Canine halsslagader ferrichloride-geïnduceerde trombose: Een grote diermodel van vasculaire verwonding

Summary

Hier presenteren we de wijzigingen die noodzakelijk zijn naar een goed gekarakteriseerd en gebruikte kleine ferrichloride-geïnduceerde (FeCl₃) halsslagader letsel diermodel voor gebruik in een grote dierlijke vasculaire verwonding-model. De resulterende model kan worden gebruikt voor pre-klinische proef beoordeling van zowel preventieve als thrombolytic farmacologische en mechanische interventies.

Abstract

Occlusieve arteriële trombose leidt tot cerebrale ischemische beroerte en een hartinfarct draagt bij tot de dood ~ 13 miljoen jaarlijks wereldwijd. Wij hebben hier, een model van de vasculaire verwonding van een klein dier in een groot dier (Honds), vertaald met lichte wijzigingen die kunnen worden gebruikt voor pre-klinische screening van profylactische en thrombolytic agenten. Naast de chirurgische methoden bevat het gewijzigde protocol stapsgewijze methoden voor de beoordeling van de halsslagader kanalisering door angiografie, gedetailleerde instructies voor het verwerken van zowel de hersenen en de halsslagader voor histologisch analyse om te controleren of de halsslagader kanalisering en hersenbloeding, en specifieke parameters voor het voltooien van een evaluatie van downstream trombo-embolische gebeurtenissen met behulp van magnetische resonantie imaging (MRI). Daarnaast worden specifieke procedurele wijzigingen ten opzichte van de eerder gevestigde kleine diermodel moet vertalen in een groot dier (Honds) vasculaire verwonding besproken.

Introduction

Beroerte therapie is grotendeels gemodelleerd na de behandeling van de ziekte van de kransslagader, vooral omdat de interventies in hart-en vaatziekten goed op drug therapie en endovasculaire interventies¹hebben gereageerd. Deze behandelingen, echter vertaald niet met succes naar cerebrale infarct. De problemen met de huidige behandeling van de beroerte zijn dat de recombinante tissue plasminogen activator (rTPA) kan niet worden teruggedraaid, en dat beheer draagt een aanzienlijk risico van 6,4% van hemorragische conversie^{2,3, 4}. de resulterende morbiditeit en mortaliteit beperkt het gebruik tot een klein, vaak onbereikbaar venster⁵. Ook, restenose en occlusie optreden vaak na de eerste trombolyse, omkering van de eerste neurologische verbetering. Kortom is er een smalle temporele venster voor het beheer van rTPA dat uitsluit van de grote meerderheid (~ 90%) van patiënten met ischemische cerebrovasculaire beledigingen.

De rol van intraveneuze antiplatelet therapie heeft aangetoond belofte in de behandeling van ischemische beroerte met verbeterde vaartuig recanalization, overleving en resultaat². Helaas, deze drugs hebben een voorspelbare neveneffect van intra craniale en extra hersen bloeding, grotendeels omdat er geen manier om voldoende omkeren of controle van hun activiteit². Terwijl het effectief in het voorkomen van aggregatie van bloedplaatjes, het risico van bloedingen en het onvermogen om te keren van hun activiteit hebben uitgesloten het gebruik ervan in de routine zorg van beroerte-patiënten. Een, daarom, noodwendigheid voor krachtige antitrombotica geneesmiddelen die afzonderlijk of in combinaties lyse stolsels te voorkomen handelen nog hebben een veiligheidsprofiel waarmee het gebruik in een gesloten, lage volumeruimte zoals de hersenen, waar de bloeding wordt slecht verdragen.

Inzicht in het mechanisme van arteriële trombose en re-stenose en het evalueren van thrombolytics en drugs die voorkomen re-stenose dat, vereist zowel de grote als de kleine dierlijke modellen als onderdeel van de pre-klinische Geneesmiddelenontwikkeling. Ferrichloride-geïnduceerde vasculaire verwonding is een veel gebruikte techniek ertoe snel en nauwkeurig de vorming van stolseltjes in blootgestelde bloedvaten van muizen, ratten, cavia's, en konijnen van^{6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12}. deze kleinere soorten bieden verschillende voordelen, met inbegrip van gemak van genetische manipulatie, goedkope dierlijke inkoop en lage per dag huisvestingskosten. Helaas, kleine dierproeven ontkennen meerdere bloed trekt tijdens de operatie toegang bloedplaatjes reactiviteit, bloed gas-analyse en inflammatoire respons. Nog belangrijker, nabootsen grote dieren veel nauwer menselijke bloedplaatjes fysiologie^6,13. Het FeCl₃ halsslagader letsel model heeft een doorslaggevende rol gespeeld in de studie van de pathofysiologie van trombose bij de validatie van nieuwe anti-bloedplaatjes en anti-coagulans drugs en de ontdekking van potentiële thrombolytics^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. vorige modellen in muizen, ratten, cavia's, en konijnen hebben verstrekt, gemak en flexibiliteit voor de genetische manipulatie, maar vertaalbare preklinische modellen zijn kritieke patiënt toediening, toxiciteit onderzoeken van potentiële therapeutics^{6 ,},¹³. Hoewel verschillende modellen van trombotische stoornissen hebben ontwikkeld in muizen, grote dierlijke modellen van trombose die voor de perifere vaatziekten gelden, zijn beroerte en een hartinfarct paar en verre. De eerste trombose modellen in apen, honden en varkens gericht op stenose, toepassen van hemostats en later cilinders op schepen, vaak resulterend in cyclische stroom verlagingen^14,15,16. In plaats van een occlusieve trombose op de site van het endotheel schade zoals in de ferrichloride-model, de trombose in deze modellen resulteerde in cyclische trombose, distale embolisatie kan leiden en terug te keren naar normale bloedstroom. Ter vergelijking: de ferrichloride model hier in een groot dier, resulteert in een occlusieve trombose op de site van schade gewijzigd en is gestabiliseerd en geverifieerd door angiografie vóór thrombolytic behandeling. Mits de onderzoeker ruime middelen heeft voor per diem en aankoop van de hoektanden en voldoende chirurgische expertise, wij hier een grote canine model van vasculaire verwonding detailleren om laboratoria te bestuderen trombose met behulp van chirurgische, imaging en histologische technieken.

Protocol

De onderzoeken beschreven voldoen aan de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en zijn goedgekeurd door de Ohio State University institutionele Animal Care en gebruik Comité (#2015A00000029). Alle chirurgische manipulaties werden uitgevoerd onder diepe verdoving en de dieren ondervonden geen pijn in elke fase tijdens de procedure. Alle experimenten beschreven werden teruggevorderd.

1. voorbereiding

1. Vers bereiden 50 mL ferrichloride (FeCl₃) op 50% (m/v) verdund in gedeïoniseerd water.
2. De navelstreng tape in 5.5 cm stukjes gesneden en geniet van de vers bereide oplossing van 50% FeCl₃ 1 week voor de procedure.
   Opmerking: De gebruikte navelstreng tape is dik en duurt enige tijd om te absorberen de 50% FeCl₃ oplossing.
3. Snel elke canine overnachting voor de operatie.
4. Label cryovials voor plasma en urine collectie, 50 mL steriele centrifuge buizen voor alle orgel opslag, en 10% formaline containers voor hersenen en halsslagader fixatie voor H & E kleuring met identificatie van de dieren, de geboortedatum, de datum van operatie en behandeling.
5. Bereiden van 100 mL elke oplossing voor iedere canine procedure: 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.4), 10% neutraal gebufferd formaline, en 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride [TTC in PBS (pH 7.4), slaan in het donker].
6. Het verwerven van voldoende vloeibare stikstof voor alle cryovials en 50 mL weefsel buizen voor flash bevriezing voor de dag van de procedure.
7. Verwerven van twee ADP/collageen cartridges voor PFA-100 (bloedplaatjes functie Analyzer) bloedplaatjes reactiviteit voor elke canine voor elk punt van de tijd van belang.
8. Verwerven van een 4.5 mL Natriumcitraat bloed collectie buis, voor elke bloed trekken voordat offer, voor plasma scheiding en opslag. Tekenen op offer, 16 bloed collectie buizen voor de opslag van het plasma. Na elke bloed collectie buis volledig is opgeladen, spin op 4000 x g voor 30 s te isoleren platelet rich plasma en overdracht duidelijk laag in cryovials. Flash bevriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij-80 ° C.
9. Verwerven van een 4.5 mL lithium heparine bloed collectie buis, voor elk tijdstip van de PFA-100 voor record bloedplaatjes reactiviteit van belang. Bij elke bloed trekken, door 800 µL van volbloed van een lithium heparine bloed collectie buizen in elke cartridge ADP/collageen zonder luchtbellen te volgen van de bloedplaatjes reactiviteit te introduceren.
10. Verwerven twee K3 EDTA-bloed-collectie buizen (1,8 mg watervrij EDTA per 1 mL bloed), voor complete blood count (CBC) op basislijn en op moment van offer.
    Opmerking: Dit volume is voldoende voor de meeste faciliteiten van de kern te lopen elk tweemaal in geval van mechanische fout. Hoewel een CBC werd uitgevoerd op beide de basislijn voordat schade en op het moment van offer, kunnen onderzoekers toevoegen dat meer bloed trekt als goedgekeurde in hun dierlijke protocollen voor verder analyses. Neem contact op met de faciliteit over volumes en levering eisen voor hun apparatuur.
11. Bereid een 2 mL heparinized spuit door vullen en coating van de spuit de dag van de procedure voor gas bloedwaarden ten tijde van het offer.
    Opmerking: Neem contact op met de faciliteit over volumes en levering eisen voor hun apparatuur.

2. honden halsslagader occlusie

1. Wegen van een volwassene (> 18 maanden) beagle canine en vooraf genezen met intramusculaire acepromazine (0,025-.2 mg/kg) gevolgd door een eerste intraperitoneale injectie van ketamine (5-20 mg/kg) en midazolam (0.01-.25 mg/kg). Induceren dieper anesthesie met 1-5% Isofluraan gebaseerd op de hartslag, ademhalingen en kaak Toon.
   Opmerking: Exacte verdoving wordt gedicteerd door het gewicht en de goedgekeurde dierlijke protocol. Hoewel injecties leiden pijn voor de dieren tot kunnen, de duur van dit ongemak minimaal zal zijn (minder dan 3 s).
2. Voorafgaand aan het huisdier wilt meenemen naar de operatie tafel, verwijderen van haren door het knippen. Toepassing smeerolie ophthalmic zalf voor de narcose dier ogen ter voorkoming van droogte.
3. Plaats het dier in liggende positie met behulp van een positiebepalingssysteem en hechten elektrocardiogram (ECG) leidt tot voet pads. Intubate via de luchtpijp met een 6.5 mm geboeid Endotracheale tube, mechanisch ventileren op 14 adem/min en onderhouden van elke hond met een voortdurende inademing van 1-5% Isofluraan (afhankelijk van het goedgekeurde dierlijke protocol).
4. Uitvoeren om te bepalen van de omvang van de kanalisering van de halsslagader en de lengte van de occlusieve trombose, angiografie voor letsel, voordat de MRI, en ten tijde van offer (zie hieronder voor verdere instructies).
5. Invoegen van een femorale arteriële schede en een kunststof katheter en veilig met een losse 0-silk hechtdraad. Sluit tijdelijk de schede en de katheter tijdens het vervoer en de studies imaging. Zie canine angiografie hieronder voor verdere instructies).
6. Bloed trekt, plaatst een 16G x 45 mm intraveneuze katheter via de intacte huid distale aan de femorale arteriële schede site omgehakt. Vooraf de katheter in de chirurgische blootstelling en visualiseer het als het binnenkomt in de blootgestelde femorale ader onmiddellijk grenzend aan de arteriële schede. Eenmaal volledig ingevoegd in de ader, terugtrekken van de naald, de katheter met een 3-weg-afsluiter van het GLB en het spoelen met 2 mL steriele zoutoplossing 0,9%. Beveilig de katheter aan de huid met een 0-silk hechtdraad.
7. Maken van een incisie van 8-10 cm van de huid direct op de bovenkant van de right admin halsslagader regio en ontleden de fascia om te isoleren van het vaartuig van het omringende weefsel.
8. Zorgvuldig introduceren pincet tussen de halsslagader en de nervus vagus te scheiden. Raak de halsslagader meer dan noodzakelijk, omdat het leiden vernauwing van het schip tot kan.
9. Droog het blootgestelde gebied van de slagader met de steriel gaas om te voorkomen dat FeCl₃ oplossing verdunning.
10. Plaats de Doppler sonde rond de halsslagader waardoor amble ruimte te wikkel de navelstreng tape rond de halsslagader zonder het aanraken van de sonde stroom en start de opname van de snelheid van het bloed stromen en blijven gedurende de hele procedure (Figuur 1 Top). Opnemen van de stroom van de basislijn voor ~ 5 minuten alvorens de navelstreng tape.
    Opmerking: De afname van de basislijn vóór FeCl₃ navelstreng tape plaatsing meestal gemiddeld ongeveer 250 mL/min.
11. Wikkel de bereid FeCl₃ navelstreng tape rond de halsslagader met behulp van een hemostat direct onder de sonde van de stroom zonder het aanraken van het voor 15 minuten, verwijderen en weggooien.
    Opmerking: Occlusie wordt aangewezen als nul stroom mL/min.
12. De occlusieve trombose voor 45 min. toevoegen extra zout aan de sonde zo nodig om een signaal te stabiliseren.
    Opmerking: Afhankelijk van de leeftijd, geslacht en het type van canine, extra plaatsingen van de voorbereide FeCl₃ navelstreng tape kunnen noodzakelijk zijn voor het toestaan van 30 min. voor occlusie optreden vóór het opnieuw aanbrengen. Verschillen niet werden vastgesteld bij trombose door ferrichloride toepassing met gender in beagles. Het bleek niet nodig met dit model opnieuw toepassen van een verse FeCl₃ navelstreng tape meer dan eens en hebben nooit afgeweken van het FeCl₃ navelstreng tape voorbereiding protocol. Als het laboratorium is het gebruik van een ander ras of leeftijd van canine, de FeCl₃ navelstreng tape moet worden toegepast op de eerste onderwerpen om ervoor te zorgen dat het protocol trombose niet afwijkt, of een groep van de hoektanden kan noodzakelijk vast te stellen van FeCl₃ de tijd van de toepassing voor dat ras of leeftijd in hun specifieke studie. De tijden van de occlusie, in dit experiment, variëren van 8-30 min na FeCl₃ navelstreng tape toepassing.
13. Om te bepalen van de beroerte of bloeding volume naast de stroomafwaartse trombo-embolische gebeurtenissen die uit farmacologische interventies voortvloeien kunnen, [LbMarket_Transport] hoektanden met extra ketamine injectie aan een machine van magnetische resonantie beeldvorming (zie hieronder voor aanvullende verwerking).
14. Terwijl nog in een diepe chirurgische vliegtuig van de verdoving van een definitieve angiogram/MRI (zie hieronder voor imaging protocol), aangegeven door een gebrek aan respons op schadelijke stimuli, verzamelen van volbloed gewenst voor een latere anayse en open vervolgens de borst door doorsnijden de ribben Basisgewicht van het borstbeen, en accijnzen het hart door het snijden van de bloedvaten (exsanguination).
    Opmerking: In dit experiment, hele bloed (< 10 mL) werd getekend op de basislijn, 5 min na toediening van de agent en 60 min na de infusie van de femorale schede en zag geen invloed op het proces van trombolyse. Bij offer, kan een onbeperkt volume worden getrokken voor extra plasma opslag, als in de dierlijke protocol goedgekeurd. Analyseren, verwerken en opslaan van alle volbloed binnen 30 min van offer. Zorg ervoor dat bloed op het goedgekeurde dierlijke protocol niet boven de goedgekeurde percentage van lichaamsgewicht van het dier als gedetailleerde wordt getekend. Alle experimenten beschreven werden teruggevorderd.
15. Spoel het hart met 0,9% zout en flash bevriezen monsters in de vloeibare stikstof indien gewenst.
16. Voordat u de carotids verwijdert, de klonter lengte worden gemeten door het plaatsen van een liniaal naast het en record. Zet de aanwijzer van weefsel in het midden van de klonter en op dezelfde plaats op de contralaterale halsslagader voor gemak in de histologie trimmen. Mark de contralaterale halsslagader op de dezelfde lengte.
    Opmerking: De lengte van de gemiddelde clot met dit model is 1,75 cm.
17. Verwijder de gehele lengte van de klonter op beide schepen en oplossen in 10% formaline. Verwijder de contralaterale halsslagader binnen de lengte gekenmerkt door de markering van het weefsel. Snij de contralaterale halsslagader doormidden in het midden van de klonter. Flash bevriezen de helft de contralaterale halsslagader in vloeibare stikstof voor een latere anayse en monteren van de andere helft in 10% formaline te sluiten naast de gewonde halsslagader histologische p.a. hieronder.
18. Verwijderen van organen voor elke gewenste analyse, spoelen met een zoutoplossing 0,9%, en flash bevriezing in vloeibare stikstof.
19. Verwijder de schedel met een cirkelvormige bot zaag. Verwijder langzaam de schedel zonder beschadiging van de hersenen onder.
20. Nadat de hersenen is verwijderd uit de schedel, spoel het in een koude 0,9% zoutoplossing, en snijd twee 4 mm secties uit het midden van de hersenen, lateraal te snijden met een scherp scalpel. Plaats een van de secties 4 mm in 2% TTC voor ischemische afbakening (Zie aanvullende verwerking voor hersenen TTC), terwijl het andere segment in 10% formaline voor 7 dagen geplaatst voor de H & E kleuring (Zie aanvullende verwerking voor hersenen H & E).

3. honden angiografie

Opmerking: Dit is afgebeeld in Figuur 2 en gebeurt tijdens de operatie op tijd punten van belang.

1. Voel me voor een pols recht inguïnale regio en maak een ventrale Sagittaal incisie van 3-5 cm.
2. De femorale slagader bloot en scheiden van de omliggende weefsels met behulp van botte dissectie.
3. Gebruik een rechte hoek hemostat om een 0-silk hechtdraad rond het distale einde van de blootgestelde slagader.
4. Tie van de distale 0-silk hechtdraad en lichte spanning op de slagader door het klemmen van de losse 0-silk hechtdraad uiteinden aan de huid met hemostats.
5. Plaats een tweede 0-silk hechtdraad rond het proximale einde van de blootgestelde segment.
6. Punctie van de slagader halverwege tussen de banden van de proximale en distale 0-silk hechtdraad met behulp van een naald 18G introducer geschiedde een begeleidingskabel in de slagader.
7. Laad een gemonteerd 6Fr schede en dilator op de begeleidingskabel, grijpen de draad als het verlaten van de vergadering.
8. Verder de dilator en schede over de begeleidingskabel. Zorg ervoor om een stevige greep van de draad als het steekt uit de dilator en bevordert tegelijk de dilator schede vergadering.
9. Na volledige inbrengen, binden de proximale 0-silk hechtdraad rond de schede om hemostase op de site van arteriële punctie.
10. De dilator en de begeleidingskabel tegelijk verwijderen.
11. Open de one-way klep om te verifiëren van de aanwezigheid van de gepulseerde bloedstroom en spoelen met 3-5 mL van normale zout.
12. Het toegang schede eenrichtings-ventiel verbinden met een vloeistof gevulde verlengingslijn gekoppeld aan een drukopnemer aan monitor en record invasieve bloeddrukmetingen.
13. Vooraf laden een 0.35" begeleidingskabel in een 4Fr. angiographic-katheter en sluit aan op het contrast injectie variëteit met een Tuohy y-adapter instellen.
14. Trek het uiteinde van de begeleidingskabel net binnen het distale uiteinde van de katheter en spoel de hele vergadering met zoutoplossing.
15. Plaats de angiographic katheter in de hemostatische klep van de schede en vervolgens verder de begeleidingskabel ongeveer 5 cm voorbij de distale katheter tip.
16. Onder fluoroscopic begeleiding en met gebruikmaking van een retrograde trans-aorta, langzaam verder de katheter in de aortaboog.
17. Injecteren contrast agent verdund 1:1 mL 2-3 met normale zout te identificeren de take-off van de brachiocephalic stam.
18. De begeleidingskabel gebruiken om te sturen van de katheter in de brachiocephalic-stam, en vervolgens selectief in de juiste gemeenschappelijke halsslagader.
19. Verwijder de begeleidingskabel en injecteren van 2-3 mL verdunde contrast om te verifiëren dat de katheter wordt geplaatst in de halsslagader.
20. 3-4 mL van de onverdunde contrast injecteren tijdens het opnemen van angiographic wordt uitgevoerd met behulp van Digitale Subtractie zowel standaard angiographic technieken.
21. Herhaal stap 3.18-3,21 voor de herhaalde angiografie op extra tijd punten.

4. magnetische resonantie - diffusie gewogen Imaging (DWI) en T2 gewogen imaging (T2WI) van canine hersenen

Opmerking: Dit is weergegeven in figuur 3A-3B.

1. Zorg ervoor dat de hond onder diepe verdoving.
2. Zorgen ervoor dat de hond van de fysiologische parameters worden gecontroleerd in de beeldvorming inclusief ECG en hartslag.
3. Zorg ervoor dat de hond in de liggende positie met haar hoofd in de bilaterale openingen van de spoel van de hersenen ligt.
4. Inschakelen van de magneet 3 Tesla (3T).
5. T2-gewogen beeldvorming (T2WI), een fundamentele pulse sequenties in de MRI uitvoeren
   Opmerking: De volgorde maakt gebruik van de verschillen in de tijd van de ontspanning T2 van weefsels in verschillende pathologische condities.
6. Localizer imaging te verwerven pilot beelden van de hersenen van een hond voordat de anatomische beeldvorming met behulp van T2-gewogen gradient echo imaging volgorde uitvoeren en bepalen van het gezichtsveld (FOV), aantal segmenten en segment dikte volledig voor de hersenen.
7. De volgende T2-parameters gebruiken: Snijd dikte = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, overname matrix = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixels, afbeeldingsresolutie = 2.4615 pixels per mm.
8. Diffusie gewogen beeldvorming (DWI) met behulp van echo planer DTI reeks 4 h na MCA occlusie en onmiddellijk vóór het offer uitvoeren
9. Gebruik de volgende parameters van de DWI: b = 1.500 s/mm², segment dikte = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, overname matrix = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, beeldresolutie = 0.9333 pixels/mm (tabel 1).

5. de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring van de Hoektand hersenen

Opmerking: Dit is weergegeven in figuur 3D.

1. Na 7 dagen in de 10% formaline, insluiten de 4 mm hersenen secties in paraffine.
2. Trim de paraffineblokken totdat ze niveau met een microtoom zijn, eventuele extra paraffine verwijderen vanaf de bovenkant van het hersenweefsel, dan knipt u het hersenweefsel op 4 µm en een deel van de hersenen op elke dia 2 "x 3" inch plaatst.
   Opmerking: Voordat de kleuring, plaats alle oplossingen in aparte recipiënten zodat de dia's kunnen worden verplaatst van de ene oplossing naar de andere zonder uitdrogen.
3. De paraffinize van elke dia van de hersenen en hydrateren met leidingwater.
4. Plaats elke dia hersenen gedurende 8 min in Haematoxyline 560.
5. Spoel elke dia hersenen in leidingwater.
6. Onderscheiden van elke dia van de hersenen met 1% zuur Alcohol voor 1 s drie keer.
7. Spoel elke dia hersenen in leidingwater.
8. Elke dia van de hersenen met 1% ammoniak hydroxide voor 1 blauw s.
9. Spoel elke dia van de hersenen in stromend kraantjeswater gedurende 2 minuten.
10. Uitdrogen van elke dia van de hersenen in 70% Ethanol (EtOH) voor 1 s twaalf keer.
11. Counterstain van elke dia van de hersenen in eosine voor 1 min.
12. Uitdrogen van elke dia van de hersenen in 95% EtOH voor 1 s twaalf keer.
13. Uitdrogen van elke dia van de hersenen in 100% EtOH.
14. Schakelt u elke dia van de hersenen in xyleen en vervolgens Breng een 2 "x 3" inch dekglaasje aan op de top van de dia van de hersenen, het verwijderen van luchtbellen met harsachtige montage media.
    Opmerking: Alle oplossingen zijn hergebruikt voor meerdere dagen van de kleuring en meerdere dia's behalve water en ethanol. Alle verwerking na hersenen secties worden geplaatst op de dia's worden gedaan in glazen potten kleuring, maar plastic kleuring containers zijn ook commercieel beschikbaar. Vervang elke oplossing wanneer het wordt verkleurd en ze te strak dekken.

6. de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring van canine carotids

Opmerking: Dit is weergegeven in afbeelding 1 (links).

1. Na 24-72 uur in 10% formaline, snij de gewonde halsslagader doormidden in het midden van de klonter en insluiten ~ 1 cm van de gewonde halsslagader en ~ 1 cm van het contralaterale besturingselement in de dezelfde paraffine cassette.
   Opmerking: De bloedklonter in de halsslagader is kwetsbaar. Wacht totdat het schip is vastgesteld in 10% formaline voor het snijden, zodat de klonter niet wordt verstoord. Insluiten van zowel de gewonden en de controle van de halsslagaderen in de dezelfde paraffine zal blok snijden toestaan op hetzelfde moment op dezelfde plaats in het bloedvat.
2. Versiering paraffineblokken tot niveau met een microtoom, het verwijderen van eventuele extra paraffine. Knip secties op 4 µm op 25 x 75 mm x 1 mm dia's zonder te draaien het blok paraffine zodat de contralaterale carotis secties aan de bovenkant van de dia worden geplaatst.
   Opmerking: Carotis driedelig werden geplaatst aan elke dia, maar men kan toevoegen afhankelijk van vlekken van belang.
3. -Paraffinize elke carotis dia en hydrateren in leidingwater.
   Opmerking: In tegenstelling tot de hersenen-dia die afzonderlijk moet worden verwerkt, carotis dia's kunnen worden verwerkt in bulk door in potten die passen bij verschillende dia's tegelijk zonder aan te raken elkaar te plaatsen.
4. Vlek elke carotis dia in Haematoxyline gedurende 8 minuten.
5. Spoel elke carotis dia in leidingwater.
6. Onderscheiden van elke carotis dia met 1% zuur Alcohol voor 1 s drie keer.
7. Spoel elke carotis dia in leidingwater.
8. Elke carotis dia met 1% ammoniak hydroxide voor 1 blauw s.
9. Spoel elke carotis dia in stromend kraantjeswater gedurende 2 minuten.
10. Uitdrogen van elke carotis dia in 70% EtOH voor 1 s twaalf keer.
11. Counterstain elke carotis dia in eosine of 1 min.
12. Uitdrogen van elke carotis dia in 95% EtOH voor 1 s x 12.
13. Uitdrogen van elke carotis dia in 100% EtOH.
14. Schakel elke carotis dia in xyleen en toevoegen van een 24 x 50 mm dekglaasje aan met harsachtige montage media om te verwijderen van de luchtbellen.

7. 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium Chloride (TTC) kleuring van de Hoektand hersenen

Opmerking: Dit is weergegeven in Figuur 3 c.

1. Plaats de andere 4 mm-sectie verwijderd uit het midden van de hersenen onmiddellijk proximale naar de H & E sectie in eerder bereid 2% TTC (occlusie van de halsslagader). Incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende ten minste 20 minuten, draaien over het gedeelte van de hersenen voor zelfs kleuring elke 5 min.
   Opmerking: Na 20 min moet de sectie kersenrood aan beide zijden. Extra tijd kan nodig zijn op basis van TTC versheid en dikte van weefselsectie.
2. Verwijder de TTC-oplossing en vervang het met 4% paraformaldehyde in PBS, pH 7.4 voor het optimaliseren van het kleurcontrast.
3. Wanneer het contrast tussen de witte en rode kleuring is optimaal, TTC hersenen segmenten tussen doorzichtige plastic bladen, droge van overtollige vocht, en scannen in hoge resolutie voor tracering van ischemische regio's plaats.
   Opmerking: Secties kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd in paraformaldehyde oplossing, maar vlekken zullen vervagen.

Representative Results

De gedetailleerde procedures hierin zal resulteren in de ontwikkeling van een model dat kan worden gebruikt voor profylactische of thrombolytic beoordelingvan occlusieve arteriële interventies. Figuur 1A blijkt stroomsnelheid van de basislijn en de resulterende stroomsnelheid van bloed vóór, tijdens en na de behandeling opgenomen door een commerciële software. Gegevens uit deze opname kan worden gebruikt om te bepalen van het percentage van opnieuw perfusie met halsslagader letsel en behandeling in dit honden model. Figuur 1B wordt een voorbeeld gegeven van zowel de contralaterale (boven) en geblesseerde (onder) Honds carotis secties gekleurd met H & E dat wordt gecontroleerd of de status van de opnieuw kanalisering ten tijde van het offer. Een veelheid van software programma's zijn beschikbaar voor het analyseren van de perfused gebied van het schip door het traceren van het bloedvat (zonder trombose) die kan worden gedeeld door de totale oppervlakte van het schip om te komen tot een percentage van kanalisering met elke behandeling. Figuur 2 toont verschillende voorbeelden van halsslagader angiografie gedetailleerde in deze canine imaging protocol dat kan worden gebruikt om te bepalen of de trombose occlusieve. Bovendien, kunnen met de vierkante stroom sonde als merkstof, onderzoekers bepalen de lengte van de trombose op elk punt van de tijd die de angiogram is genomen. Hoewel, hier hebben wij gepresenteerd beelden voordat schade, 60 min na behandeling van het voertuig, en op het moment van opoffering, kan de onderzoeker imaging op hun behoeften afstemmen. Figuur 3 is het resultaat van de magnetische imaging parameters toegepast op de canine hersenen ~ 4 uur na occlusie van de halsslagader onmiddellijk voordat offer, met behulp van zowel diffusie gewogen (Figuur 3 bis) en T2 gewogen beeldvorming (figuur 3B) beschreven in sectie 4 van dit protocol. Hoewel we alleen een foto van de hele array genomen op verschillende niveaus in de hersenen, de grootte van zowel bloeding en beroerte volume geïdentificeerd in verschillende niveaus en gebieden van de hersenen en quantitated op elk punt van de tijd door de onderzoeker gewenst. Kwantificatie is voltooid met behulp van de specifieke MRI machine software specifiek voor de onderzoeker de imager. De TTC kleuring resultaten zoals weergegeven in Figuur 3 c kan worden gebruikt om af te bakenen hersenweefsel waar de cellen nog steeds metabolisch actief naast die niet zijn. TTC zal enzymatisch worden verlaagd om te resulteren in rood gekleurd levende cellen overwegende dat dode cellen niet de TTC behouden zal en dus niet zal rood. Tot slot, de haematoxyline en eosine-kleuring techniek aangetoond in canine hersenen in figuur 3D zal resulteren in de vlekken van rode bloedcellen knalrood die kan worden gebruikt om te controleren of de gebieden waar de bloeding is opgetreden.

Figuur 1: Monitoring van de carotis bloedstroom. (A) representatieve halsslagader bloed snelheid (mL/min) die vanuit de Doppler sonde van basislijn voor letsel door offer. (B) vertegenwoordiger H & E kleuring van beide geroteerd halsslagader (onder) en contralaterale controle (boven). Vergroting is op 20 X. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: controle van de carotis bloedstroom door angiografie. Representatieve angiografie weergave van rechts canine halsslagader. Beelden werden genomen op basislijn voor voertuig infusie (A), 60 min na voertuig infusie (B), en op moment van opoffering, 4.5 h na occlusie (C). Rode pijlen geven de locatie op het schip van de FeCl₃-veroorzaakte schade waar de navelstreng tape werd geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: representatieve beelden van canine hersenen na voertuig behandeling. Magnetic Resonance Imaging (MRI) uitgevoerd ~ 4 h na occlusie, onmiddellijk voordat offer, gebruik makend van diffusie gewogen beeldvorming (DWI, (A) en T2 gewogen beeldvorming (B). TTC-verkleuring van de mediale sectie op het moment van offer af te bakenen leven van dood weefsel (C). H & E kleuring van medial afdeling, onmiddellijk proximale TTC sectie, ten tijde van offer af te bakenen weefsel dat zijn metabolisch actief (rood) van die niet TTC is teruggebracht tot een rode product te gebruiken wanneer in beslag genomen door levende cellen en daarom zal resulteren in secties die kunnen worden gekwantificeerd met een veelheid van software te traceren leven vs dode regio's. (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Experimentele Parameter	T2-gewogen	Diffusie gewogen
Herhaling tijd (TR) ms	4000	4600
ECHO tijd (TS) ms	75	86
Hoek, graden Flip	180	90
Overname matrix	320 x 256	231 x 257
Aantal gemiddelden	2	4
In de resolutie van de afbeelding van de vliegtuig (pixels/mm)	2.4615	0.9333

Tabel 1: magnetische resonantie Imaging (MRI) parameters. MRI-parameters die zijn ontwikkeld voor honden T2 - en diffusie-gewogen beelden om te maximaliseren voor beoordeling van streek- en bloeding volumemeting in canine halsslagader trombose model.

Discussion

Het FeCl₃ geïnduceerde vasculaire verwonding model wordt veel gebruikt om te studeren van trombose bij kleine dieren en is gemakkelijk te vertalen in een groot dier, pre-klinische model met een veelheid aan voordelen. Kleine aanpassingen aan de aanpassing van het protocol in een Honds toestaan van het gebruik van zowel magnetische resonantie beeldvorming te beoordelen beroerte en bloeding volumes na een farmacologische interventies en angiografie te beoordelen vaartuig kanalisering vóór, tijdens, en na de behandeling. Andere trombotische grote diermodellen niet gestabiliseerde occlusieve stolseltjes op de site van letsel hebben bestudeerd en dus niet kunnen gebruiken angiografie en histologie van de halsslagader te beoordelen in hoeverre van opnieuw kanalisering voor elke profylactische of thrombolytic behandeling. Naast de voordelen van een groot dier waaronder ruime weefsel p.a. (plasma, urine, organen voor toxiciteitsstudies, enz.), bootst de grote diermodel veel nauwer de hartslag, bloeddruk en stolling trapsgewijs bij de mens dan knaagdieren modellen. Voldoende grootte van de hersenen en de halsslagader slagaders, resulteren in histologische en biologische materialen die kan worden gebruikt voor een overvloed van inflammatoire en biochemische onderzoeken op elke proefdieren. Een ander voordeel van het wijzigen van de FeCl₃-geïnduceerde vasculaire model in een Honds is dat een veel groter volume van het bloed kan worden geëxtraheerd tijdens het experiment zonder het wijzigen van bloedplaatjes reactiviteit of trombose vorming dergelijke die blood gas en volledige bloed graven kunnen worden gecontroleerd in de schade en drug infusie. Bovendien, wordt de ferrichloride schade toegeschreven aan de oxidant schade; Daarom zal het atherosclerotische schade die voorafgaat aan de klinische beroerte en een hartinfarct veel sterker dan de andere soorten gepubliceerd arteriële letsel modellen⁷nabootsen. Tot slot, mechanische ingrepen zoals thrombectomy, die routinematig klinisch gebruikt worden, farmacologische behandeling kunnen volgen zodat re-stenose en de status van het endotheel muur gezondheid kunnen worden aangepakt met ruime histologische weefsel voor meerdere onderzoek naar de dezelfde canine.

Beperkingen van dit model zijn weinig maar moeten worden overwogen. Eerste, hoewel de tijdstip, en de behandeling gekozen in deze publicatie (4.5 h na halsslagader letsel, offeren voertuig) niet leiden tot een meetbare beroerte of bloeding, deze methode is klinisch relevant is voor het onderzoek van roman anti-trombotische en thrombolytic agenten werkzaamheid en dosering te bepalen. Inderdaad, zowel lijn en/of bloeding met de aanvankelijke trombotische beledigen of met farmacologische behandeling (bijvoorbeeld rTPA) komen met dit model. Ten tweede, canine kosten voor aankoop, scheepvaart, genetische manipulatie en per diem zijn vrij hoog en kosten onbetaalbaar totdat een drug goed gekarakteriseerd in knaagdier modellen is.

Kritische stappen in het midden van het protocol op activering van de bloedplaatjes, aggregatie en adhesie, de kern van trombose. Aangezien de bloedplaatjes functie Analyzer (PFA-100) kan worden uitgevoerd met 1600 µL van volbloed in tweevoud, is deze methode eenvoudig en gemakkelijk te volgen van bloedplaatjes reactiviteit gedurende de hele procedure zonder bloed homeostase. Verdere ex vivo studies in bloedplaatjes activiteit met behulp van impedantie of lumi-aggregometry kunnen worden uitgevoerd voordat de vasculaire verwonding zonder experimentele trombose, zolang de laatste bloed trekken is > 1 week voor de operatie in aanvulling op na blessure en de behandeling op tijd van offer. Zoals eerder besproken, extra toepassingen van navelstreng tape gedrenkt in 50% FeCl₃ eventueel afhankelijk van geslacht, ras of leeftijd van elke canine. Wij mogen 30 minuten na blessure voor occlusie en opnieuw toegepast verse 50% FeCl₃ voor een ander 15 min indien nodig. Dit proces niet leiden tot een significant verschil in thrombolytic afwijking met leeftijd of geslacht met behulp van volwassen beagles. In dit onderzoek hebben we de verspreiding van het kritische en state-of-the-art gewogen beeldvorming (DWI), een heer imaging gebaseerd op de meting van de Brownse beweging (willekeurige verspreiding van deeltjes) van watermoleculen binnen de weefsel voxel toegelicht. Deze techniek is handig in de opsporing van acute ischemische beroerte onder andere pathologieën zoals tumoren door diffusie tonen in hyper-cellulaire weefsels of degenen met cellulaire zwelling is laag met hogere diffusie coëfficiënt^{17,18 ,19}. Diffusie kaarten variëren met de verspreiding van de watermoleculen in de hersenen weefsel^17,18,19. De B-waarde meet de kleurovergang voor de verspreiding van H₂O moleculen. Op de site van ischemische schade ervaart het vrije water sterkste signaal demping op hogere B-waarden¹⁹.

Naast het gebruik van deze honden protocol voor studies in de toediening, toxiciteit en werkzaamheid van profylactische en thrombolytic agenten maakt de grootte van een Honds experimenten in mechanische thrombectomy klinisch relevante en gemakkelijk haalbaar. Carotids kan gemakkelijk worden verwerkt, gekleurd, en geëvalueerd met behulp van protocollen voor menselijke histologie voor studie van immuun cel infiltratie na clot ophalen. Deze studies zullen onze volgende gedetailleerde protocollen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/8” umbilical tape	Jorgensen Laboratories Inc.,	#J0025UA	for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin	Richard-Allan Scientific	5701
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
ADP/Collagen cartridges	Siemens Diagnostics	B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer	Becton Dickinson	BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer	Becton Dickinson	BD 368056
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Doppler flow probe	Transonic Systems Inc	MA2.5PSL
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
Eosin	Surgipath	3801602
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320