılaşması modelleri de maymunlar, köpek ve domuz stenoz, hemostats ve daha sonra silindir damarları sık döngüsel akışı indirimleri14,15,16' kaynaklanan, uygulama üzerinde duruldu. Bir tıkayıcı trombüsü alanında ferrik klorid modeli olarak endotel hasar yerine trombüsü bu modellerde döngüsel trombozu, distal embolizasyon sonuçlandı ve normal kan akımını döndürür. Buna karşılık, ferrik klorid modeli burada büyük bir hayvan, bir tıkayıcı trombüsü yaralanma sitesinde sonuçlarında değiştirilen stabilize ve anjiyografi trombolitik tedavi öncesi tarafından doğrulanmadı. Araştırmacı başına Diem ve köpek dişleri ve yeterli cerrahi uzmanlık satın alma, biz burada büyük köpek manken vasküler yaralanma laboratuvarları trombozu kullanmak cerrahi, görüntüleme ve histolojik çalışma izin vermek için ayrıntılı için yeterli para olması koşuluyla teknikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan soruşturma bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri için ana hatlara uygun ve Ohio Devlet Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (#2015A00000029) tarafından kabul edildi. Tüm cerrahi işlemler derin anestezi altında gerçekleştirilen ve hayvanlar ağrı herhangi bir aşamada işlem sırasında deneyimim olmadı. Tüm deneyler açıklanan kurtarma sigara.
1. hazırlık
- Taze 50 mL deiyonize suyla seyreltik % 50 (w/v) ferrik klorid (FeCl3) hazırlayın.
- Göbek bandı 5.5 cm parçalar halinde kesilmiş ve taze hazırlanmış % 50 FeCl3 çözüm 1 hafta önce yordamı ıslatın.
Not: kullanılan göbek bandı kalın ve % 50 FeCl3 çözüm emmek için biraz zaman alır. - Her köpek bir gecede ameliyattan önce hızlı.
- Etiket cryovials plazma ve idrar koleksiyonu için 50 mL steril santrifüj tüpleri için tüm organ depolama ve H & E boyama hayvan kimlik, Doğum tarihi, tarihi ameliyat ve tedavi için beyin ve karotis fiksasyonu için % 10 formalin kaplar.
- Köpek her yordam için 100 mL her çözeltisi hazırlamak: % 4 paraformaldehyde tamponlanmış fosfat tamponlu tuz (pH 7,4), % 10 tarafsız olarak formalin ve % 2 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür [TTC PBS (pH 7,4), içinde saklamak karanlıkta].
- Tüm cryovials için bol bol sıvı azot ve 50 mL doku tüpler yordamı günü için buz gibi flash için kazanmak.
- PFA-100 (trombosit işlev Analyzer) trombosit reaktivitesini ilgi her zaman için her köpek için iki ADP/kollajen kayaklar elde etmek.
- Bir 4.5 mL sodyum sitrat kan toplama Tüp, fedakarlık, plazma ayırma ve depolama için önce her kan alımı için kazanmak. Kurban, 16 kan toplama tüpler plazma muhafazası için çizin. Her kan toplama tüp dolu sonra 4.000 x g 30 spin trombosit zengin plazma ve transfer izole etmek için s cryovials katman temizleyin. Depolama-80 ° C'de önce sıvı azot flaş donma
- Bir 4.5 mL lityum heparin kan toplama Tüp, kayıt trombosit reaktivitesini ilgilendiren her PFA-100 saat için kazanmak. Her kan alımı 800 µL bütün kan trombosit reaktivitesini takip etmek hava kabarcığı olmadan her ADP/kollajen kartuş içine lityum heparin kan toplama tüpler tanıtmak.
- İki EDTA K3 kan toplama tüp (susuz EDTA 1 mL kan başına 1.8 mg), tam kan sayımı (CBC) için temel ve kurban anında elde etmek.
Not: Bu birimin her mekanik hata durumunda iki kez çalıştırmak en temel özellikleri için yeterlidir. Tam kan sayımı yaralanma önce her iki temel ve kurban anında çalıştırıldığı, müfettişler daha fazla kan için ek değerlendirmeler olduğu gibi onların hayvan protokolleri onaylı çizer ekleyebilirsiniz. Tesisin birimleri ve kendi ekipman için teslim gerekleri ile kontrol edin. - 2 mL heparinized şırınga doldurma ve şırınga yordamı zaman kurban günü kan gaz analizi için kaplama hazırlayın.
Not: tesisi birimleri ve kendi ekipman için teslim gerekleri ile kontrol edin.
2. köpek karotid arter tıkanıklığı
- Yetişkin ağırlığı (> 18 ay) beagle köpek ve kas içi acepromazine ile önceden ilaçlama (0,025-.2 mg/kg) ketamin (5-20 mg/kg) ve midazolam bir ilk mayi enjeksiyon tarafından takip (0.01-.25 mg/kg). Kalp atışı, solunum ve çene sesi göre % 1-5 isoflurane ile daha derin anestezi neden.
Not: Tam anestezi ağırlığı ve onaylanmış hayvan iletişim kuralı tarafından dikte edilir. Enjeksiyonları hayvanlar için ağrı neden olabilir rağmen bu rahatsızlık süresi minimum olacağı (fazla 3 s). - Cerrahi tabloya hayvan çekim işleminden önce saç kırpma tarafından kaldırın. Kuruluğu önlemek için imzalat hayvanın gözleri oftalmik merhem yağlama uygulanır.
- Hayvan bir konumlandırma sistemi kullanarak sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve ayak elektrokardiyografi (EKG) müşteri adayları ekleyebilirsiniz yastıkları. 6.5 mm kelepçeli Endotrakeal tüp ile trakea üzerinden entübasyon, mekanik olarak 14 nefes/dk havalandırın ve her köpek (onaylanmış hayvan protokol bağlıdır) % 1-5 isoflurane sürekli bir inhalasyon ile korumak.
- Boyun arterine kanalizasyon ve tıkayıcı trombüsü uzunluğu kapsamını belirlemek için anjiyografi yaralanma, önce MRG ve zamanda kurban (ek yönergeler için aşağıya bakınız) önce gerçekleştirin.
- Femoral arteryel kılıf ve plastik bir kateter takın ve gevşek bir 0 ipek sütür ile güvenli. Geçici olarak kılıf ve kateter taşıma ve görüntüleme çalışmaları sırasında kapatın. Aşağıda köpek anjiyografi ek talimatlar için bkz.).
- Kan berabere için distal femoral arteryel kılıf site kesmek için bozulmamış deri yoluyla bir 16G x 45 mm intravenöz kateter takın. Kateter cerrahi pozlama ilerlemek ve arteryel kılıf hemen bitişik maruz femoral ven içine girerken görselleştirin. Tam damar içine eklendikten sonra iğne çekmek, bir 3-yönlü stopcock sondayla kap ve 2 mL % 0,9 steril serum fizyolojik ile yıkayın. Kateter 0 ipek sütür ile cilt için güvenli.
- Deri bir 8-10 cm kesi yapmak doğrudan şu ortak karotid arter bölge üst kısmında ve fasya çevreleyen doku gemiden yalıtmak için incelemek.
- Dikkatle forseps karotid arter ve ayırmak için vagus siniri arasında tanıtmak. Karotid arter daralma geminin neden olabilir daha fazla gerekli dokunmaktan kaçının.
- Arter FeCl3 çözüm seyreltme önlemek için steril gazlı bez ile açık alan kuru.
- Yer Doppler sonda eşkin alan akışı sonda dokunmadan göbek bandı şahdamarına etrafında sarın ve kan hız kaydetmeye başlamak için izin karotis etrafında akış ve yordam (Şekil 1 Top) devam edin. Temel akış için kayıt ~ 5 dk önce göbek bandı uygulamak.
Not: Temel akış FeCl3 göbek bandı yerleşim önce genellikle yaklaşık 250 mL/dk ortalamasını alır. - Hazırlanan FeCl3 göbek bandı 15 dk, çıkarmak ve silmek için dokunmadan bir hemostat hemen altındaki akışı sonda kullanarak karotis etrafında sarın.
Not: Tıkanıklığı sıfır akışı mL/dk belirlenmiştir. - 45 dk. Ekle ek salin için bir sinyal korumak için gerektiğinde sonda için tıkayıcı trombüsü stabilize.
Not: bağlı olarak yaş, cinsiyet ve köpek, ek yerleşim hazırlanan FeCl3 göbek bandı türünü 30 dk önce yeniden başvuru yapılmasına tıkanıklığı için izin verdiği için gerekli olabilir. Hiçbir farkı yoktur biatriyal trombus beagles toplumsal cinsiyet ile ferrik klorid uygulama tarafından tespit edildi. Yeni bir FeCl3 göbek kaset birden çok kez yeniden uygulayın ve FeCl3 göbek bandı hazırlık iletişim kuralından asla sapma bu model ile gerekli bulundu. Laboratuvar farklı cins veya köpek,3 göbek bandı trombozu Protokolü sapma veya bir grup köpek dişi FeCl3 kurmak için gerekli olabilir emin olmak için ilk konular için uygulanması gereken FeCl yaşın kullanıyorsanız Bu cins veya kendi özel çalışma yaş uygulama zamanı. Tıkanıklığı zamanlarda, bu deney, 8-30 dakika sonra FeCl3 göbek bandı uygulama arasında değişir. - Farmakolojik müdahaleler neden olabilir aşağı akım tromboembolik olaylar yanı sıra inme ya da kanama cilt belirlemek için köpek dişleri bir manyetik rezonans görüntüleme makineye (için aşağıya bakınız ek ketamin enjeksiyonlu taşıma ek bir işlem).
- Bir derin cerrahi boyutunda bir son anjiyo/zararlı uyaranlara yanıt eksikliği ile gösterilen MRG (için aşağıya bakınız görüntüleme Protokolü), anesteziden iken, hala altında tam istenen daha sonraki analizler için kan toplamak, sonra göğüs kaburga ile kesme açın göğüs kemiği ve tüketim kalp kan damarları (kan kaybı) kesim tarafından başlayarak.
Not: bütün bu deneyde, kan (< 10 mL) taban çizgisi, 5 dk sonra agent yönetimi ve 60 dk infüzyon sonra femoral kılıf çizilmiş ve thrombolysis sürecinin etkisi gördüm. Kurban, sınırsız bir birim hayvan protokolünde onaylandığı takdirde ek plazma depolama için çizilebilir. Analiz etmek, işlemek ve tüm tam kan kurban 30 dk içinde saklayın. Kan hayvanın vücut ağırlığı detaylı olarak onaylanmış yüzdesi aşan onaylanmış hayvan iletişim kuralı üzerinde çizilir değil emin olun. Tüm deneyler açıklanan kurtarma sigara. - Kalp % 0,9 serum fizyolojik ile durulayın ve flaş dondurma örnekleri sıvı azot isterseniz.
- Şahdamarı kaldırmadan önce bir cetvel ve kayıt yanında yerleştirerek pıhtı uzunluğu ölçmek. Doku işaret orta pıhtı ve kontralateral karotis Histoloji kırpma kolaylaştırmak için aynı yere yerleştirin. Aynı uzunlukta, kontralateral karotis işaretleyin.
Not: Ortalama pıhtı bu model ile 1.75 cm uzunluğundadır. - Her iki gemi üzerinde pıhtı tüm uzunluğu kaldırmak ve % 10 formalin içinde düzeltmek. Doku marker tarafından işaretlenmiş uzunluğu içinde kontralateral karotid arter kaldırın. Kontralateral karotid arter pıhtı orta ikiye böldüm. Flash daha sonraki analizler için sıvı azot yarım kontralateral şahdamarı dondurma ve diğer yarısını da yanında histolojik Analizi aşağıdaki için yaralı karotis katıştırmak için % 10 formalin düzeltmek.
- Organları istenen herhangi bir analiz için kaldırmak için % 0,9 serum ve flaş donma sıvı azot ile durulayın.
- Dairesel testere ile kafatasını. Yavaş yavaş altında beyin zarar vermeden kafatasını.
- Beyin kafatasından kaldırıldıktan sonra soğuk % 0,9 salin durulayın ve iki 4 mm bölüm keskin neşterle yanal kesme beynin orta kesim. 4 mm bölümlerden birini %2 yerleştirmek için iskemik sınır (bkz: beyin TTC için işleme ek), TTC H & E (bkz. ek işleme için beyin H & E) boyama için 7 gün için % 10 formalin içinde diğer dilim yerleştirilmiş iken.
3. köpek anjiyografi
Not: Bu Şekil 2 ' de gösterilen ve zaman makas-in ilgi, ameliyat sırasında yapılır.
- Nabzı şu kasık bölgesi için hissediyorum ve bir 3-5 cm ventral sagittal kesi yapmak.
- Femoral arter açığa ve künt diseksiyon kullanarak çevre dokulardan ayırın.
- Bir dik açı hemostat 0-ipek dikiş maruz arter distal ucunda eklemenizi sağlar.
- Distal 0 ipek sütür kravat ve hafif gerginlik hemostats kabuğuyla gevşek 0 ipek sütür biter sıkma tarafından arter ile uygulayın.
- İkinci 0-ipek dikiş maruz kalan kesimi proksimal ucunda yerleştirin.
- Bir kılavuz tel arter geçmek için bir 18 G uygulayıcıya iğne kullanarak proksimal ve distal 0 ipek sütür bağları arasında arter orta delik.
- Bir monte 6Fr kılıf ve dilatör derlemeden mürekkebin tel açgözlü kılavuz tel üzerine yükleyin.
- Dilatör ve kılıf kılavuz tel üzerinden önceden. Dilatör kılıf derleme ilerleyen süre dilatör çıkıntı olarak Tel sağlam bir kavrayışa korumak emin olun.
- Tam eklemeden sonra proksimal 0 ipek sütür hemostaz arteryel ponksiyon sitesinde korumak için kılıf etrafında kravat.
- Aynı anda dilatör ve Kılavuzu kaldırın.
- Tek yönlü vana pulsatil kan akımı varlığını denetlemek ve normal salin ile 3-5 mL sifonu açın.
- Erişim kılıf tek yönlü vana bir sıvı dolgulu dahili hatta bir basınç detektörler monitör ve kayıt invaziv kan basınç ölçümleri için bağlı bağlayın.
- Bir 0.35" kılavuz tel 4Fr. anjiyografik kateter içine ön yük ve tanses y-adaptör ile ayarlamak karşıtlık enjeksiyon manifold bağlanın.
- Kateterin distal ucu içinde kılavuz tel ucu çekin ve tüm montaj serum fizyolojik ile yıkayın.
- Anjiyografik kateter kılıf kan durdurucu sargı kapak içine yerleştirin ve sonra kılavuz tel yaklaşık 5 cm distal kateter ucu ötesinde ilerlemek.
- Yavaş yavaş floroskopik kılavuz ve retrograd bir trans-aort yaklaşım kullanarak altında katater aort önceden.
- 2-3 mL kontrast seyreltilmiş Ajan 1:1 kalkış brachiocephalic gövde tanımlamak için normal serum enjekte.
- Kılavuzu kateter brachiocephalic gövde içine yönlendirmek için kullanın ve sonra seçmeli olarak şu ortak karotid arter içine.
- Kılavuzu kaldır ve kateter karotis yerleştirilir doğrulamak için seyreltilmiş kontrast 2-3 mL enjekte.
- 3-4 mL su katılmamış kontrast dijital çıkarma ve standart anjiyografik teknikleri kullanarak anjiyografik çalışmalarını kaydederken enjekte.
- Ek süre noktalarda tekrarlanan anjiyografi için adımları 3.18-3.21 yineleyin.
4. manyetik rezonans - difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DAG) ve T2 ağırlıklı (T2WI) köpek beyin görüntüleme
Not: Bu Şekil 3Agösterilir-3B.
- Köpek derin anestezi altında olduğundan emin olun.
- Köpeğin fizyolojik parametreler EKG ve kalp hızı da dahil olmak üzere görüntüleme boyunca izlenir sağlamak.
- Köpek sırtüstü pozisyonda beyin bobin ikili açıklıklar başının yatıyor emin olun.
- 3 Tesla (3T) mıknatıs etkinleştirin.
- T2 ağırlıklı görüntüleme (T2WI), Mr'ı temel nabız serilerinde gerçekleştirin.
Not: Sıra T2 gevşeme zamanı dokuların farklılıkları farklı patolojik koşulları kullanır. - Dedektör köpek beyin degrade Eko T2 ağırlıklı sıra Imaging kullanarak anatomik görüntüleme önce pilot görüntüleri görüntüleme gerçekleştirmek ve görüş alanı (FOV), dilimleri ve dilim kalınlığı tamamen beyin kapsayacak şekilde sayısını belirlemek.
- Aşağıdaki T2-parametreleri kullanın: dilim kalınlığı = 3 mm, TR 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = = 7, edinme matris 320 x 256, SK = 180ᵒ, FOV = = 320 x 320 piksel, görüntü çözünürlüğü 2.4615 piksel / mm =.
- MCA tıkanıklığı sonra hemen önce kurban yankı planer DTI sırası 4 h kullanılarak difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DAG) gerçekleştirin.
- Aşağıdaki DWI parametreleri kullanın: b 1.500 s/mm2, dilim kalınlığı = = 3 mm, TR 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, edinme matris = 140 x 140, SK = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, görüntü çözünürlüğü = = 0.9333 piksel/mm (Tablo 1).
5. Hematoksilen ve eozin (H & E) köpek beyni boyama
Not: Bu şekil 3Dgösterilir.
- 7 günde % 10 formalin sonra parafin içinde 4 mm beyin bölümleri embed.
- Onlar bir microtome, herhangi bir ek parafin beyin dokusunun en baştan çıkarma düzeyiyle sonra beyin dokusu 4 µm kesim ve bir beyin bölümü her 2 "x 3" inç slayt üzerinde yer kadar parafin blok döşeme.
Not: slaytlar bir çözümden başka kurutma olmadan hareket edebilir boyama önce tüm çözümler ayrı kaplarda yerleştirin. - Her beyin slayt de-paraffinize ve musluk suyu ile hidrat.
- Her beyin slayt için 8 dk hematoksilen 560 yerleştirin.
- Her beyin slayt dokunun suyla durulayın.
- Her beyin slayt % 1 ile ayırt asit alkol 1 için s üç kez.
- Her beyin slayt dokunun suyla durulayın.
- Her beyin slaytlar ile % 1 amonyum hidroksit 1 için mavi s.
- Musluk suyu 2 min için çalışan her beyin slayt durulayın.
- Her beyin slayt % 70 kurutmak etanol (alkol) 1 s on iki kez.
- Her beyin slayt eozin 1 dk içinde counterstain.
- Her beyin slayt % 95 kurutmak alkol 1 için s on iki kez.
- % 100 her beyin slayt kurutmak alkol.
- Ksilen içinde her beyin slayt temizleyin ve bir 2 "x 3" inç coverslip hava kabarcıkları reçineli montaj ortam ile kaldırmayı beyin slayt üzerine uygulayın.
Not: Tüm çözümler su ve etanol dışında birden fazla gün boyama ve birden çok slayt için tanımlarlar. Tüm slaytlarda beyin bölümleri yerleştirilir sonra işleme cam kavanoz boyama yapılır ama plastik boyama kaplar da ticari olarak kullanılabilir. Renksiz olur herhangi bir çözüm yerine ve sıkıca kapalı tutun.
6. Hematoksilen ve eozin (H & E) köpek de boyama
Not: Bu Şekil 1 ' de (solda) gösterilir.
- 24-72 h % 10 formalin içinde sonra yaralı karotis pıhtı orta ikiye böldüm ve embed ~ 1 cm yaralı karotis ve ~ aynı parafin kaseti kontralateral denetimi 1 cm.
Not: Boyun arterine içinde kan pıhtısı kırılgandır. Pıhtı değil rahatsız böylece gemi % 10 formalin kesme önce giderilmiştir kadar bekleyin. Her iki yaralı gömme ve karotid arter kontrol aynı parafin blok kesme aynı anda aynı yerde kan damarı sağlayacak. - Parafin blok düzeyi kadar herhangi bir ek parafin kaldırma bir microtome ile döşeme. Sonra 25 mm x 75 mm x 1 mm'lik slaytlar için 4 µm bölümleri kontralateral karotid bölümleri slayt üstündeki yerleştirilmesi parafin blok döndürmeden kesti.
Not: Üç karotid bölüm her slayt üstünde-e doğru yerleştirildi, ancak faiz lekeleri bağlı olarak ekleyebilirsiniz. - Her şah damarı slaydın de-paraffinize ve musluk suyu hidrat.
Not: tek tek işlenip beyin slayt karotid slaytlar toplu olarak birbirine dokunmadan bir defada birkaç slayt uygun kavanozlara koyarak işlenebilir. - Karotid slaytları hematoksilen 8 dakika içinde leke.
- Her şah damarı slaydın dokunun suyla durulayın.
- % 1'ile karotis her slayt ayırt asit alkol 1 için s üç kez.
- Her şah damarı slaydın dokunun suyla durulayın.
- % 1 amonyum hidroksit 1 için karotis her slaytla mavi s.
- Musluk suyu 2 min için çalışan karotid her slayt durulayın.
- Her şah damarı slaydın % 70 kurutmak alkol 1 için s on iki kez.
- Karotid slaytları eozin veya 1 dk. counterstain.
- Karotid slaytları % 95 kurutmak alkol 1 s x 12.
- % 100 karotid her slayt kurutmak alkol.
- Ksilen karotid her slaytta temizleyin ve bir 24 mm x 50 mm coverslip hava kabarcıkları kaldırmak için reçine montaj medya ile ekleyin.
7. 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium klorür (TTC) köpek beyni boyama
Not: Bu rakam 3 ciçinde gösterilir.
- Diğer 4 mm bölümü kaldırılır beyin H & E bölümüne hemen proksimal ortasına önceden yer hazırlanan % 2 TTC (karotis arter tıkanıklığı). En az 20 dk bile her 5 dk boyama için beyin bölümü üzerinden dönerek, 37 ° C'de karanlıkta kuluçkaya.
Not: 20 dk sonra her iki tarafta Kırmızı Kiraz bölümü olması gerekir. Ek süre TTC tazelik ve doku bölümü kalınlığına göre gerekli olabilir. - TTC çözümü kaldırmak ve PBS, pH 7.4 renk karşıtlığını optimize etmek için %4 paraformaldehyde ile değiştirin.
- Beyaz ve kırmızı boyama arasında kontrast en uygun olduğunda, TTC Beyin dilimleri arasında şeffaf plastik levhalar, aşırı sıvı kuru ve tarama izleme iskemik bölgeler için yüksek çözünürlükte yerleştirin.
Not: Bölümler süresiz olarak paraformaldehyde çözümünde depolanabilir, ancak boyama fade olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada ayrıntılı yordamlar aşağıdaki tıkayıcı damar müdahaleler profilaktik veya trombolitik değerlendirilmesi için kullanılabilir bir model geliştirilmesi neden olur. Şekil 1A , sırasında işlemden önce ve sonra bir ticari yazılım tarafından kaydedilen satır taban çizgisi akım hızları ve elde edilen kan akım hızı gösterir. Bu kayıt verileri yeniden perfüzyon karotid arter yaralanması ve tedavisi köpek bu modelde yüzde belirlemek için kullanılabilir. Şekil 1B H & yeniden kanalizasyon durumu kurban anda doğrular E ile lekeli yaralı (alt) köpek karotid bölümler ve kontralateral (üst) gösteren bir örnek sağlar. Yazılım programları çok sayıda gemi perfused alan toplam alan kanalizasyon her tedavi ile yüzde ulaşmak için geminin bölünüp bölünemeyeceğini kan damarı (olmadan trombüsü) izini sürerek çözümlemek için kullanılabilir. Şekil 2 bu köpek trombüsü tıkayıcı olup olmadığını belirlemek için kullanılan iletişim kuralı görüntüleme ayrıntılı karotid arter anjiyografi çeşitli örnekler gösterir. Buna ek olarak, kare akışı sonda bir işareti olarak kullanarak, müfettişler anjiyo alınır her zaman noktasında trombüsü uzunluğunu belirleyebilirsiniz. Her ne kadar burada biz yaralanma, 60 dk sonra araç tedavi ve kurban, zaman önce görüntüleri sundu, araştırmacı görüntüleme onların ihtiyaçlarına göre uyarlayabilirsiniz. Şekil 3 köpek beyne uygulanan manyetik görüntüleme parametrelerinin sonucudur ~ 4 h karotid arter tıkanıklığı hemen kurban kullanmak difüzyon ağırlıklı (Şekil 3A) ve T2 önce sonra ağırlıklı (Şekil 3B) görüntüleme Bu protokolün 4 bölümünde ayrıntılı. Biz sadece beyinde farklı düzeylerde alınan tüm diziyi bir fotoğraf göstermesine rağmen kanama ve kontur birimin boyutunu farklı düzeyleri ve beyin bölgelerinde tespit ve araştırmacı tarafından istenen her zaman noktasında quantitated. Nefelometri belirli MRI makinesi yazılım Müfettiş'ın Imager için belirli kullanarak tamamlanır. Sonuçları Şekil 3 c içinde gösterildiği gibi boyama TTC beyin dokusu hücreleri hala olmayan bu ek olarak metabolik olarak aktif olan betimlemek için kullanılabilir. TTC enzimatik ölü hücreleri TTC tutulmaz ve böylece kırmızı olmayacaktır, ancak kırmızı lekeli canlı hücrelerde neden düşecektir. Son olarak, Hematoksilen ve Şekil 3D köpek beyin içinde gösterilen teknik boyama eozin kırmızı kan hücreleri boyama sonuçlanacaktır kanama oluştuğu alanları doğrulamak için kullanılan parlak kırmızı.
Şekil 1: karotis kan akışını izleme. (A) temsilcisi karotid arter kan hız (mL/dk) kaydedilen Doppler taban çizgisinden önce yaralanma kurban aracılığıyla sondayı. (B) temsilcisi H & E her ikisi de boyama karotid arter (alt) ve kontralateral kontrol (üst) tıkandı. Büyütme 20 X'dir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: anjiyografi ile karotis kan akışını izleme. Şu köpek karotid arter temsilcisi anjiyografi görünümü. Görüntüleri temel araç infüzyon (A), araç infüzyon (B), sonra 60 dk önce ve anında kurban, 4.5 tıkanıklığı (C)sonra s alındı. Kırmızı oklar, geminin FeCl3konumunda gösterir-göbek bandı yerleştirildiği yaralanma indüklenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: araç tedaviden sonra köpek beynin temsilcisi görüntüler. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) gerçekleştirilen ~ 4 h tıkanıklığı, hemen önce kurban, sonra difüzyon ağırlıklı görüntüleme kullanmak (DAG, (A) ve T2 ağırlıklı görüntüleme (B). TTC medial bölümüne betimlemek için fedakârlık anda boyama canlı ölü dokudan (C). H & E medial boyama bölümünde, TTC bölümüne hemen proksimal, metabolik olarak olan doku betimlemek için kurban zamanda aktif (kırmızı) TTC olmayanlar üzerinden kırmızı bir ürüne canlı hücreleri tarafından alındığında azalır ve bu nedenle, neden olur yazılım izleme için bir sürü ile sayısal bölümlerde vs ölü bölgeler yaşıyorum. (D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Deneysel parametresi | T2 ağırlıklı | Difüzyon ağırlıklı |
| Yineleme süresi (TR) ms | 4000 | 4600 |
| Yankı süresi (TS) ms | 75 | 86 |
| Açısı, derece çevir | 180 | 90 |
| Edinme matris | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Ortalamalar sayısını | 2 | 4 |
| Uçak görüntü çözünürlüğü (piksel/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tablo 1: manyetik rezonans görüntüleme (MRG) parametreleri. Köpek T2 ve difüzyon-ağırlıklı resimlerini köpek karotid arter trombozu modelindeki kontur ve kanama birim ölçümü değerlendirilmesi için en üst düzeye çıkarmak için geliştirilen MRG parametreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FeCl3 indüklenen vasküler yaralanma modeli biatriyal trombus küçük hayvanlar incelemek için yaygın olarak kullanılır ve bir sürü avantajı ile büyük bir hayvan, önceden klinik model çevirmek kolaydır. Protokol bir köpek adapte hafif değişiklikler izin bir farmakolojik müdahale ve anjiyografi damar kanalizasyon daha önce değerlendirmek için sonra kontur ve kanama birimleri değerlendirmek için her iki manyetik rezonans görüntüleme kullanımı sırasında ve tedaviden sonra. Trombotik büyük hayvan modellerin stabilize tıkayıcı olu_umu yaralanma yerinde inceledik değil ve bu nedenle anjiyografi ve histoloji yeniden kanalizasyon her hastalık koruyucusu için veya trombolitik ölçüde değerlendirmek için karotid arter kullanmak değil tedavi. Analiz (plazma, idrar, organları toksisite araştırmaları, vb) için yeterli doku dahil avantajları büyük bir hayvanı yanı sıra, büyük hayvan modeli çok daha yakından kalp hızı, kan basıncı ve koagülasyon cascade insanlarda taklit eder kemirgen modeller daha. Yeterli boyutunu beyin ve karotis arter, enflamatuar ve biyokimyasal araştırmalar her deneysel hayvan üzerinde bir bolluk için kullanılan histolojik ve biyolojik malzeme sonuçlanır. Bir diğer avantajı FeCl3değiştirme-vasküler modele bağlı bir köpek olduğunu çok daha büyük bir kan hacmi bu gaz ve tam kan kan trombosit reaktivitesini veya trombüsü oluşumu böyle değişiklik olmadan deneme sırasında elde edilebilir sayıları yaralanma ve uyuşturucu infüzyon izlenebilir. Buna ek olarak, ferrik klorid yaralanma oksidan damage sanılıyor; Bu nedenle, klinik kontur ve miyokard infarktüsü çok daha yakın diğer türleri arteryel yaralanma modelleri7yayınlanan daha önce gelir aterosklerotik hasar taklit. Son olarak, böylece Re-stenoz ve endotel duvar sağlık durumunu birden çok geniş histolojik dokusu ile saptanabilir rutin klinik olarak kullanılan, mekanik müdahaleler gibi thrombectomy, farmakolojik tedavi takip edebilirsiniz aynı köpek üzerine araştırmalar.
Bu modelin kısıtlamaları azdır ama dikkate alınması gerekir. İlk, her ne kadar zaman nokta ve bu yayında seçilen tedavi (4.5 h karotid arter yaralanması sonra kurban araç) bir ölçülebilir inme ya da kanama sonucu değil, bu yöntem klinik olarak Roman anti-trombotik soruşturma için uygundur ve trombolitik ajanların etkinliği ve dozaj belirlemektir. Gerçekten de, hem kontur ve/veya kanama ilk trombotik hakaret veya farmakolojik tedavi (Örneğin, rTPA) ile bu model ile görülebilmektedir. İkinci olarak, satın alma, nakliye, genetik manipülasyon ve per diem köpek maliyeti oldukça yüksek ve bir uyuşturucu kemirgen modellerinde iyi karakterize olana engelleyici maliyet.
Trombosit aktivasyon, toplama ve yapışma, tromboz dönüm noktası protokol merkezi kritik adımlar. Trombosit işlev Analyzer (PFA-100) 1600 µL yinelenen bütün kan ile yapılabilir beri bu yöntem basit ve kolay trombosit reaktivitesini prosedürü boyunca kan homeostazı etkilemeden izlemek kullanılabilir. Son kan alımı da deneysel trombozu etkilemeden vasküler yaralanma önce empedans veya lumi-aggregometry kullanarak trombosit etkinliğini içine daha fazla ex vivo çalışmalar yapılabilir > yaralanma sonra ek olarak ameliyattan önce 1 hafta ve tedavi zaman kurban. Daha önce tartışılan, ek uygulamalar göbek bandı FeCl3 Cinsiyeti bağlı olarak, gerekli olabilir doğurmak % 50 ya da her köpek yaşı batırılmış. 30 dakika sonra yaralanma tıkanıklığı için izin ve başka bir 15 dakika gerekirse taze % 50 FeCl3 yeniden uygulanır. Bu işlem ile yaş ya da Cinsiyet Yetişkin beagles kullanarak trombolitik sapma önemli bir fark sonuçlanmamıştır. Bu çalışmada, kritik ve state-of--art difüzyon ağırlıklı görüntüleme (DAG), düşsel bir Bay Albert hareket (rasgele difüzyon parçacıkların) doku Voksel içinde su moleküllerinin ölçümü temel aydınlatılmamıştır. Bu teknik akut iskemik inme tümör tarafından gösterilen difüzyon hiper-hücresel dokularda gibi diğer patolojiler arasında bulunması veya bu hücresel şişme ile olan yüksek difüzyon katsayısı17,18 ile düşük ,19. Su molekülleri beyin doku17,18,19difüzyon ile difüzyon haritalar değişir. B-değer H2O moleküllerin difüzyon için degrade ölçer. İskemik yaralanma sitedeki ücretsiz su daha yüksek B-değerlerini19en güçlü sinyal zayıflama deneyimleri.
Bu köpek iletişim kuralı ek olarak dozaj, toksisite ve profilaktik ve trombolitik ajanların etkinliği araştırmaları, bir köpek boyutunu deneyler mekanik thrombectomy klinik ve kolayca ulaşılabilir kullanır. Şahdamarı kolayca, lekeli ve biçilen bağışıklık hücre infiltrasyonu pıhtı alma sonra incelenmesi için insan Histoloji için protokolleri kullanılarak işlenebilir. Bu çalışmalar sonraki detaylı Protokolümüze olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri
Acknowledgments
Merkezi bilişsel ve davranışsal beyin görüntüleme Ohio Eyalet Üniversitesi'nde geliştirmek ve köpek manyetik rezonans görüntüleme gerçekleştirmek finansal ve bilimsel destek için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
