Summary
Här presenterar vi ändringarna som är nödvändiga till en väl karakteriserad och vanliga små djur järnklorid-inducerad (FeCl3) halspulsådern skada modell för användning i en stor djur vaskulära skador modell. Den resulterande modellen kan utnyttjas för prekliniska rättegång bedömning av både profylaktisk och trombolytiska farmakologisk och mekanisk insatser.
Abstract
Ocklusiv arteriell trombos leder till cerebral ischemisk stroke och myokardinfarkt bidrar till ~ 13 miljoner dödsfall varje år globalt. Här har vi översatt en vaskulär skada modell från ett litet djur till ett stort djur (hund), med smärre ändringar som kan användas för pre-klinisk screening av profylaktisk och trombolytiska medel. Förutom de kirurgiska metoderna beskriver det ändrade protokollet steg för steg metoder för att bedöma halspulsådern canalizationen av angiografi, detaljerade instruktioner att bearbeta både hjärnan och halspulsådern för histologisk analys att verifiera halspulsådern canalizationen och hjärnblödning och specifika parametrar att slutföra en bedömning av nedströms tromboemboliska händelser genom att använda magnetisk resonanstomografi (MRT). Dessutom diskuteras specifika processuella ändringar från den tidigare väletablerad liten djurmodell nödvändigt att översätta till en stor djur (hund) vaskulär skada.
Introduction
Stroke behandling är till stor del modellerad efter koronar sjukdomsbehandling, främst eftersom interventioner i hjärt-kärlsjukdom har svarat väl på drogen terapi och endovaskulära interventioner1. Dessa behandlingar, dock har inte framgångsrikt översatt till cerebral infarkt. Svårigheterna med den nuvarande stroke behandlingen är att den vävnad rekombinant plasminogenaktivator (rTPA) inte kan återföras, och att administration innebär en betydande 6,4% risk för hemorragisk omvandling2,3, 4. resulterande sjuklighet och dödlighet begränsar dess användning till en liten, ofta ouppnåelig fönster5. Dessutom uppstår restenos och ocklusion ofta efter inledande trombolys, backning initial neurologisk förbättring. Sammanfattningsvis finns det ett smalt tidsmässiga fönster att administrera rTPA som utesluter den stora majoriteten (~ 90%) av patienter som lider av ischemisk cerebrovaskulär förolämpningar.
Rollen som intravenös trombocythämmande behandling har visat lovande resultat vid behandling av ischemisk stroke med förbättrad fartyget recanalization, överlevnad och resultatet2. Tyvärr, dessa läkemedel har en förutsägbar bieffekt av intra cranial och extra kraniala blödning, till stor del eftersom det finns inget sätt att adekvat omvänd eller styra deras aktivitet2. Medan effektiva för att förebygga trombocytaggregation, risken för blödningar och oförmåga att vända deras aktivitet har förhindrat deras användning i rutin vård av strokepatienter. Det finns därför ett behov för potenta antitrombotiska läkemedel som agera ensam eller i kombinationer för att förhindra och lysera blodproppar ännu har en säkerhetsprofil som gör att användningen i en sluten, låg volymutrymme till exempel hjärnan, där blödning tolereras dåligt.
Förstå mekanismen av arteriell trombos och re-stenos, och utvärdera trombolytika och droger som hindrar re-stenos, kräver både små och stora modeller som en del av preklinisk läkemedelsutveckling. Järnklorid-inducerad vaskulär skada är en allmänt utnyttjad teknik för att snabbt och exakt inducerar bildandet av tromboser i utsatta blodkärl av möss, råttor, marsvin och kaniner6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. dessa mindre arter erbjuder flera fördelar inklusive enkel genetisk manipulation, billiga animaliska inköp och låg traktamente boendekostnader. Tyvärr förneka små djurförsök flera blod dragningar under operationen tillgång trombocytantal reaktivitet, blod gasar analys och inflammatoriskt svar. Viktigare, efterlikna stora djur mycket närmare humana trombocyter fysiologi6,13. FeCl3 halspulsådern skada modellen har spelat en dominerande roll i studiet av patofysiologin av trombos, validering av nya anti blodplättar och antikoagulantia läkemedel och i upptäckten av potentiella trombolytika6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. föregående modeller hos möss, råttor, marsvin, och kaniner har lämnat enkelheten och flexibiliteten för genmanipulation, men översättningsbara prekliniska modeller är kritiska till patientens dosering och toxicitet studier av potentiella therapeutics6 ,13. Även om flera modeller av trombotiska sjukdomar har utvecklats hos möss, stora djurmodeller för trombos som gäller för den perifer vaskulär sjukdomen, är stroke och hjärtinfarkt få och långt. De första trombos modellerna i apor, hundar och grisar fokuserade på stenos, gäller Peanger och senare cylindrar för fartyg, vilket vanligen resulterar i cykliska flöde minskningar14,15,16. I stället för en ocklusiv tromb på platsen för den endoteliala skadan som i järnklorid modellen, tromben i dessa modeller resulterade i cykliska trombos, distal embolisering och återgå till normalt blodflöde. I jämförelse, är järnklorid modellen ändras här i ett stort djur, resulterar i en ocklusiv tromb på skadan webbplats och stabiliserad och kontrolleras av angiografi före trombolytisk behandling. Förutsatt att Utredaren har gott om pengar för per diem och inköp av hörntänder och adekvat kirurgisk expertis, vi detalj här en stor hund modell av vaskulär skada att tillåta laboratorier för att studera trombos utnyttja kirurgisk, imaging och histologiska tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersökningarna beskrivs uppfyller riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health och godkändes av The Ohio State University institutionella djur vård och användning kommittén (#2015A00000029). Alla kirurgiska manipulationer utfördes under djup anestesi och djuren upplevde inte smärta när som helst under förfarandet. Alla experiment som beskrivs var icke-återvinning.
1. beredning
- Nymalen förbereda 50 mL av järnklorid (FeCl3) på 50% (w/v) späds med avjoniserat vatten.
- Klippa navelsträngen tejpen i 5.5 cm bitar och fukta med nylagade 50% FeCl3 lösningen 1 vecka innan ingreppet.
Obs: Navelsträngen tejpen används är tjock och tar lite tid att absorbera 50% FeCl3 lösningen. - Snabbt varje hund över natten före operationen.
- Etikett cryovials för insamling av plasma och urin, 50 mL sterilt centrifugrör för alla organ lagring, och 10% formalin behållare för hjärnan och halspulsådern fixering för H & E färgning med identifiering av djur, födelsedatum, datum för operation och behandling.
- Förbereda 100 mL varje lösning för varje hund procedur: 4% PARAFORMALDEHYD i fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4), 10% neutral buffrad formalin och 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium klorid [TTC i PBS (pH 7,4), förvaras mörkt].
- Förvärva gott om flytande kväve för alla cryovials och 50 mL vävnad rör för flash frysning för dagen av förfarandet.
- Förvärva två ADP/kollagen patroner för PFA-100 (trombocytantal funktion Analyzer) trombocytantal reaktivitet för varje hund för varje tidpunkt av intresse.
- Förvärva en 4,5 mL natriumcitrat bloduppsamlingsrör, för varje blodprovstagning före offer, för plasma separation och lagring. På offer, rita 16 blod insamling rör för plasma lagring. Efter varje bloduppsamlingsrör är full, spin vid 4000 x g i 30 s att isolera trombocytantal rika plasma och överföring klart lager i cryovials. Flash frysa i flytande kväve innan lagring vid-80 ° C.
- Förvärva en 4,5 mL lithium heparin bloduppsamlingsrör, för varje PFA-100 tidpunkt av intresse för rekord trombocytantal reaktivitet. På varje blodprovstagning, införa 800 µL helblod från en lithium heparin blod insamling rör i varje ADP/kollagen patron utan luftbubblor följa trombocytantal reaktivitet.
- Förvärva två EDTA K3 blod insamling rör (1,8 mg vattenfri EDTA per 1 mL blod), för fullständig blodstatus (CBC) vid studiestart och vid tidpunkten för offer.
Obs: Denna volym är tillräcklig för de flesta corefaciliteter ska varje två gånger vid mekaniska fel. Även om en CBC kördes på både baslinjen innan skadan och vid tidpunkten för offer, kan utredare lägga mer blod drar som godkänts i deras djur protokoll för ytterligare analyser. Kontrollera med anläggningen om volymer och leveranskrav för sin utrustning. - Förbereda en 2 mL hepariniserad spruta genom att fylla och beläggning sprutan dag förfarandet för blod gasar analys vid tidpunkten för offer.
Obs: Kontrollera med anläggning vad gäller volymer och leveranskrav för sin utrustning.
2. Hundarnas halspulsådern ocklusion
- Väger en vuxen (> 18 månader) beagle hund och pre medicinera med intramuskulär Acepromazin (0,025-.2 mg/kg) följt av en inledande intraperitoneal injektion av ketamin (5-20 mg/kg) och midazolam (0,01-.25 mg/kg). Inducera djupare anestesi med 1-5% isofluran baserat på puls, andning och käken tonen.
Obs: Exakta anestesi styrs av vikten och godkända djur protokollet. Även om injektioner kan resultera i smärta för djuren, varaktigheten av detta obehag kommer att vara minimal (mindre än 3 s). - Före att ta djuret till tabellen kirurgi, ta bort hår genom klippning. Tillämpa smörjning oftalmologiska salva till sövda djurets ögon att förhindra torrhet.
- Placera djuret i ryggläge med hjälp av ett positioneringssystem och koppla EKG (EKG) leder till fot kuddar. Intubation genom luftstrupen med en 6,5 mm cuffed endotrakealtub, mekaniskt ventilera på 14 andetag/min och underhålla varje hund med en kontinuerlig inandning av 1-5% isofluran (beror på det godkända djur protokollet).
- För att avgöra omfattningen av canalizationen av halspulsådern och längden på den ocklusiva tromben, utföra angiografi före skada, innan MRI, och vid tiden för offer (se nedan för ytterligare instruktioner).
- Infoga en arteriell lårbenshals och en plast kateter och säkra med en lös 0-silk sutur. Tillfälligt stänga slida och katetern under transport och studier avbildning. (Se Hundarnas angiografi nedan för ytterligare instruktioner).
- För blod dragningar, infoga en 16G x 45 mm intravenös kateter genom intakt huden distalt om den arteriella lårbenshals skära ner webbplats. Fram katetern till kirurgisk exponering och visualisera det som det går in i den exponerade femoral ven omedelbart intill den arteriella slidan. När ordentligt i venen, dra ut injektionsnålen, cap katetern med en 3-vägs kranen och spola med 2 mL 0.9% steril koksaltlösning. Säkra katetern till huden med en 0-silk sutur.
- Gör ett 8-10 cm snitt i huden direkt på toppen av regionen just gemensamma halspulsådern och dissekera fascian för att isolera fartyget från den omgivande vävnaden.
- Försiktigt införa tången mellan halspulsådern och vagusnerven att separera. Undvik att röra den mer än nödvändigt eftersom det kan orsaka sammandragning av fartyget halspulsådern.
- Torka det exponerade området av artären med steril gasväv att undvika FeCl3 lösning utspädning.
- Plats Doppleren flöde sonden runt halspulsådern ger lunka utrymme till wrap navelsträngen tejp runt halspulsådern utan att vidröra sonden flöde och starta inspelningen blod hastigheten och fortsätta under hela förfarandet (figur 1 topp). Registrera baslinjen flödet för ~ 5 min innan navelsträngen tejpen.
Obs: Baseline flöde innan FeCl3 navelsträngen tejp placering vanligtvis genomsnitt uppgår till omkring 250 mL/min. - Linda den beredda FeCl3 navelsträngen tejpen runt den halspulsådern med en hemostat omedelbart nedanför flöde sonden utan att röra den för 15 min, ta bort och kassera.
Obs: Ocklusion designeras som noll flöde mL/min. - Stabilisera den ocklusiva tromben för 45 min. Lägg till ytterligare koksaltlösning till sonden som behövs för att upprätthålla en signal.
Obs: Beroende på ålder, kön och vilken typ av hund, ytterligare placeringar av beredda FeCl3 navelsträngen bandet kan vara nödvändigt för att tillåta 30 min för ocklusion att inträffa innan re-ansökan. Inga skillnader observerades i trombos av järnklorid ansökan med genus i beagles. Det konstaterades inte nödvändigt med denna modell att återanvända en färsk FeCl3 navelsträngen tape mer än en gång och aldrig har avvikit från protokollet FeCl3 navelsträngen tejp förberedelse. Om laboratoriet använder en annan ras eller ålder hund, den FeCl3 navelsträngen tape bör tillämpas på den ursprungliga ämnen att se till att protokollet trombos inte avviker eller en grupp av hörntänder kan vara nödvändigt att fastställa FeCl3 Ansökningstid för att ras eller ålder i deras specifika studie. De ocklusion gånger, i detta experiment, varierar från 8-30 min efter FeCl3 navelsträngen tejp ansökan. - För att bestämma volymen stroke eller blödningar utöver de nedströms tromboemboliska händelser som kan resultera från farmakologiska interventioner, transportera hundar med ytterligare ketamin injektion till en magnetisk resonanstomografi maskin (se nedan för ytterligare bearbetning).
- Medan fortfarande under ett djupt kirurgiska plan av anestesi från en slutlig angiografi/MRT (se nedan för protokoll avbildning), indikeras av en brist på svar på skadliga stimuli, samla helblod önskas för senare analys, sedan öppna bröstet genom att skära igenom revbenen start vid bröstbenet och punktskatter hjärtat genom att skära blodkärlen (exsanguination).
Obs: I detta experiment, hela blod (< 10 mL) drogs vid baslinjen, 5 min efter agent administration och 60 min efter infusion från den femorala slidan och såg ingen effekt på processen för trombolys. På offer, kan en obegränsad volym dras för ytterligare plasma lagring om godkänd i protokollet djur. Analysera, bearbeta och lagra alla helblod inom 30 min av offer. Se till att blod inte dras över godkända procentandelen av djurets kroppsvikt som detaljerad på protokollet godkända djur. Alla experiment som beskrivs var icke-återvinning. - Skölj hjärtat med 0,9% koksaltlösning och flash frysa proverna i den flytande kvävgasen om så önskas.
- Innan du tar bort halspulsådern, mäta clot längden genom att placera en linjal bredvid den och posten. Placera den vävnad markören på mitten av koagel och på samma ställe på den kontralaterala halspulsådern för att underlätta i histologi trimning. Markera den kontralaterala halspulsådern på samma längd.
Obs: Den genomsnittliga clot längden med denna modell är 1,75 cm. - Ta bort hela längden av proppen på både fartyg och fixa i 10% formalin. Ta bort den kontralaterala halspulsådern i längden präglas av vävnad markören. Halvera den kontralaterala halspulsådern på mitten av koagel. Blixt frysa halva den kontralaterala halspulsådern i flytande kväve för senare analys och fixa den andra hälften i 10% formalin till bädda in bredvid den skada halspulsådern för histologisk analys nedan.
- Ta bort organ för varje önskad analys, skölj med 0,9% koksaltlösning och flash frysa i flytande kväve.
- Ta bort skallen med en cirkulär ben såg. Ta långsamt bort skallen utan att skada hjärnan under.
- När hjärnan tas bort från skallen, skölj den i kallt 0,9% koksaltlösning och skär två 4 mm sektioner från mitten av hjärnan, sidled skära med en vass skalpell. Placera ett av avsnitten 4 mm till 2% TTC för ischemisk avgränsning (se ytterligare bearbetning för hjärnan TTC), medan den andra skiva 10% formalin i 7 dagar för H & E färgning (se ytterligare bearbetning för hjärnan H & E).
3. Hundarnas angiografi
Obs: Detta visas i figur 2 och görs under operationen vid tidpunkter av intresse.
- Känner för en puls i regionen just inguinal och göra en 3-5 cm ventrala sagittal incision.
- Utsätta femoralisartären och skilja det från de omgivande vävnaderna med trubbig dissektion.
- Använda en rätvinklig hemostat för att placera en 0-silk sutur runt den distala änden av exponerade artär.
- Knyta distala 0-silk suturen och applicera liten spänning till artären genom fastspänning Lös 0-silk suturen ändarna till huden med Peanger.
- Placera en andra 0-silk sutur runt segmentet exponerade proximala ände.
- Punktering i artär midway mellan den proximala och distala 0-silk suturen band med en 18G introduktören nål för att passera en guidekabel in i artären.
- Ladda en monterade 6Fr slida och dilatator på ledaren, greppa kabeln när det matas ut från församlingen.
- Främja dilatator och slida över ledaren. Se till att behålla ett fast grepp om tråden som det sticker ut från dilatator samtidigt avancera dilatator slida församlingen.
- Efter full införande, binda proximala 0-silk suturen runt slidan att bibehålla hemostas vid arteriell injektionsstället.
- Ta samtidigt bort dilatator och ledaren.
- Öppna enkelriktad ventil för att kontrollera förekomsten av pulserande blodflödet och spola med 3-5 mL fysiologisk koksaltlösning.
- Anslut den tillgång slida envägsventil till en vätska fylld förlängning raden kopplad till en tryckgivare att övervaka och registrera invasiva blodtrycksmätningar.
- Pre-load en 0,35 ”guidekabel in en 4Fr. angiografisk kateter och Anslut till kontrast injektion grenröret med en Tuohy y-adapter.
- Dra spetsen på ledaren precis innanför den distala spetsen på katetern och spola hela församlingen med saltlösning.
- Infoga den angiografiska katetern i den hemostatiska ventilen i slida och sedan avancera ledaren ca 5 cm längre än distala kateterspetsen.
- Under fluoroskopisk vägledning och med en retrograd trans-aorta metod, långsamt fram katetern i aortabågen.
- Injicera 2-3 mL kontrast agent utspädd 1:1 med fysiologisk koksaltlösning att identifiera start av brachiocephalic stammen.
- Använda ledaren direkt katetern in den brachiocephalic stammen, och sedan selektivt in den just gemensamma halspulsådern.
- Ta bort ledaren och injicera 2-3 mL utspädd kontrast till verifierar att katetern placeras i halspulsådern.
- Injicera 3-4 mL outspädd kontrast under inspelning angiografiska löprundor med både digital subtraktion och standard angiografiska tekniker.
- Upprepa steg 3.18-3.21 för de upprepade angiografi vid ytterligare tidpunkter.
4. kärnmagnetisk resonans - Diffusion vägda Imaging (DWI) och T2 viktade imaging (T2WI) av hundarnas hjärna
Obs: Detta visas i figur 3A-3B.
- Se till att hunden är under djup anestesi.
- Se till att hundens fysiologiska parametrar övervakas under hela den imaging inklusive EKG och puls.
- Se till att hunden ljuger i ryggläge med huvudet i bilaterala öppningarna av hjärnan spolen.
- Aktivera 3 Tesla (3T) magneten.
- Utföra T2 viktade imaging (T2WI), en grundläggande puls sekvenser i MRI.
Obs: Sekvensen använder skillnaderna i T2 avkoppling tiden av vävnader vid olika sjukdomstillstånd. - Utföra localizer imaging för att förvärva pilot bilder av en hund hjärna innan den anatomiska bildåtergivning med T2-viktade gradient echo imaging sekvens och avgöra synfältet (FOV), antal skivor och skiva tjocklek att helt täcka hjärnan.
- Använd följande T2-parametrar: skiva tjocklek = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, förvärv matris = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixlar, bildupplösning = 2.4615 pixlar per mm.
- Utföra diffusion vägt bildåtergivning (DWI) med echo hyvel DTI sekvens 4 h efter MCA ocklusion och omedelbart före offer.
- Använd följande DWI parametrar: b = 1500 s/mm2, slice tjocklek = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, förvärv matris = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, bildupplösning = 0.9333 pixel/mm (tabell 1).
5. hematoxylin och Eosin (H & E) färgning av hundarnas hjärnan
Obs: Detta visas i figur 3D.
- Efter 7 dagar i 10% formalin, bädda in avsnitten 4 mm hjärnan i paraffin.
- Trimma paraffin blocken tills de är i nivå med en mikrotom, ta bort eventuella ytterligare paraffin från toppen av hjärnvävnaden, och sedan skär hjärnvävnaden vid 4 µm och placera en hjärna avsnitt på varje 2 ”x 3” tums bild.
Obs: Innan färgning, placera alla lösningar i separata behållare så att bilder kan flyttas från en lösning till en annan utan att torka ut. - De paraffinize varje hjärna bild och återfukta med kranvatten.
- Placera varje hjärna bild i Hematoxylin 560 i 8 min.
- Skölj varje hjärna bild i kranvatten.
- Skilja varje hjärna bild med 1% syra alkohol för 1 s tre gånger.
- Skölj varje hjärna bild i kranvatten.
- Blå varje hjärnan bilder med 1% ammoniumhydroxid för 1 s.
- Skölj varje hjärna bild i rinnande vatten i 2 min.
- Torka varje hjärna bild i 70% etanol (EtOH) för 1 s tolv gånger.
- Counterstain varje hjärna bild i eosin för 1 min.
- Torka varje hjärna bild i 95% EtOH för 1 s tolv gånger.
- Torka varje hjärna bild i 100% EtOH.
- Rensa varje hjärna bild i xylen och sedan tillämpa en 2 ”x 3” tums täckglas ovanpå hjärnan bilden, ta bort luftbubblor med hartsartade montering media.
Obs: Alla lösningar återanvänds utom vatten och etanol i flera dagar av färgning och flera bilder. All bearbetning efter hjärnan sektioner är placerade på bilderna görs i glas färgning burkar, men färgning plastbehållare är kommersiellt tillgängliga också. Ersätta någon lösning när det blir missfärgade och skyddar dem tätt.
6. hematoxylin och Eosin (H & E) färgning av hundarnas halspulsådern
Obs: Detta visas i figur 1 (vänster).
- Efter 24-72 h i 10% formalin, halvera den skada halspulsådern på mitten av koagel och bädda in ~ 1 cm av skadade halspulsådern och ~ 1 cm av den kontralaterala kontrollen i samma paraffin kassett.
Obs: Blodpropp inuti halspulsådern är bräcklig. Vänta tills fartyget har korrigerats i 10% formalin före kapning så att proppen inte störs. Bädda in båda skadade och styra halspulsåder i samma paraffinet block kommer att tillåta styckning på samma gång på samma ställe i blodkärlen. - Trimma paraffinblock tills nivå med en mikrotom, ta bort eventuella ytterligare paraffin. Sedan skära sektioner vid 4 µm på 25 x 75 mm x 1 mm-diabilder utan roterande paraffin blocket så att avsnitten kontralaterala halspulsådern placeras överst på bilden.
Obs: Tre halspulsådern delar placerades på varje bild, men man kan lägga till beroende på fläckar av intresse. - De paraffinize varje halspulsådern bild och återfukta i kranvatten.
Obs: Till skillnad från hjärnan bilden som ska behandlas individuellt, halspulsådern bilderna kan bearbetas i bulk genom att placera i burkar som passar flera bilder i taget utan att röra varandra. - Fläcken varje halspulsådern bild i hematoxylin i 8 min.
- Skölj varje halspulsådern bild i kranvatten.
- Skilja varje halspulsådern objektglas med 1% syra alkohol för 1 s tre gånger.
- Skölj varje halspulsådern bild i kranvatten.
- Blå varje halspulsådern objektglas med 1% ammoniumhydroxid för 1 s.
- Skölj varje halspulsådern bild i rinnande vatten i 2 min.
- Torka varje halspulsådern bild i 70% EtOH för 1 s tolv gånger.
- Counterstain varje halspulsådern bild i eosin eller 1 min.
- Torka varje halspulsådern bild i 95% EtOH för 1 s x 12.
- Torka varje halspulsådern bild i 100% EtOH.
- Rensa varje halspulsådern bild i xylen och lägga till ett 24 x 50 mm täckglas med hartsartade montering media att ta bort luftbubblor.
7. 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazoliumklorid (TTC) färgning av hundarnas hjärnan
Obs: Detta visas i figur 3 c.
- Plats avsnittet övrigt 4 mm bort från mitten av hjärnan omedelbart proximala till avsnittet H & E in tidigare beredd 2% TTC (carotid artärocklusion). Inkubera i mörker vid 37 ° C i minst 20 min, roterande över avsnittet hjärnan för även färgning var 5 minut.
Obs: Efter 20 min, avsnittet bör körsbärsrött som på båda sidor. Ytterligare tid kan behövas baserat på TTC friskhet och tjocklek på vävnaden avsnitt. - Ta bort TTC lösningen och ersätta det med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS, pH 7,4 att optimera kontrasten.
- När kontrasten mellan vita och röda färgning är optimalt, placera TTC hjärnan skivor mellan klar plast ark, torka av överflödig vätska, och skanna med hög upplösning för spårning av ischemisk regioner.
Obs: Avsnitten kan lagras på obestämd tid med i PARAFORMALDEHYD lösning, men färgning kommer att blekna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enligt de detaljerade förfarandena som häri kommer att resultera i utveckling av en modell som kan användas för profylaktiskt eller trombolytisk bedömning av ocklusiv arteriell interventioner. Figur 1A visar baslinjen strömningshastighet och den resulterande blod flödeshastigheten före, under och efter behandling registreras av en kommersiell programvara. Data från denna inspelning kan användas för att bestämma procenten av re perfusion med halspulsådern skada och behandling i denna hund modell. Figur 1B ger ett exempel på både kontralaterala (överst) och skadade (nederst) Hundarnas halspulsådern sektioner färgad med H & E som verifierar re canalizationen status vid tidpunkten för offer. Det finns en mängd program att analysera området perfunderade i fartyget genom att spåra de blodkärl (utan trombos) som kan delas av total yta på fartyget att komma fram till en procent av canalizationen med varje behandling. Figur 2 visar flera exempel på halspulsådern angiografi i detalj i denna hund protokoll som kan användas för att avgöra om tromben är ocklusiv. Dessutom kan använder fyrkantiga flöde sonden som markör, utredare bestämma längden på tromben vid varje tidpunkt angiogrammet tas. Även här har vi presenterat bilder innan skada, 60 min efter fordonet behandling, och vid tiden för offer, kan utredaren skräddarsy imaging till deras behov. Figur 3 är resultatet av de magnetiska imaging parametrar tillämpas på Hundarnas hjärnan ~ 4 h efter halspulsådern ocklusion omedelbart före offer, utnyttja både diffusion vägt (figur 3A) och T2 viktade imaging (figur 3B) närmare i avsnitt 4 i detta protokoll. Men vi visar bara ett foto av hela matrisen tagit på olika nivåer i hjärnan, kan storleken på både blödning och stroke volym identifieras i olika nivåer och områden i hjärnan och quantitated vid varje tidpunkt som önskas av prövaren. Kvantitering slutförs med hjälp av specifika MRI maskin programvara specifika för prövarens imager. Den TTC färgning resultat som visas i figur 3 c kan användas för att avgränsa hjärnvävnad där cellerna är fortfarande metaboliskt aktiva förutom de som inte är. TTC minskas enzymatiskt för att resultera i röd färgade levande celler medan döda celler inte kommer behålla TTC och därmed blir inte röd. Slutligen den hematoxylin och eosin färgning tekniken demonstreras i Hundarnas hjärnan i figur 3D kommer att resultera i färgning röda blodkroppar klarrött som kan användas för att verifiera områden där blödning har inträffat.
Figur 1: övervakning av halspulsådern blodflöde. (A) representativa halspulsådern blod velocity (mL/min) inspelade från Doppleren sonden från baslinjen innan skada genom offer. (B) representant H & E färgning av både ockluderas halspulsådern (nederst) och kontralaterala kontroll (överst). Förstoring är 20 X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: övervakning av halspulsådern blodflödet av angiografi. Representativa angiografi Visa av höger hörntand halspulsådern. Bilder är tagna vid baseline innan fordonet infusion (A), 60 min efter fordonet infusion (B), och vid tidpunkten för offer, 4.5 h efter ocklusion (C). Röda pilarna visar på plats på fartyget av FeCl3-inducerad skada där navelsträngen bandet placerades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder av hundarnas hjärnan efter fordonet behandling. Magnetisk resonanstomografi (MRT) utförs ~ 4 h efter ocklusion, omedelbart före offer, utnyttja diffusion vägt imaging (DWI, (A) och T2 viktade imaging (B). TTC färgning av mediala avsnitt vid tidpunkten för offret att avgränsa live från död vävnad (C). H & E färgning av mediala avsnitt, omedelbart proximalt TTC avsnitt, vid tidpunkten för offret att avgränsa vävnad som är metaboliskt aktiva (röd) från de som inte är TTC reduceras till en röd produkt när tas upp av levande celler och därför kommer att resultera i sektioner som kan kvantifieras med en mångfald av programvara för att spåra live vs döda regioner. (D). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Experimentell Parameter | T2-viktade | Diffusion vägt |
| Upprepning tid (TR) ms | 4000 | 4600 |
| ECHO tid (TS) ms | 75 | 86 |
| Knäppa vinkel, grader | 180 | 90 |
| Förvärv matris | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Antal medelvärden | 2 | 4 |
| I planet bildens upplösning (bildpunkter/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tabell 1: Magnetic Resonance Imaging (MRI) parametrar. MRI-parametrar som utvecklades för hundarnas T2 - och Diffusion-viktade bilder för att maximera för bedömning av stroke och blödning volymmätning i Hundarnas halspulsådern trombos modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FeCl3 inducerad vaskulär skada modellen används ofta för att studera trombos i små djur och är lätt att översätta till en stor djur, preklinisk modell med en mängd fördelar. Smärre ändringar att anpassa protokollet till ett hunddjur tillåta utnyttjande av både magnetisk resonanstomografi att bedöma stroke och blödning volymer efter en farmakologisk intervention och angiografi att bedöma fartyget canalizationen före, under, och efter behandling. Andra trombotiska stora djurmodeller har inte studerat stabiliserad ocklusiva tromboser på platsen för skadan och därför inte kan utnyttja angiografi och histologi av den halspulsådern att bedöma omfattningen av förnyad canalizationen för varje profylaktiskt eller trombolytisk behandling. Förutom fördelarna med ett stort djur som inkluderar gott om vävnad för analys (plasma, urin, organ för toxicitetsstudier, etc.), efterliknar den stora djurmodell mycket närmare den puls, blodtryck och koagulationskaskaden hos människor än gnagare modeller. Lämplig storlek på både hjärnan och carotid artärer, resultatet i histologiska och biologiska material som kan användas för en uppsjö av inflammatoriska och biokemiska undersökningar på varje experimentella djur. En annan fördel med ändra FeCl3-inducerad vaskulär modell till ett hunddjur är att en mycket större blodvolym kan utvinnas under experimentet utan att ändra trombocytantal reaktivitet eller tromb bildas sådana som blod gas och komplett blod räkningarna kan övervakas under hela infusionen skada och drog. Dessutom har järnklorid skadan tillskrivits oxidant skadan; det därför kommer härma aterosklerotiska skador som föregår klinisk stroke och hjärtinfarkt mycket närmare än de andra typerna av publicerade arteriell skada modeller7. Slutligen, mekaniska ingrepp såsom trombektomi, som används rutinmässigt kliniskt, kan följa farmakologisk behandling så att re-stenos och status för endothelial vägg hälsa kan åtgärdas med gott om histologiska vävnad för flera utredningar på den samma hund.
Begränsningar av denna modell är få men behöver beaktas. Första, även om den tidpunkten och behandling valt i denna publikation (offra 4,5 h efter halspulsådern skada, fordon) resulterade inte i en mätbar stroke eller blödning, denna metod är kliniskt relevant för utredningen av romanen anti-trombotisk och trombolytiska medel att avgöra effekten och dosering. Faktiskt både stroke och/eller blödning med inledande trombotiska förolämpa eller med farmakologisk behandling (dvs rTPA) förekommer med denna modell. För det andra, Hundarnas kostnader för inköp, frakt, genmanipulation och traktamente är ganska höga och kosta oöverkomliga tills en drog är välkarakteriserad i djurmodeller.
Kritiska steg i protokollet center på trombocytaktivering, aggregering och vidhäftning, den springande punkten i trombos. Eftersom trombocyter funktion analysatorn (PFA-100) kan utföras med 1600 µL helblod i två exemplar, är denna metod enkel och lätt att spåra trombocytantal reaktivitet under hela förfarandet utan att påverka blod homeostas. Ytterligare ex vivo -studier i trombocytantal aktivitet med impedans eller lumi-aggregometry kan utföras innan vaskulär skada utan att påverka experimentella trombos så länge det sista blodprov är > 1 vecka före operation utöver efter skada och behandling vid tidpunkten för offer. Som tidigare diskuterats, ytterligare tillämpningar av navelsträngen tejp indränkt i 50% FeCl3 kan vara nödvändigt beroende på kön, ras eller ålder för varje hund. Vi får 30 minuter efter skada för ocklusion och ommålas färsk 50% FeCl3 för en annan 15 min om det behövs. Denna process resulterade inte i en signifikant skillnad i trombolytisk avvikelse med ålder eller kön använder vuxen beaglar. I denna studie har vi klarlagd kritiska och state-of-the-art diffusion vägda imaging (DWI), en MR imaging baserat på mätning av Brownsk rörelse (random diffusion av partiklar) av vattenmolekyler i den vävnad voxel. Denna teknik är användbart vid identifiering av akut ischemisk stroke bland andra sjukdomar såsom tumörer genom visar diffusion i hyper-cellulära vävnader eller de med cellulär svullnad låg med högre diffusion koefficient17,18 ,19. Diffusion kartor varierar med diffusion av vattenmolekyler i hjärnans vävnad17,18,19. B-värdet mäter lutning för diffusion av H2O molekyler. I ischemiska skadan webbplats upplevelser gratis vattnet starkaste signalen dämpning vid högre B-värden19.
Förutom användningen av detta Hundarnas protokoll för studier på dosering, toxicitet och effekten av profylaktisk och trombolytiska medel gör storleken på en hund experiment i mekanisk trombektomi kliniskt relevanta och lätt genomförbara. Halspulsådern kan enkelt bearbetas, betsad och bedömda utnyttja protokoll för mänskliga histologi för studie av immunceller infiltration efter blodpropp hämtning. Dessa studier kommer att bli vår nästa detaljerade protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi vill tacka centrum för kognitiva och beteendemässiga hjärnavbildning vid The Ohio State University för deras finansiella och vetenskapliga stöd att utvecklas och prestera Hundarnas magnetisk resonanstomografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
