Summary
Aquí, presentamos las modificaciones necesarias a un bien caracterizado y utilizado animal inducida por el cloruro férrico (FECLAS3) arteria carótida lesiones modelo pequeño para uso en un modelo de lesión vascular animales grandes. El modelo resultante puede ser utilizado para la evaluación de ensayo preclínico de las intervenciones farmacológicas y mecánicas profilácticas y trombolíticos.
Abstract
La trombosis arterial oclusiva a ictus isquémico cerebral e infarto de miocardio contribuye a 13 millones de muertes cada año a nivel mundial. Aquí, hemos traducido un modelo de lesión vascular de un animal pequeño en un gran animal (canino), con ligeras modificaciones que pueden utilizarse para la detección preclínica de agentes profilácticos y trombolíticos. Además de los métodos quirúrgicos, el protocolo modificado describe los métodos paso a paso para determinar la canalización de la arteria carótida por angiografía, instrucciones detalladas para procesar el cerebro y para el análisis histológico verificar la carótida de la arteria carótida canalización y hemorragia cerebral y parámetros específicos para completar una evaluación de los eventos tromboembólicos posteriores mediante la utilización de resonancia magnética (MRI). Además, se discuten cambios procesales específicos desde el modelo animal pequeño previamente establecido que se traducen en una lesión vascular de grandes animales (caninos).
Introduction
Terapia de movimiento es modelada en gran parte después del tratamiento de la enfermedad de arteria coronaria, principalmente debido a las intervenciones en las enfermedades cardiovasculares han respondido bien a la fármaco terapia y endovascular intervenciones1. Estos tratamientos, sin embargo, no han correctamente traducidas al infarto cerebral. Las dificultades con el tratamiento actual de la carrera son que el activador de plasminógeno de tejido recombinante (rTPA) no se puede revertir, y que la administración lleva un riesgo significativo de 6.4% de conversión hemorrágica2,3, 4. la morbimortalidad consiguiente limita su uso a una ventana pequeña, a menudo inalcanzable5. También, restenosis y la obstrucción ocurren a menudo después de la trombólisis inicial, inversión inicial mejoría neurológica. En Resumen, existe una estrecha ventana temporal para administrar rTPA que excluye a la gran mayoría (~ 90%) de los pacientes que sufren insultos cerebrovasculares isquémicos.
El papel de la terapia antiplaquetaria intravenosa ha demostrado promesa en el tratamiento de ictus isquémico con recanalización de buque mayor, la supervivencia y el resultado2. Desafortunadamente, estas drogas tienen un efecto secundario previsible de hemorragia craneal intra y extra craneal, en gran parte porque no hay ninguna manera de adecuadamente revertir o controlar su actividad2. Al mismo tiempo eficaz en la prevención de la agregación plaquetaria, el riesgo de hemorragia y la incapacidad para revertir su actividad han impedido su uso en la rutina de cuidado de pacientes con accidente cerebrovascular. Una necesidad, por lo tanto, existe para medicamentos antitrombóticos potentes que actúan solos o en combinaciones para prevenir y lisar coágulos pero tienen un perfil de seguridad que permite el uso en un espacio cerrado, bajo volumen como el cerebro, donde la hemorragia es mal tolerada.
Comprender el mecanismo de la trombosis arterial y estenosis de la re y evaluación de trombolíticos y fármacos que impiden re-estenosis, requieren modelos de animales grandes y pequeños como parte del desarrollo preclínico de fármacos. Lesión vascular inducida por el cloruro férrico es una técnica ampliamente utilizada para inducir a la formación de trombos en los vasos de sanguíneos expuestos de ratones, ratas, conejillos de Indias, rápidamente y con precisión y conejos6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. estas especies ofrecen varias ventajas, incluyendo facilidad de manipulación genética, compra animal barata y baja los costos de viáticos de la vivienda. Desafortunadamente, los experimentos con animales pequeños negar varios sorteos de sangre durante la cirugía de acceso la reactividad plaquetaria, gasometría arterial y respuesta inflamatoria. Lo más importante, grandes animales mucho más de cerca imitan plaqueta humana fisiología6,13. El modelo FECLAS3 carótida lesiones ha jugado un papel predominante en el estudio de la fisiopatología de la trombosis, en la validación de nuevos fármacos antiplaquetarios y anticoagulantes y en el descubrimiento del potencial de los fármacos trombolíticos6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. anterior modelos en ratones, ratas, conejillos de Indias y conejos han brindado facilidad y flexibilidad para la manipulación genética, pero traducibles modelos preclínicos son críticos a la paciente estudios de dosificación y toxicidad de la terapéutica potencial6 ,13. Aunque se han desarrollado varios modelos de trastornos trombóticos en ratones, grandes modelos animales de trombosis que son aplicables a la enfermedad vascular periférica, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio son pocos y lejos. Los primeros modelos de trombosis en monos, perros y cerdos se centró en la estenosis, de la aplicación de pinzas hemostáticas y cilindros más tardíos a los buques, comúnmente dando por resultado flujo cíclico reducciones14,15,16. En lugar de un trombo oclusivo en el sitio del daño endotelial como en el modelo de cloruro férrico, el trombo en estos modelos dio lugar a la cíclica trombosis, embolización distal y volver al flujo de sangre normal. En comparación, el modelo de cloruro férrico modificado aquí en un animal grande, resultados de un trombo oclusivo en el sitio de lesión y es estabilizado y verificado por angiografía antes del tratamiento trombolítico. Siempre que el investigador tiene fondos suficientes para por diem y adquisición de experiencia quirúrgica adecuada y caninos, aquí detallamos un modelo canino grande de lesión vascular para permitir que los laboratorios para el estudio de trombosis utilizando quirúrgica, imagenológicos e histológicos técnicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Las investigaciones descritas se ajustan a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y fueron aprobadas por el Ohio estado Universidad institucional Animal cuidado y uso (#2015A00000029). Todas las manipulaciones quirúrgicas fueron realizadas bajo anestesia profunda y los animales no experimentan dolor en cualquier etapa durante el procedimiento. Todos los experimentos descritos fueron no recuperación.
1. preparación
- Recién preparar 50 mL de cloruro férrico (FECLAS3) al 50% (w/v) diluido en agua desionizada.
- Cortada la cinta umbilical 5,5 cm y sumerja en la solución de3 FECLAS recién preparada de 50% 1 semana antes del procedimiento.
Nota: La cinta umbilical utilizada es espesa y toma algún tiempo para absorber la FECLAS3 solución al 50%. - Rápida cada canino durante la noche antes de la cirugía.
- Etiqueta de crioviales para colección de plasma y orina, tubos de centrífuga estériles de 50 mL para todo almacenamiento de órganos y contenedores de formalina al 10% para fijación cerebral y carotídea para la tinción de H & E con la identificación de los animales, fecha de nacimiento, fecha de cirugía y el tratamiento.
- Preparar 100 mL de cada solución para cada procedimiento canino: paraformaldehído al 4% en tampón fosfato salino (pH 7.4), 10% neutro tamponado con formalina y 2% de cloruro de 2,3,5-Trifeniltetrazolio [TTC en PBS (pH 7.4), almacenar en la oscuridad].
- Adquirir suficiente nitrógeno líquido para los crioviales y tubos de tejido de 50 mL para el flash de congelación para el día del procedimiento.
- Adquirir dos cartuchos de colágeno/ADP para la reactividad plaquetaria PFA-100 (analizador de función plaquetaria) para cada canino para cada momento de interés.
- Adquirir un 4,5 mL citrato de sodio sangre tubo de la colección, para cada sorteo de sangre antes de sacrificio, para el almacenamiento y separación de plasma. En el sacrificio, dibujar 16 tubos de sangre para el almacenaje del plasma. Después de cada tubo de recogida de sangre completo, vuelta a 4.000 x g por 30 s para aislar el plasma rico en plaquetas y transferencia borrar capa en crioviales. Flash congelar en nitrógeno líquido antes de su almacenamiento a-80 ° C.
- Adquirir un 4,5 mL litio heparina sangre tubo de la colección, para cada punto de PFA-100 tiempo de interés para la reactividad plaquetaria récord. En cada sorteo de sangre, introducir 800 μl de sangre entera de un tubos de colección de sangre de heparina de litio cada cartucho colágeno ADP sin burbujas de aire para seguir la reactividad plaquetaria.
- Adquirir dos tubos sangre EDTA K3 (1,8 mg de EDTA anhidro por 1 mL de sangre), para conteo sanguíneo completo (CSC) al inicio y en el momento del sacrificio.
Nota: Este volumen es adecuado para la mayoría de los centros base ejecutar cada uno dos veces en caso de error mecánico. Aunque un CBC se ejecuta en la línea base antes de la lesión y en el momento del sacrificio, los investigadores pueden añadir que más sangre dibuja como aprobado en sus protocolos animales para análisis adicionales. Consulte con el centro en cuanto a volúmenes y requisitos de entrega para sus equipos. - Preparar una jeringa de 2 mL heparinizada llenando y la jeringa la capa el día del procedimiento para análisis de gases sanguíneos en el momento del sacrificio.
Nota: Consulte con el centro en cuanto a volúmenes y requisitos de entrega para sus equipos.
2. Oclusión carotídea canina
- Peso adulto (> 18 meses) canino beagle y pre medicar con acepromacina intramuscular (0.025-.2 mg/kg) seguido de una inyección intraperitoneal inicial de ketamina (5-20 mg/kg) y midazolam (0.01-.25 mg/kg). Inducir la anestesia más profunda con 1-5% isoflurano basado en la frecuencia cardíaca, respiraciones y tono de la mandíbula.
Nota: Anestesia exacta se basa en el peso y el protocolo aprobado del animal. Aunque las inyecciones pueden resultar en dolor de los animales, la duración de este malestar son mínima (menos de 3 s). - Antes de tomar el animal a la mesa de cirugía, eliminar el vello por recorte. Aplicar lubricante ungüento oftálmico para ojos del animal anestesiado para evitar la sequedad.
- Coloque el animal en posición supina utilizando un sistema de posicionamiento y conectar cables de electrocardiografía (ECG) al pie almohadillas. Intubación a través de la tráquea con un tubo endotraqueal 6.5 mm manguito mecánicamente ventilar a 14 respiraciones por minuto y mantener cada perro con una inhalación continua de 1-5% isoflurano (depende el protocolo aprobado del animal).
- Para determinar el grado de canalización de la carótida y la longitud del trombo oclusivo, realizar angiografía antes de la lesión, antes de MRI y en el momento del sacrificio (véase abajo para las instrucciones adicionales).
- Inserte una vaina arterial femoral y un catéter de plástico y fijar con una sutura de seda 0 suelta. Cerrar temporalmente la vaina y el catéter durante el transporte y los estudios por imágenes. Ver angiografía canina a continuación para obtener instrucciones).
- De sangre dibuja, insertar un catéter intravenoso de 16 x 45 mm a través de la piel intacta distal a la vaina femoral arterial reducir sitio. Avanzar el catéter hacia la exposición quirúrgica y visualizar como entra en la vena femoral expuesta inmediatamente adyacente a la vaina arterial. Una vez totalmente insertado en la vena, retire la aguja, la tapa el catéter con una llave de 3 vías y lavar con 2 mL de solución salina estéril 0,9%. Asegure el catéter a la piel con una sutura de seda 0.
- Hacer una incisión de 8 a 10 cm de la piel directamente en la parte superior de la región de la arteria carótida común derecha y disecar la fascia para aislar los vasos del tejido circundante.
- Cuidadosamente Introduzca pinzas entre la arteria carótida y el nervio vago para separar. Evite tocar el más de lo necesaria ya que puede causar constricción de los vasos de la arteria carótida.
- Seque el área expuesta de la arteria con una gasa estéril para evitar la dilución de solución FECLAS3 .
- Lugar el Doppler flujo sonda alrededor de la carótida amble espacio envolver la cinta umbilical alrededor de la carótida sin tocar la punta de prueba de flujo y empezar a grabar a la velocidad de la sangre y continuar durante todo el procedimiento (figura 1 arriba). Registrar el flujo basal de ~ 5 min antes de aplicar la cinta umbilical.
Nota: Flujo basal antes de la colocación de cinta umbilical FECLAS3 promedio es usualmente alrededor 250 mL/min. - Envolver el preparado FECLAS3 cinta umbilical alrededor de la carótida mediante una pinza hemostática inmediatamente debajo de la sonda de flujo sin tocar para 15 minutos, retire y descarte.
Nota: La obstrucción se señala como cero flujo mL/min. - Estabilizar el trombo oclusivo para 45 min Agregar solución salina adicional a la punta de prueba según sea necesario para mantener una señal.
Nota: Dependiendo de la edad, género y el tipo de colocaciones caninas, adicionales de la preparados cinta umbilical FECLAS3 pueden ser necesarios para permitir que 30 min para la obstrucción que se produzca antes de volver a solicitar. No se observaron diferencias en la trombosis por el uso del cloruro férrico con perspectiva de género en beagles. No se encontró necesario con este modelo para volver a aplicar una nueva cinta umbilical de3 FECLAS más de una vez y nunca ha desviado del Protocolo de preparación de FECLAS3 cinta umbilical. Si el laboratorio utiliza una diferente raza o la edad del canino, las FECLAS cinta umbilical3 debe aplicarse a los temas iniciales para asegurarse que el protocolo de trombosis no se desvía, o un grupo de caninos puede ser necesario establecer FECLAS3 tiempo de aplicación para esa raza o edad en su estudio específico. Los tiempos de la oclusión, en este experimento, el rango de 8-30 min después de la aplicación de cinta umbilical FECLAS3 . - Para determinar el volumen de accidente cerebrovascular o hemorragia además de los eventos tromboembólicos posteriores que pueden resultar de las intervenciones farmacológicas, transporte de caninos con inyección de ketamina adicional a una máquina de resonancia magnética (ver más abajo procesamiento adicional).
- Mientras que aún bajo un plano quirúrgico profundo de la anestesia de un final angiografía/MRI (véase abajo para la proyección de imagen de protocolo), indicado por la falta de respuesta a los estímulos nocivos, recoger sangre deseado para su posterior análisis y, a continuación, abre el cofre al cortar a través de las costillas empezando por el esternón e impuestos especiales el corazón mediante la reducción de los vasos sanguíneos (exsanguination).
Nota: En este experimento, sangre entera (< 10 mL) fue dibujado al inicio, 5 min después de la administración del agente y 60 min después de la infusión de la vaina femoral y no vio ningún efecto en el proceso de la trombólisis. En sacrificio, puede establecerse un volumen ilimitado para el almacenamiento de plasma adicional si es aprobado en el protocolo de animales. Analizar, procesar y almacenar sangre todos a 30 min de sacrificio. Asegúrese de que la sangre se extrae no más el porcentaje aprobado de peso del animal como se detalla en el protocolo aprobado del animal. Todos los experimentos descritos fueron no recuperación. - Enjuague el corazón con solución salina al 0.9% y flash congelar las muestras en nitrógeno líquido si se desea.
- Antes de retirar los carotids, mida la longitud del coágulo colocando una regla al lado de él y registro. Coloque el marcador de tejido en la mitad del clot y en el mismo lugar en la carótida contralateral para facilitar el ajuste de la histología. Marque la carótida contralateral en la misma longitud.
Nota: La longitud promedio del coágulo con este modelo es de 1,75 cm. - Quitar toda la extensión del coágulo en ambos vasos y se fijan en formalina al 10%. Retire la arteria carótida contralateral dentro de la longitud marcada por el marcador de tejido. Cortar la arteria carótida contralateral por la mitad en el centro del coágulo. Flash freeze medio la arteria carótida contralateral en nitrógeno líquido para su posterior análisis y fijar la otra mitad en formalina al 10% para incrustar al lado de la carótida lesionada para análisis histológico más abajo.
- Quitar los órganos para cualquier análisis deseado, enjuagar con solución salina al 0.9% y flash congelación en nitrógeno líquido.
- Quitar el cráneo con una sierra circular del hueso. Extraiga lentamente el cráneo sin dañar el cerebro debajo.
- Luego el cerebro del cráneo, enjuáguelo con solución salina 0,9% frío y cortar dos secciones de 4 mm desde el centro del cerebro, corte lateralmente con un bisturí afilado. Coloque una de las secciones de 4 mm en 2% TTC para demarcación isquémica (consulte adicional de procesamiento para cerebro TTC), mientras que la otra rebanada colocada en formol al 10% durante 7 días para la tinción de H & E (véase procesamiento adicional para cerebro H & E).
3. canina angiografía
Nota: Esto se muestra en la figura 2 y se realiza durante la cirugía en momentos de interés.
- Siente un impulso en la región inguinal derecha y haga una incisión sagital ventral 3-5 cm.
- Exponga la arteria femoral y separarlo de los tejidos circundantes mediante disección Roma.
- Utilice una pinza de ángulo recto para colocar una sutura de seda 0 alrededor del extremo distal de la arteria expuesta.
- Atar la sutura de seda 0 distal y aplique una tensión ligera a la arteria por la sujeción de los extremos de la sutura de seda 0 suelto a la piel con pinzas hemostáticas.
- Coloque una segunda sutura de seda 0 alrededor del extremo proximal del segmento expuesto.
- Punción en la mitad del camino centraa de la arteria entre los lazos de la sutura de seda 0 proximal y distal mediante una aguja introductora de 18G para pasar un alambre de guía en la arteria.
- Carga un ensamblado 6Fr vaina y dilatador sobre el alambre guía, sujetando el cable cuando sale de la Asamblea.
- Avance el dilatador y vaina sobre el alambre guía. Asegúrese de mantener un firme agarre del alambre que sobresale desde el dilatador mientras avanza el dilatador de la vaina.
- Después de la inserción plena, atar la sutura de seda 0 proximal alrededor de la vaina para mantener la hemostasia en el sitio de punción arterial.
- Al mismo tiempo Retire el dilatador y la guía.
- Abra la válvula unidireccional para verificar la presencia de flujo pulsátil de la sangre y al ras con 3-5 mL de solución salina normal.
- Conecte la válvula unidireccional de la vaina de acceso a un fluido lleno de la extensión de la línea conectada a un transductor de presión a las mediciones de presión sanguínea invasiva monitor y registro.
- Precarga una 0,35" guía un catéter angiográfico 4Fr. y conectar al colector de la inyección de contraste con un adaptador Tuohy y.
- Tire de la punta del alambre guía dentro de la punta distal del catéter y lave todo el conjunto con una solución salina.
- Inserte el catéter angiográfico en la válvula hemostática de la vaina y entonces avanzar la guía unos 5 cm más allá de la punta del catéter distal.
- Bajo guía fluoroscópica y con un enfoque trans-aórtica retrógrado, avance lentamente el catéter en el arco aórtico.
- Inyectar 2-3 mL de contraste agente diluido 1:1 con solución salina normal para identificar el despegue del tronco braquiocefálico.
- Utilice la guía para dirigir el catéter en el tronco braquiocefálico y luego selectivamente en la arteria carótida común derecha.
- Retire el alambre guía e inyectar 2-3 mL de contraste diluido para verificar que el catéter se coloca en la carótida.
- Inyectan 3-4 mL de contraste sin diluir durante la grabación de carreras angiográficos con sustracción digital y técnicas angiográficas habituales.
- Repita los pasos 3.18 3.21 para la angiografía repetida en puntos del tiempo adicional.
4. resonancia magnética - difusión ponderada la proyección de imagen (DWI) y T2 weighted (T2WI) la proyección de imagen del cerebro canino
Nota: Esto se muestra en la Figura 3A-3B.
- Asegurarse de que el perro está bajo anestesia profunda.
- Asegurar que los parámetros fisiológicos del perro son monitoreados a través de la proyección de imagen incluyendo ECG y frecuencia cardíaca.
- Asegúrese de que el perro yace en la posición supina con la cabeza en las aberturas bilaterales de la bobina de cerebro.
- Permitir que el imán de 3 Tesla (3T).
- Realizar imágenes cargadas T2 (T2WI) una secuencias de pulso básico en la RM.
Nota: La secuencia utiliza las diferencias en el tiempo de relajación T2 de los tejidos en diferentes condiciones patológicas. - Localizador de imágenes para adquirir imágenes piloto de un cerebro de perro antes de la proyección de imagen anatómica con eco de gradiente T2-weighted imaging secuencia de realizar y determinar el campo de visión (FOV), número de rebanadas y grosor de corte para cubrir completamente el cerebro.
- Utilice los siguientes parámetros T2: rebanada de espesor = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, matriz de adquisición = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixeles, resolución de la imagen = 2,4615 píxeles por milímetro.
- Realizar difusión ponderada la proyección de imagen (DWI) utilizando Eco cepillo DTI secuencia 4 h después de la oclusión de la MCA e inmediatamente antes del sacrificio.
- Utilice los siguientes parámetros de DWI: b = 1.500 m s/m2, grosor de corte = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, matriz de adquisición = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, resolución de la imagen = 0.9333 píxeles/mm (tabla 1).
5. hematoxilina y eosina (H & E) tinción del cerebro canino
Nota: Esto se muestra en la figura 3D.
- Después de 7 días en formol al 10%, incrustar las secciones de la cerebral de 4 mm en parafina.
- Corte los bloques de parafina hasta que se nivel con un micrótomo, quitando cualquier parafina adicional desde la parte superior del tejido cerebral, a continuación, cortan el tejido de cerebro en 4 μm y coloque una sección del cerebro en cada diapositiva 2 "x 3" pulgadas.
Nota: Antes de la tinción, coloque todas las soluciones en envases separados para que las diapositivas se pueden mover de una solución a otra sin secar. - -Paraffinize cada diapositiva cerebro e hidratar con agua del grifo.
- Coloque cada portaobjetos de cerebro en 560 hematoxilina durante 8 min.
- Enjuague cada diapositiva cerebro en agua del grifo.
- Diferenciar cada diapositiva cerebro con 1% ácido Alcohol para 1 s tres veces.
- Enjuague cada diapositiva cerebro en agua del grifo.
- Azul cada diapositivas de cerebro con hidróxido de amonio 1% para 1 s.
- Enjuague cada diapositiva cerebro en agua corriente durante 2 minutos.
- Deshidratar cada diapositiva cerebro en 70% etanol (EtOH) durante 1 s doce veces.
- Contratinción cada diapositiva cerebro en eosina durante 1 minuto.
- Deshidratar a cada diapositiva de cerebro en el 95% EtOH 1 s doce veces.
- Deshidratar cada diapositiva cerebro 100% EtOH.
- Claro cada diapositiva cerebro en xileno y luego un cubreobjetos 2 "x 3" pulgadas encima de la diapositiva del cerebro, quitando las burbujas de aire con medios de montaje resinosas.
Nota: Todas las soluciones se reutilizan excepto agua y etanol durante varios días de tinción y varias diapositivas. Todos de procesamiento después de secciones del cerebro se colocan en portaobjetos se hacen en tinción de frascos de vidrio, pero plástico tinción están comercialmente disponibles también. Reemplace cualquier solución cuando se descolore y mantenerlos bien cubierto.
6. hematoxilina y eosina (H & E) tinción de carótidas caninas
Nota: Esto se muestra en la figura 1 (izquierda).
- Después de 24-72 h en formalina al 10%, cortar la carótida dañada por la mitad en el centro del coágulo y embed ~ 1 cm de carótida lesionado y ~ 1 cm el control contralateral en el mismo cartucho de parafina.
Nota: El coágulo de sangre dentro de la carótida es frágil. Espere hasta que el recipiente se ha fijado en formalina al 10% antes de cortar para que el coágulo no se disturba. Incrustar los heridos y controlar las arterias carótidas en la misma parafina bloque permitirá cortar al mismo tiempo en el mismo lugar en el vaso sanguíneo. - Cortar bloques de parafina hasta el nivel con un micrótomo, quitando cualquier parafina adicional. Luego corte las secciones de 4 μm a 25 x 75 mm x 1 diapositivas mm sin girar el bloque de parafina para que las secciones de carótida contralaterales se colocan en la parte superior de la diapositiva.
Nota: Tres secciones carótidas se colocaron en cada diapositiva, pero se puede añadir dependiendo de las manchas de interés. - -Paraffinize cada diapositiva carótida e hidratar en agua del grifo.
Nota: A diferencia de la diapositiva del cerebro que debe ser procesada individualmente, diapositivas de carótida pueden procesarse a granel colocando en frascos que caben varias diapositivas a la vez sin tocar unos a otros. - La mancha cada diapositiva carótida en hematoxilina durante 8 min.
- Enjuagar cada carótida portaobjetos en agua del grifo.
- Diferenciar cada carótida diapositiva 1% ácido Alcohol para 1 s tres veces.
- Enjuagar cada carótida portaobjetos en agua del grifo.
- Azul cada carótida portaobjetos con hidróxido de amonio 1% para 1 s.
- Enjuagar cada carótida portaobjetos en agua corriente durante 2 minutos.
- Deshidratar cada carótida portaobjetos en el 70% EtOH 1 s doce veces.
- Contratinción cada diapositiva carótida en eosina o 1 minuto.
- Deshidratar cada carótida portaobjetos en 95% EtOH 1 s x 12.
- Deshidratar cada carótida portaobjetos en 100% EtOH.
- Claro cada carótida portaobjetos en xileno y añadir un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm con medios de montaje resinosas para eliminar las burbujas de aire.
7. 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio cloruro (TTC) tinción del cerebro canino
Nota: Esto se muestra en la figura 3.
- Lugar la otra sección de 4 mm sacada de la mitad del cerebro inmediatamente proximal a la sección de H & E en previamente preparado 2% TTC (obstrucción de la arteria carótida). Incubar en la oscuridad a 37 º C durante al menos 20 minutos, girando sobre la sección del cerebro para la tinción incluso cada 5 minutos.
Nota: Después de 20 minutos, la sección debe ser cereza roja en ambos lados. Se puede necesitar tiempo adicional basado en frescura TTC y el espesor de la sección de tejido. - Retirar la solución TTC y reemplazarlo con paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,4 para optimizar el contraste de colores.
- Cuando el contraste entre blanco y rojo la coloración es óptimo, colocar rodajas de cerebro TTC entre hojas de plástico transparente, secas de exceso de líquido y la exploración en alta resolución para el seguimiento de las regiones isquémicas.
Nota: Las secciones se pueden almacenar indefinidamente en solución de paraformaldehído, pero la coloración desaparecerá.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siguiendo los procedimientos detallados en este documento se traducirá en el desarrollo de un modelo que puede ser utilizado para la profiláctica o trombolítica evaluación de intervenciones arteriales oclusivas. Figura 1A muestra la velocidad de flujo de línea de base y la velocidad resultante del flujo de sangre antes, durante y después del tratamiento por un software comercial. Datos de este registro se pueden utilizar para determinar el porcentaje de la perfusión con lesiones de la arteria carótida y el tratamiento en este modelo canino. Figura 1B es un ejemplo de la contralateral (arriba) y heridos (parte inferior) canina carótida las secciones teñidas con H & E que comprueba el estado de la canalización en el momento del sacrificio. Una multitud de programas de software están disponibles para analizar el área inundada del buque trazando el vaso sanguíneo (sin trombo) que puede ser dividido por el área total de la embarcación para llegar a un porcentaje de canalización con cada tratamiento. La figura 2 muestra varios ejemplos de la angiografía de la arteria carótida en este canino de protocolo que puede utilizarse para determinar si el trombo es oclusivo. Además, utilizando la sonda de flujo cuadrado como un marcador, los investigadores pueden determinar la longitud del trombo en cada momento que el angiograma es tomado. Aunque aquí hemos presentado imágenes antes de lesión, 60 min después del tratamiento del vehículo y en el momento del sacrificio, el investigador puede adaptar la proyección de imagen a sus necesidades. Figura 3 es el resultado de los parámetros de proyección de imagen magnéticos aplicada al cerebro canino ~ 4 h después de la obstrucción de la arteria carótida inmediatamente antes del sacrificio, con difusión ponderada (Figura 3A) y T2 weighted imaging (figura 3B) detallada en la sección 4 del presente Protocolo. Aunque sólo nos muestran una foto de la matriz entera tomada en diferentes niveles en el cerebro, el tamaño del volumen de la hemorragia y de accidente cerebrovascular se puede identificar en diferentes niveles y áreas del cerebro y cuantificado en cada punto del tiempo deseado por el investigador. Cuantificación se completa utilizando el software de la máquina MRI específico específico de imager del investigador. El TTC resultados de tinción como se muestra en la figura 3 se puede utilizar para delinear el tejido fino del cerebro en el cual las células son todavía metabólicamente activas además de los que no son. TTC se reduce enzimáticamente para dar lugar a células rojo vivo mientras que las células muertas no conservará el TTC y así no será rojo. Por último, la hematoxilina y eosina tinción técnica demostrada en el cerebro canino en figura 3D dará lugar a glóbulos rojos de la coloración rojo brillante que se puede utilizar para verificar las zonas donde se ha producido la hemorragia.
Figura 1: control del flujo de sangre carótida. (A) velocidad de la sangre del representante de la arteria carótida (mL/min) grabado desde el Doppler sonda de línea de base antes de la lesión mediante el sacrificio. (B) representante de H & E tinción de ocluida la arteria carótida (parte inferior) y control contralateral (arriba). Aumento es 20 X. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: monitoreo del flujo sanguíneo carotídeo por angiografía. Vista representativa de la angiografía de la arteria carótida derecha canina. Imágenes fueron tomadas en condiciones basales antes de la infusión del vehículo (A), 60 min después de la infusión del vehículo (B)y al tiempo del sacrificio, 4.5 h después de la obstrucción (C). Flechas rojas indican la ubicación de la nave de las FECLAS3-indujo lesiones donde se colocó la cinta umbilical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imágenes representativas del cerebro canino después de tratamiento de vehículos. La proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) realiza ~ 4 h después de la obstrucción, inmediatamente antes del sacrificio, utilizando imágenes de difusión ponderada (DWI, (A) y T2 weighted imaging (B). TTC la coloración de la sección medial en el momento del sacrificio para delinear en vivo desde el tejido muerto (C). H & E tinción de intermedio de la sección, inmediatamente proximal a la sección TTC, en sacrificio para delimitar el tejido que son metabólicamente activo (rojo) de los que no son TTC se reduce a un producto rojo cuando tomado por células vivas y por lo tanto, resultará en secciones que pueden cuantificarse con multitud de software para rastreo viven regiones muertos vs. (D). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros experimentales | T2-weighted | Difusión ponderada |
| Ms de tiempo (TR) de repetición | 4000 | 4600 |
| Eco de tiempo (TS) ms | 75 | 86 |
| Tapa ángulo, grados | 180 | 90 |
| Matriz de adquisición | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Número promedio de | 2 | 4 |
| En el plano de imagen de resolución (píxeles/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tabla 1: parámetros de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). Parámetros de MRI que se desarrollaron para canino T2 y difusión-cargada imágenes para maximizar para la evaluación de ictus y hemorragia volumétrica en modelo de trombosis de la arteria carótida canina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El modelo de lesión vascular inducida por FECLAS3 es ampliamente utilizado para el estudio de trombosis en animales pequeños y es fácil de traducir en un modelo animal, los grandes con multitud de ventajas. Ligeras modificaciones para adaptar el protocolo en un canino permiten la utilización de dos imágenes de resonancia magnética para evaluar volúmenes de derrame cerebral y la hemorragia después de una intervención farmacológica y la angiografía para evaluar canalización del recipiente antes, durante, y después del tratamiento. Otros modelos animales grandes trombótica no han estudiado los trombos oclusivos estabilizados en el sitio de la lesión y por lo tanto no pueden utilizar la angiografía y la histología de la arteria carótida para determinar el grado de nueva canalización para cada profiláctico o trombolíticos tratamiento. Además de las ventajas de un animal de gran tamaño que incluyen un amplio tejido para análisis (plasma, orina, órganos para estudios de toxicidad, etcetera), el modelo animal grande mucho más estrechamente imita la frecuencia cardíaca, presión arterial y la cascada de la coagulación en humanos que modelos de roedores. Tamaño adecuado de las arterias del cerebro y la carótida, resultado en el material histológico y biológico que puede ser utilizado para una gran cantidad de investigaciones inflamatorias y bioquímicas en cada animal experimental. Otra de las ventajas de modificar las FECLAS3-modelo vascular inducida en un canino es que un mayor volumen de sangre se puede extraer durante el experimento sin modificar plaqueta reactividad o trombo formación tal que la sangre gas y sangre completa cuentas pueden ser monitoreadas durante la infusión de lesión y de la droga. Además, la lesión de cloruro férrico se ha atribuido al daño oxidante; por lo tanto, imitará el daño aterosclerótico que precede mucho más de cerca que los otros tipos de publicaron los modelos de lesión arterial7clínica ictus e infarto de miocardio. Por último, intervenciones mecánicas como la trombectomía, que habitualmente son utilizadas clínicamente, pueden seguir tratamiento farmacológico para que re-estenosis y el estado de la salud de la pared endotelial pueden abordarse con un amplio tejido histológico para múltiples investigaciones sobre el mismo canino.
Limitaciones de este modelo son pocos pero hay que considerar. Primero, aunque el punto del tiempo y tratamiento elegido en esta publicación (sacrificio h 4,5 después de lesión de la arteria carótida, vehículo) no dio lugar a un movimiento mensurable o hemorragia, este método es clínicamente relevante para la investigación de la novela anti-trombótica y agentes trombolíticos para determinar eficacia y dosificación. De hecho, accidente cerebrovascular o hemorragia con la inicial trombótica insulta o con tratamiento farmacológico (es decir, rTPA) ocurren con este modelo. En segundo lugar, caninos gastos de compra, envío, manipulación genética y las dietas son bastante altos y costo prohibitivos hasta una droga está bien caracterizada en modelos de roedores.
Pasos críticos en el centro de protocolo en la activación plaquetaria, agregación y adherencia, el quid de la trombosis. Puesto que el analizador de función plaquetaria (PFA-100) se puede realizar con 1600 μl de sangre entera por duplicado, este método es simple y fácil de seguir la reactividad plaquetaria durante todo el procedimiento sin afectar la homeostasis de la sangre. Estudios ex vivo adicionales en la actividad de la plaqueta usando impedancia o lumi-aggregometry pueden realizarse antes de la lesión vascular sin afectar de trombosis experimental como el último sorteo de sangre es > 1 semana antes de la cirugía además después de la lesión y tratamiento en el momento del sacrificio. Como se ha discutido, aplicaciones adicionales de la cinta umbilical empapado en 50% FECLAS3 puede ser necesario dependiendo de sexo, raza, o edad de cada canino. Permite 30 minutos después de la lesión para oclusión y fresco 50% FECLAS3 para otro 15 min si es necesario se vuelve a aplicar. Este proceso no produjo una diferencia significativa en desviación trombolítica con la edad o género con beagles adultos. En este estudio, hemos aclarado la difusión crítica y estado de la técnica ponderada la proyección de imagen (DWI), a Sr. proyección de imagen basada en medición de movimiento browniano (difusión al azar de las partículas) de moléculas de agua dentro del voxel de tejido. Esta técnica es útil en la detección de movimiento isquémico agudo entre otras patologías como tumores por difusión mostrando en hiper celular tejidos o con hinchazón celular es baja con mayor difusión coeficiente de17,18 ,19. Mapas de difusión varían con la difusión de las moléculas de agua en el tejido cerebral17,18,19. El valor de B mide el gradiente de difusión de moléculas de H2O. En el sitio de la lesión isquémica el agua libre experimenta más fuerte atenuación de la señal a los mayores valores de B19.
Además del uso de este protocolo canino estudios de dosificación, toxicidad y eficacia de los agentes profilácticos y trombolíticos, el tamaño de un colmillo hace experimentos en trombectomía mecánica clínicamente relevantes y fácilmente alcanzable. Carótidas pueden ser procesados fácilmente, manchados y evaluados utilizando protocolos para histología humana para el estudio de la infiltración de células inmunes después de la recuperación del coágulo. Estos estudios serán nuestros próximos protocolos detallados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer el centro cognitivo y conductual cerebro la proyección de imagen de la Universidad de estado de Ohio por su apoyo financiero y científico desarrollar y realizar la proyección de imagen de resonancia magnética canina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
