Summary
Nous présentons ici les modifications nécessaires pour un bien caractérisé et couramment utilisé petit induite par le chlorure ferrique (FeCl3) artère carotide blessure modèle animal pour une utilisation dans un modèle de grandes lésions vasculaires chez les animaux. Le modèle résultant peut être utilisé pour une évaluation du procès préclinique d’interventions pharmacologiques et mécaniques, prophylactiques et thrombolytiques.
Abstract
La thrombose artérielle occlusive menant à l’accident vasculaire cérébral ischémique cérébral et d’infarctus du myocarde contribue à 13 millions de décès chaque année dans le monde. Ici, nous avons traduit un modèle de lésion vasculaire d’un petit animal en un grand animal (canine), avec de légères modifications qui peuvent être utilisées pour le dépistage pré-clinique des agents prophylactiques et thrombolytiques. Outre les méthodes chirurgicales, mis à jour le protocole décrit les méthodes pas à pas pour évaluer la canalisation de l’artère carotide en angiographie, des instructions détaillées pour traiter le cerveau et l’artère carotide pour analyse histologique vérifier la carotide canalisation et une hémorragie cérébrale et les paramètres spécifiques à effectuer une évaluation des événements thrombo-emboliques en aval en utilisant la résonance magnétique imagerie (IRM). En outre, des changements de procédure spécifiques du modèle animal petit déjà bien établi nécessaire pour traduire une lésion vasculaire gros animal (canine) sont discutées.
Introduction
Traitement des accidents vasculaires cérébraux s’inspire en grande partie traitement de la maladie coronarienne, principalement parce que les interventions dans les maladies cardiovasculaires ont bien répondu aux drogues thérapie et endovasculaires interventions1. Ces traitements, cependant, n’ont pas correctement traduits d’infarctus cérébral. Les difficultés avec le traitement actuel de la course ne sont que la recombinaison activateur tissulaire du plasminogène (rTPA) ne peut pas être inversée, et qu’administration comporte un risque important de 6,4 % de conversion hémorragique2,3, 4. la mortalité et la morbidité qui limite son utilisation à une petite fenêtre souvent inaccessible5. Aussi, la resténose et occlusion se produisent souvent après thrombolyse initiale, inversant amélioration neurologique initiale. En résumé, il y a une étroite fenêtre temporelle pour administrer le rTPA qui exclut la grande majorité (environ 90 %) des patients qui souffrent des insultes cérébro-vasculaires ischémiques.
Le rôle du traitement antiplaquettaire intraveineuse s’est montré prometteur dans le traitement de l’AVC ischémique avec reperméabilisation du vaisseau améliorée, la survie et résultat2. Malheureusement, ces médicaments ont un effet secondaire prévisible d’hémorragie intracrânienne et extracrânienne, en grande partie car il n’existe aucun moyen de bien inverser ou contrôler leur activité2. Bien qu’efficace en empêchant l’agrégation des plaquettes, le risque d’hémorragie et de l’incapacité d’inverser leur activité ont empêché leur utilisation dans la routine de soins des patients d’AVC. Il est donc nécessaire, pour des médicaments antithrombotiques puissants qui agissent seuls ou en combinaison, pour prévenir et lyser les caillots tout en ayant un profil d’innocuité qui permettra l’utilisation dans un espace fermé, faible volume, comme le cerveau, où l’hémorragie est mal tolérée.
Comprendre le mécanisme de la thrombose artérielle et de la resténose et l’évaluation de thrombolytiques et médicaments qui préviennent la resténose, requiert des modèles animaux petits et grands dans le cadre du développement du médicament préclinique. Lésion vasculaire induite par le chlorure ferrique est une technique largement utilisée pour la rapidité et de précision induisent la formation de caillots dans les vaisseaux sanguins exposés des souris, rats, cobayes et lapins6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. ces petites espèces offrent plusieurs avantages dont la facilité de manipulation génétique, achat animaux peu coûteux et faible coûts de logement par jour. Malheureusement, l’expérimentation animale petite nie plusieurs tirages de sang pendant la chirurgie pour la réactivité des plaquettes sanguines accès, analyse des gaz sanguins et la réponse inflammatoire. Plus important encore, les grands animaux imitent beaucoup plus étroitement plaquettes humaines physiologie6,13. Le modèle de blessure de l’artère carotide FeCl3 a joué un rôle prédominant dans l’étude de la physiopathologie de la thrombose, la validation des nouveaux médicaments antiplaquettaires et les anticoagulants et à la découverte de potentiels agents thrombolytiques6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. précédent modèles chez les souris, rats, cobayes, lapins ont fourni la facilité et la flexibilité de la manipulation génétique, et traduisibles modèles précliniques sont essentiels pour les études de dosage et de la toxicité des agents thérapeutiques potentiels6 ,,13. Bien que plusieurs modèles de maladies thrombotiques ont été développés chez les souris, grands modèles animaux de la thrombose qui se rapportent à la maladie vasculaire périphérique, accident vasculaire cérébral et infarctus du myocarde sont rares et de loin. Les premiers modèles de thrombose dans les singes, les chiens et les porcs ont porté sur la sténose, appliquant une pince hémostatique et cylindres plus tard aux bâtiments, entraînant généralement flux cyclique des réductions14,15,16. Au lieu d’un thrombus occlusif sur le site de la lésions endothéliales comme dans le modèle de chlorure ferrique, le thrombus dans ces modèles a donné lieu à des thromboses cycliques, embolisation distale et revenir à la circulation sanguine normale. En comparaison, le modèle de chlorure ferrique modifié ici dans un grand animal, traduit par un thrombus occlusif sur le site de la lésion et est stabilisé et vérifié par angiographie avant un traitement thrombolytique. Sous réserve que l’enquêteur a un grand fonds pour par diem et achat de canines et de l’expertise chirurgicale adéquate, nous détaillons ici un grand modèle canin de lésion vasculaire pour permettre des laboratoires étudier la thrombose utilisant chirurgicaux, d’imagerie et histologiques techniques.
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Protocol
Les enquêtes décrites sont conformes aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et ont été approuvées par l’Ohio State University institutionnels animalier et Comité de l’urbanisme (#2015A00000029). Toutes les manipulations chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie profonde et les animaux ne souffriraient pas de douleur à tout moment au cours de la procédure. Toutes les expériences décrites ont été de non-recouvrement.
1. préparation
- Fraîchement préparation de 50 mL de chlorure ferrique (FeCl3) à 50 % (p/v) dilué dans l’eau désionisée.
- Couper la bande ombilicale en 5,5 cm et tremper dans la solution fraîchement préparée de la3 du FeCl 50 % 1 semaine avant l’intervention.
Remarque : La bande ombilicale utilisée est épaisse et prend un certain temps pour absorber la FeCl3 solution à 50 %. - Rapide de chaque canine pendant la nuit avant l’opération.
- Étiquette cryovials pour la collecte de plasma et l’urine, les tubes de centrifugeuse stérile de 50 mL pour tout stockage de l’orgue et des conteneurs de 10 % de formol pour fixation de cerveau et de la carotide pour une coloration H & E avec identification de l’animal, date de naissance, date de la chirurgie et le traitement.
- Préparer 100 mL de chaque solution pour chaque intervention canine : formol paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4), 10 % neutre mis en mémoire tampon et 2 % de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium [TTC dans du PBS (pH 7,4), stocker dans l’obscurité].
- Acquérir un grand azote liquide pour tous les cryovials et tubes de tissus de 50 mL pour flash gel pour le jour de l’intervention.
- Acquisition de deux cartouches de ADP/collagène pour la réactivité des plaquettes sanguines PFA-100 (analyseur de la fonction plaquettaire) pour chaque canine pour chaque point d’intérêt dans le temps.
- Acquérir un 4,5 mL de citrate de sodium tube de prélèvement, pour chaque tirage de sang avant le sacrifice, pour la séparation du plasma et de stockage. Au moment du sacrifice, dessiner 16 tubes de prélèvement sanguin pour le stockage de plasma. Après chaque tube de prélèvement de sang est plein, essorage à 4 000 x g pendant 30 s pour isoler le plasma riche en plaquettes et transfert clair couche en cryovials. Flash congélation dans l’azote liquide avant leur stockage à-80 ° C.
- Acquérir un 4,5 mL au lithium héparine tube de prélèvement, pour chaque point de temps de PFA-100 d’intérêt pour la réactivité des plaquettes sanguines record. À chaque tirage de sang, introduire 800 µL de sang d’un tubes de prélèvement de sang héparine lithium dans chaque cartouche ADP/collagène sans bulles d’air à suivre la réactivité des plaquettes sanguines.
- Acquérir les deux tubes de prélèvement sanguin EDTA K3 (1,8 mg d’EDTA anhydre par 1 mL de sang), pour la numération formule sanguine (CBC) au départ et au moment du sacrifice.
Remarque : Ce volume est suffisant pour la plupart des installations centrales d’exécuter chacun deux fois dans le cas d’une erreur mécanique. Bien qu’un Hémogramme a été exécuté à deux le départ avant la blessure et au moment du sacrifice, enquêteurs peuvent ajouter que plus de sang dessine telle qu’approuvée dans leurs protocoles animales pour des analyses supplémentaires. Vérifiez auprès de l’établissement concernant les volumes et les conditions de livraison pour leurs équipements. - Préparez une seringue de 2 mL héparinée en remplissant et en enduisant la seringue du jour de la procédure d’analyse des gaz sanguins au moment du sacrifice.
Remarque : Vérifiez auprès de l’établissement quant à des volumes et des conditions de livraison pour leurs équipements.
2. Occlusion de l’artère carotide canine
- Peser un adulte (> 18 mois) chien beagle et pré médicamenter avec acepromazine intramusculaire (0,025-.2 mg/kg) suivie d’une injection intrapéritonéale initiale de kétamine (5-20 mg/kg) et de midazolam (0,01-.25 mg/kg). Induire une anesthésie plus profonde à l’isoflurane 1 à 5 %, basée sur le rythme cardiaque, respiration et le ton de la mâchoire.
NOTE : Anesthésie exacte est dicté par le poids et le protocole animal approuvé. Bien que les injections peuvent entraîner des douleurs pour les animaux, la durée de cet inconfort seront minime (moins de 3 s). - Avant de prendre l’animal à la table de chirurgie, enlever les poils en coupure. Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux de l’animal anesthésié à prévenir le dessèchement de la lubrification.
- Placez l’animal en décubitus dorsal à l’aide d’un système de positionnement et attachez l’électrocardiographie (ECG) conduit à pied tampons. Intuber à travers la trachée d’un tube endotrachéal 6,5 mm à revers, mécaniquement ventiler à 14 respirations/min et maintenir chaque chien avec une inhalation continue de 1-5 % isoflurane (selon le protocole animal approuvé).
- Pour déterminer l’étendue de la canalisation de la carotide et la longueur de la thrombus occlusif, effectuez angiographie avant la blessure, avant de MRI et au moment du sacrifice (voir ci-dessous pour obtenir des instructions supplémentaires).
- Insérer une gaine artérielle fémorale et un cathéter en plastique et fixez avec une suture 0-soie lâche. Fermer temporairement la gaine et le cathéter pendant le transport et les études d’imagerie. Voir canine angiographie ci-dessous pour obtenir des instructions supplémentaires).
- Pour les tirages de sang, insérer un cathéter intraveineux 16 x 45 mm par la peau intacte distal par rapport à la gaine artérielle fémorale coupée du site. Avancez la sonde dans l’exposition chirurgicale et le visualiser alors qu’il entame la veine fémorale commune exposée juste à côté de la gaine artérielle. Une fois pleinement insérée dans la veine, retirer l’aiguille, cap le cathéter avec un robinet à 3 voies et rincez-la avec 2 mL de sérum physiologique 0,9 %. Fixer le cathéter à la peau avec une suture 0-soie.
- Faire une incision de 8 à 10 cm de la peau directement sur le dessus de la région de l’artère carotide commune droite et disséquer le fascia pour isoler le navire du tissu environnant.
- Introduire prudemment pince entre l’artère carotide et le nerf de vagus pour séparer. Évitez de toucher l’artère carotide plus que nécessaire car elle peut causer la constriction du navire.
- Sécher la surface exposée de l’artère avec la gaze stérile pour éviter la FeCl3 solution dilution.
- Place du Doppler coulent sonde autour de la carotide permettant l’espace amble à enrouler la bande ombilicale autour de la carotide sans toucher à la sonde de débit et de commencer l’enregistrement de la vitesse du sang et continuer tout au long de la procédure (Figure 1 en haut). Enregistrer le flux de référence pour ~ 5 min avant d’appliquer la bande ombilicale.
NOTE : Débit de base avant le placement de FeCl3 bande ombilicale habituellement en moyenne environ 250 mL/min. - Enroulez la bande ombilicale préparée FeCl3 autour de la carotide à l’aide d’une pince hémostatique immédiatement au-dessous de la sonde de débit sans le toucher pendant 15 minutes, retirer et jeter.
Remarque : L’Occlusion est désignée comme zéro débit mL/min. - Stabiliser le thrombus occlusif pour 45 min. Ajouter physiologique supplémentaire pour la sonde au besoin pour maintenir un signal.
Remarque : Selon l’âge, sexe et le type de placements canines, d’autres de la bande ombilicale de prêt FeCl3 peuvent être nécessaires pour permettre à 30 min pour l’occlusion se produise avant réapplication. Aucune différences ont été observées dans la thrombose par application de chlorure ferrique avec des sexes chez le Beagle. On n’a pas jugé nécessaire avec ce modèle pour réappliquer une bande ombilicale de frais FeCl3 plus d’une fois et n’ont jamais dévié de la protocole de préparation de FeCl3 bande ombilicale. Si le laboratoire utilise une race différente ou âge de la canine, la FeCl3 bande ombilicale doit être appliqué aux sujets initiales pour s’assurer que le protocole de thrombose ne s’écarte pas, ou un groupe des canines peut être nécessaire d’établir le FeCl3 temps d’application pour cette race ou l’âge dans leur étude spécifique. Les temps d’occlusion, dans cette expérience, allant de 8 à 30 min après l’application de FeCl3 bande ombilicale. - Pour déterminer le volume d’accident vasculaire cérébral ou une hémorragie en plus des événements thrombo-emboliques en aval pouvant résulter d’interventions pharmacologiques, canines avec injection de kétamine supplémentaires à une machine d’imagerie par résonance magnétique (voir ci-dessous pour le transport traitement supplémentaire).
- Tandis que toujours sous un avion chirurgical profondes de l’anesthésie d’une finale angiographie/IRM (voir ci-dessous pour le protocole d’imagerie), indiquée par une absence de réponse à des stimuli nociceptifs, recueillir le sang total désiré pour une analyse ultérieure, puis ouvrir le coffre en sectionnant les côtes à partir du sternum et accises au cœur en coupant les vaisseaux sanguins (exsanguination).
Remarque : Dans cette expérience, tout sang (< 10 mL) a été dessiné au départ, 5 min après l’administration de l’agent et 60 min après la perfusion de la gaine fémorale et ne vu aucun effet sur le processus de la thrombolyse. Au moment du sacrifice, un volume illimité peut être tiré pour le stockage de plasma supplémentaire si elle est approuvée dans le protocole de l’animal. Analyser, traiter et stocker le sang toutes les 30 min de sacrifice. Veiller à ce que le sang n’est pas tiré excédant le pourcentage approuvé du poids corporel de l’animal comme il est indiqué sur le protocole animal approuvé. Toutes les expériences décrites ont été de non-recouvrement. - Rincer le cœur avec la solution saline à 0,9 % et flash congeler les échantillons dans l’azote liquide si vous le souhaitez.
- Avant d’enlever les carotides, mesurez la longueur de caillot en plaçant une règle à côté d’elle et enregistrement. Placer le marqueur de tissus sur le milieu du caillot et au même endroit sur la carotide controlatérale pour faciliter la coupe de l’histologie. Marquer la carotide controlatérale à la même longueur.
Remarque : La longueur moyenne de caillot avec ce modèle est de 1,75 cm. - Retirer toute la longueur du caillot sur les deux navires et fixer à 10 % de formol. Retirez la carotide controlatérale au sein de la longueur, marquée par le marqueur de tissus. Couper la carotide controlatérale en deux au milieu du caillot. Flash congeler la moitié la carotide controlatérale dans l’azote liquide pour une analyse ultérieure et fixez l’autre moitié dans du formol 10 % à incorporer à côté de la carotide blessée pour analyse histologique ci-dessous.
- Prélever des organes de toute analyse souhaitée, rincer avec la solution saline à 0,9 % et flash congélation dans l’azote liquide.
- Retirez le crâne avec une scie à OS circulaire. Retirer lentement le crâne sans endommager le cerveau sous.
- Après que le cerveau est séparée du crâne, rincez-la à froid solution saline à 0,9 % et deux coupes de 4 mm au milieu du cerveau, découpe latéralement avec un scalpel tranchant. Placer une des sections 4 mm à 2 % TTC pour démarcation ischémique (voir traitement supplémentaire pour cerveau TTC), tandis que l’autre tranche placés dans du formol 10 % pendant 7 jours pour la coloration H & E (voir le traitement supplémentaire pour cerveau H & E).
3. canine angiographie
NOTE : Ceci est illustré à la Figure 2 et se fait au cours de la chirurgie à des points d’intérêt.
- Sentir pour une impulsion dans la région inguinale droite et faire une incision sagittale ventrale de 3 à 5 cm.
- Exposer l’artère fémorale et détacher les tissus environnants par dissection.
- Utilisez une pince hémostatique à angle droit pour placer une suture 0-soie autour de l’extrémité distale de l’artère exposée.
- Attachez la suture distale de 0-soie et tendez légèrement l’artère en pinçant les extrémités lâches 0-soie suture de la peau avec une pince hémostatique.
- Placer une seconde suture 0-soie autour de l’extrémité proximale du segment exposée.
- Ponction de l’artère à mi-chemin entre les traverses de suture 0-soie proximal et distal à l’aide d’une aiguille 18G de l’introducteur de passer un fil de guidage dans l’artère.
- Charger une gaine 6Fr assemblé et sur le fil-guide, saisir le fil de sa sortie de l’assembly.
- Faire progresser le dilatateur et la gaine sur le guide métallique. Veillez à maintenir une solide compréhension du fil car il dépasse le dilatateur tout en faisant progresser la gaine du dilatateur.
- Après insertion complète, attacher la suture proximale de 0-soie autour de la gaine pour maintenir l’hémostase du site de ponction artérielle.
- En même temps supprimer le dilatateur et le fil de guidage.
- Ouvrir la valve à sens unique pour vérifier la présence du débit sanguin pulsatile et rincer avec 3 à 5 mL de sérum physiologique.
- Connecter la valve unidirectionnelle de gaine de l’accès à un fluide rempli extension ligne attachée à un transducteur de pression pour surveiller et enregistrer les mesures de la pression sanguine.
- Précharger un fil-guide 0,35" dans un cathéter 4Fr. angiographique et se connecter à la tubulure d’injection de contraste sertie d’un adaptateur en y Tuohy.
- Tirez sur l’extrémité du fil-guide à l’intérieur de l’extrémité distale du cathéter et rincer la totalité de l’assembly avec une solution saline.
- Insérer le cathéter angiographique dans la valve hémostatique de la gaine et ensuite faire avancer le fil-guide environ 5 cm au-delà de l’extrémité du cathéter distal.
- Sous guidage radioscopique et en utilisant une approche trans-aortique rétrograde, faire progresser lentement le cathéter dans la crosse aortique.
- Injecter 2 ou 3 mL de contraste agent dilué 1:1 avec un soluté physiologique pour identifier le décollage du tronc brachiocéphalique.
- Utiliser le fil-guide pour diriger le cathéter dans le tronc brachiocéphalique, puis de manière sélective dans l’artère carotide commune droite.
- Retirer le fil-guide et injecter 2 ou 3 mL de contraste dilué pour vérifier que le cathéter est placé dans la carotide.
- Injecter 3 à 4 mL de contraste non dilué lors de l’enregistrement de pistes angiographiques aide soustraction numérique et techniques angiographiques standard.
- Répétez les étapes 3.18-3.21 pour l’angiographie répétée à des points supplémentaires.
4. résonance magnétique - Diffusion pondérée Imaging (DWI) et T2 pondéré d’imagerie du cerveau canine (T2WI)
NOTE : Ceci est illustré dans la Figure 3 a-3 b.
- Veiller à ce que le chien est sous anesthésie profonde.
- S’assurer que les paramètres physiologiques du chien sont suivies tout au long de l’imagerie, y compris l’ECG et la fréquence cardiaque.
- Veiller à ce que le chien est couché en décubitus dorsal avec la tête dans les ouvertures bilatérales de la bobine du cerveau.
- Activez l’aimant 3 Tesla (3 t).
- Effectuer l’imagerie T2 pondéré (T2WI), une séquences d’impulsions fondamentales dans l’IRM.
Remarque : La séquence utilise les différences dans le temps de relaxation T2 de tissus à différents états pathologiques. - Effectuer le Localisateur d’imagerie pour acquérir des images d’un cerveau de chien avant l’imagerie anatomique moyen d’écho de gradient pondérées en T2 imagerie séquence pilotes et déterminer le champ de vision (FOV), nombre de tranches et l’épaisseur de la tranche pour couvrir complètement le cerveau.
- Utilisez les paramètres suivants de T2 : découper l’épaisseur = 3 mm, TR = 4 000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, matrice d’acquisition = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixels, résolution de l’image = 2,4615 pixels par mm.
- Effectuer l’imagerie de diffusion pondérée (DWI) à l’aide d’echo raboteuse DTI séquence 4 h après l’occlusion de MCA et immédiatement avant le sacrifice.
- Utilisez les paramètres suivants de DWI : b = 1 500 s/mm2, tranche épaisseur = 3 mm, TR = 4 600 ms, ET = ms 86, ETL = 55, matrice de l’acquisition = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, résolution de l’image = 0.9333 pixels/mm (tableau 1).
5. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration du cerveau canin
Remarque : Cela est montré dans la Figure 3D.
- Après 7 jours à 10 % de formol, intégrer les sections de cerveau de 4 mm à la paraffine.
- Tailler les blocs de paraffine jusqu'à ce qu’ils sont de niveau avec un microtome, enlever toute paraffine supplémentaire du haut du tissu cérébral, puis couper le tissu cérébral à 4 µm et placer une section de cerveau sur chaque diapositive 2 "x 3" pouces.
Remarque : Avant la coloration, placer toutes les solutions dans des conteneurs séparés afin que les diapositives peuvent être déplacés d’une solution à l’autre sans dessécher. - Paraffinize de chaque diapositive de cerveau et hydrater avec l’eau du robinet.
- Placez chaque cerveau en 560 hématoxyline pendant 8 min.
- Rincer chaque lame de cerveau dans l’eau du robinet.
- Différencier chaque diapositive de cerveau avec 1 % d’acide alcool pour 1 s trois fois.
- Rincer chaque lame de cerveau dans l’eau du robinet.
- Bleu de chaque diapositives de cerveau avec 1 % d’hydroxyde d’ammonium pour 1 s.
- Rincer chaque lame de cerveau dans l’eau courante pendant 2 min.
- Déshydrater à chaque diapositive de cerveau de 70 % éthanol (EtOH) pour 1 s douze fois.
- Contre-coloration chaque diapositive de cerveau d’éosine pendant 1 min.
- Déshydrater à chaque diapositive de cerveau de 95 % EtOH pour 1 s douze fois.
- Déshydrater à chaque diapositive de cerveau de 100 % EtOH.
- Effacer chaque diapositive de cerveau de xylène et appliquez ensuite une lamelle de 2 "x 3" de pouce sur le dessus de la diapositive de cerveau, enlever les bulles d’air avec supports de montage résineuse.
Remarque : Toutes les solutions sont réutilisées sauf l’eau et l’éthanol pour plusieurs jours de coloration et de plusieurs diapositives. Tous les traitements après que sections du cerveau sont placées sur des lames sont faites en verre, bocaux de coloration, mais les contenants en plastique de coloration sont également disponibles dans le commerce. Remplacer toute solution quand il devient décoloré et gardez-les bien couverts.
6. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration des carotides canines
Remarque : Cela est montré dans la Figure 1 (gauche).
- Après 24 à 72 heures dans 10 % de formol, couper la carotide blessée en deux au milieu du caillot et embed ~ 1 cm de la carotide blessé et ~ 1 cm du contrôle controlatéral dans la même cassette de paraffine.
Remarque : Le caillot de sang à l’intérieur de la carotide est fragile. Attendez que le navire a été fixé à 10 % de formol avant des couper afin que le caillot n’est pas perturbé. Incorporer les deux blessés et contrôler les artères carotides dans la paraffine même bloc permettra coupe en même temps au même endroit dans le vaisseau sanguin. - Découper des blocs de paraffine jusqu’au niveau avec un microtome, supprimant toute paraffine supplémentaire. Puis coupez la section à 4 µm à 25 mm x 75 mm x 1 mm encadrés sans faire pivoter le bloc de paraffine pour que les sections carotides controlatérales sont placées en haut de la glissoire.
NOTE : Trois sections carotides ont été placées sur chaque diapositive, mais on peut ajouter selon les taches d’intérêt. - Paraffinize de chaque diapositive carotide et hydrater dans l’eau du robinet.
NOTE : Contrairement à la diapositive de cerveau qui doit être traitée individuellement, carotides diapositives peuvent être traitées en vrac en plaçant dans des bocaux qui fit plusieurs diapositives à la fois sans toucher les uns les autres. - Tache de chaque diapositive carotide de l’hématoxyline pendant 8 min.
- Rincer chaque lame carotide dans l’eau du robinet.
- Différencier chaque diapositive carotide avec 1 % d’acide alcool pour 1 s trois fois.
- Rincer chaque lame carotide dans l’eau du robinet.
- Bleu de chaque diapositive carotide avec 1 % d’hydroxyde d’ammonium pour 1 s.
- Rincer chaque diapositive carotide de l’eau courante pendant 2 min.
- Déshydrater chaque diapositive carotide chez 70 % EtOH pour 1 s douze fois.
- Contre-coloration chaque diapositive carotide d’éosine ou 1 min.
- Déshydrater chaque diapositive carotide chez 95 % EtOH pour 1 s x 12.
- Déshydrater chaque diapositive carotide chez 100 % EtOH.
- Désactivez chaque diapositive carotide de xylène, puis ajoutez un lamelle couvre-objet 24 x 50 mm avec support de montage résineuse pour enlever les bulles d’air.
7. 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium chlorure (CTT) coloration du cerveau canin
NOTE : Ceci est montré dans la Figure 3.
- Place de l’autre section de 4 mm préalablement retirée au milieu du cerveau immédiatement proximal à la section H & E en plats 2 % TTC (occlusion de l’artère carotide). Incuber à 37 ° C pendant au moins 20 min, la section de cerveau pour la même coloration toutes les 5 min en retournant dans l’obscurité.
Remarque : Après 20 min, la section doit être cerise rouge sur les deux côtés. Un délai supplémentaire peut être nécessaire, basée sur la fraîcheur de la TTC et l’épaisseur de la section de tissu. - Enlever la solution TTC et remplacez-le par paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, pH 7,4 pour optimiser le contraste des couleurs.
- Lorsque le contraste entre le blanc et rouge de coloration est optimal, placer les tranches de cerveau TTC entre des feuilles de plastique transparent, secs de l’excès de liquide et scan à haute résolution pour le traçage des régions ischémiques.
Remarque : Sections peuvent être stockées indéfiniment dans une solution de paraformaldéhyde, mais la coloration se fanera.
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Representative Results
Suivant les modalités ci-après se traduira par l’élaboration d’un modèle qui peut être utilisé pour une évaluation prophylactique ou thrombolytique des interventions artérielles occlusives. Figure 1 a montre la vitesse d’écoulement de base et la vitesse d’écoulement de sang qui en résulte avant, pendant et après le traitement par un logiciel commercial. Données de cet enregistrement peuvent servir à déterminer le pourcentage de re-perfusion avec lésion de l’artère carotide et traitement dans ce modèle canin. Figure 1 b donne un exemple des blessés (en bas) canine carotide sections colorées avec H & E qui vérifie l’état de la canalisation à l’heure du sacrifice et controlatérale (en haut). Il existe une multitude de programmes logiciels analyser la zone perfusée du navire en traçant le vaisseau sanguin (sans thrombus) qui peut être divisé par la superficie totale du navire pour en arriver à un pour cent de canalisation avec chaque traitement. La figure 2 montre plusieurs exemples de l’angiographie carotidienne détaillées dans cette canine d’imagerie protocole qui peut être utilisée pour déterminer si le thrombus est occlusif. En outre, à l’aide de la sonde de débit carrés comme marqueur, enquêteurs peuvent déterminer la longueur du thrombus à chaque instant que l’angiographie est prise. Même si, ici, nous avons présenté des images avant la blessure, 60 min après le traitement du véhicule et à l’heure du sacrifice, l’enquêteur peut adapter l’imagerie à leurs besoins. La figure 3 est le résultat des paramètres d’imagerie magnétiques appliqué au cerveau canin ~ 4 h après l’occlusion de l’artère carotide immédiatement avant le sacrifice, utilisant la diffusion pondérée (Figure 3 a) et T2 pondéré d’imagerie (Figure 3 b) décrites dans la section 4 du présent protocole. Bien que nous montrer une photo de l’ensemble du tableau pris à différents niveaux dans le cerveau, la taille du volume de l’hémorragie et d’AVC peut être identifiée dans les différents niveaux et des zones du cerveau et dosée à chaque point dans le temps désiré par le chercheur. Dosage est effectué en utilisant le logiciel de machine MRI spécifique propre à l’imageur de l’enquêteur. La TTC résultats de coloration, comme illustré à la Figure 3 peut être utilisée pour délimiter les tissus du cerveau dans lequel les cellules sont toujours métaboliquement actifs en plus de celles qui ne le sont pas. TTC sera enzymatiquement réduit pour aboutir à des cellules vivantes teintés rouges alors que les cellules mortes ne conservera pas la TTC et donc ne sera pas rouges. Enfin, l’hématoxyline et éosine coloration technique illustrée dans le cerveau canin en 3D de la Figure seront traduira par coloration des cellules rouges du sang rouge vif qui peut être utilisé pour vérifier les zones où l’hémorragie a eu lieu.
Figure 1 : surveillance du débit sanguin carotidien. (A) vitesse de sang artère carotide représentatif (mL/min) enregistré de l’effet Doppler sonde de départ avant la blessure par le sacrifice. (B) représentant H & E coloration des artères carotides occluses (fond) et controlatéral (en haut). L’agrandissement est à 20 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : surveillance du débit sanguin carotidien par angiographie. Vue d’angiographie représentatifs de l’artère carotide droite canine. Des images ont été prises au départ avant la perfusion de véhicule (A), 60 min après la perfusion de véhicule (B)et au moment du sacrifice, 4,5 h après l’occlusion (C). Les flèches rouges indiquent l’emplacement sur le navire de la FeCl3-induit des lésions où la bande ombilicale a été placée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : images représentatives du cerveau canine après traitement véhicule. Imagerie par résonance magnétique (IRM) effectué ~ 4 h après l’occlusion, immédiatement avant le sacrifice, en utilisant l’imagerie de diffusion pondérée (DWI, (A) et T2 pondéré imagerie b. TTC la coloration de la section médiane au moment du sacrifice afin de délimiter en direct de tissus morts (C). H & E coloration de medial section, immédiatement proximale à la section TTC, au moment du sacrifice afin de délimiter les tissus qui sont métaboliquement actif (rouge) de ceux qui ne sont pas TTC est réduite à un produit rouge lorsqu’il est absorbé par les cellules vivantes et par conséquent, se traduira par sections qui peuvent être quantifiées avec une multitude de logiciels à tracer direct régions morts vs. (D). s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Paramètre expérimental | Pondérées en T2 | Diffusion pondérée |
| Répétition (TR) de temps ms | 4000 | 4600 |
| Echo ms de temps (TS) | 75 | 86 |
| Retourner l’angle, en degrés | 180 | 90 |
| Matrice d’acquisition | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Nombre de moyennes | 2 | 4 |
| Dans la résolution de l’image plane (pixels/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tableau 1 : paramètres de l’imagerie à résonance magnétique (IRM). Paramètres de MRI qui ont été développés de canin-pondérée T2 et Diffusion d’images afin d’optimiser pour évaluation d’accident vasculaire cérébral et l’hémorragie de volumétrie dans modèle de thrombose artère carotide canine.
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Discussion
Le modèle de lésion vasculaire induite par FeCl3 est largement utilisé pour étudier la thrombose chez de petits animaux et est facile à traduire en un grand modèle animal, préclinique avec une multitude d’avantages. De légères modifications pour adapter le protocole en une canine permettent l’utilisation de ces deux IRM pour évaluer les volumes d’accident vasculaire cérébral et l’hémorragie après une intervention pharmacologique et une angiographie pour évaluer la canalisation du navire avant, pendant, et après le traitement. Autres grandes thrombotique des modèles animaux n’ont pas étudié des thrombi occlusifs stabilisés à l’endroit de la blessure et par conséquent ne peuvent pas utiliser l’angiographie et l’histologie de la carotide pour évaluer l’étendue de la nouvelle canalisation pour chaque prophylactique ou thrombolytiques traitement. En plus des avantages d’un grand animal qui comprennent un grand tissu pour analyse (plasma, urine, organes pour les études de toxicité, etc.), le grand modèle animal imite beaucoup plus étroitement la fréquence cardiaque, pression artérielle et cascade de la coagulation chez l’homme que les modèles de rongeurs. Taille adéquate des artères du cerveau et la carotide, résultat en matériel histologique et biologique qui peut être utilisé pour une multitude d’enquêtes inflammatoires et biochimiques sur chaque animal expérimental. Un autre avantage de la modification de la FeCl3-modèle de vasculaire induit dans une canine est qu’un beaucoup plus grand volume de sang peut être extraites au cours de l’expérience sans modifier les plaquettes réactivité ou thrombus formation tels que blood gas et le sang complet chefs d’accusation peuvent être surveillés tout au long de la perfusion de blessures et de la drogue. En outre, la blessure de chlorure ferrique a été attribuée aux dommages oxydants ; par conséquent, il imitera athéroscléreux dommages qui précède beaucoup plus étroite que les autres types de lésions artérielles modèles7a publié les clinique accident vasculaire cérébral et infarctus du myocarde. Enfin, les interventions mécaniques comme la thrombectomie, qui sont couramment utilisées en clinique, peuvent suivre traitement pharmacologique afin que la resténose et l’état de la santé de la paroi endothéliale peuvent être adressées avec ample tissus histologiques multiples enquêtes sur la canine de même.
Limites de ce modèle sont rares, mais il faut tenir compte. Tout d’abord, bien que le point dans le temps et le traitement choisi dans cette publication (sacrifier 4,5 h après une lésion de l’artère carotide, véhicule) n’a pas entraîné un accident vasculaire cérébral mesurable ou d’hémorragie, cette méthode est cliniquement pertinente pour l’étude du roman anti-thrombotiques et les agents thrombolytiques pour déterminer l’efficacité et dosage. En effet, les accidents vasculaires cérébraux et/ou hémorragie avec l’initiale thrombotique insulte ou avec traitement pharmacologique (c.-à-d., rTPA) se produisent avec ce modèle. Deuxièmement, les coûts canines pour achat, expédition, manipulation génétique et indemnités journalières sont assez élevés et coûtent prohibitifs jusqu'à ce qu’un médicament est bien définie dans les modèles de rongeurs.
Étapes cruciales dans le centre de protocole sur l’activation des plaquettes, agrégation et l’adhérence, le point crucial de la thrombose. Étant donné que l’analyseur de fonction plaquettaire (PFA-100) peuvent être effectuée avec 1600 µL de sang en double, cette méthode est simple et facile à suivre la réactivité des plaquettes sanguines tout au long de la procédure sans affecter l’homéostasie du sang. D’autres études ex vivo dans l’activité plaquettaire à l’aide d’impédance ou lumi-aggregometry peuvent être effectuées avant la lésion vasculaire sans affecter la thrombose expérimentale tant que le dernier tirage de sang est > 1 semaine avant la chirurgie outre après blessure et le traitement au moment du sacrifice. Tel que déjà mentionné, des applications supplémentaires de bande ombilicale trempés dans 50 % FeCl3 peut être nécessaire selon le sexe, la race ou l’âge de chaque canine. Nous avons accueilli 30 minutes après la blessure d’occlusion et réappliqué frais 50 % FeCl3 pendant 15 min si nécessaire. Ce processus n’a pas entraîné une différence significative dans la déviation thrombolytique avec l’âge ou le sexe à l’aide d’adultes beagles. Dans cette étude, nous avons élucidé la diffusion de critique et d’état-of-the-art imagerie pondérée (DWI), un M. formation image basée sur la mesure du mouvement brownien (diffusion aléatoire des particules) de molécules d’eau dans le tissus voxel. Cette technique est utile dans la détection d’accident ischémique cérébral aigu parmi d’autres pathologies telles que les tumeurs par liste de diffusion dans les tissus cellulaires hyper ou ceux avec gonflement cellulaire est faible plus diffusion coefficient17,18 ,19. Cartes de diffusion varie avec la diffusion des molécules d’eau dans le cerveau des tissus17,18,19. La valeur de B-mesure du gradient de diffusion de molécules de H2O. Dans le site de la lésion ischémique, l’eau libre expériences plus forte atténuation du signal au plus haut les valeurs de B19.
En plus de l’utilisation de ce protocole canine d’études de dosage, la toxicité et l’efficacité des agents prophylactiques et thrombolytiques, la taille d’un chien fait des expériences dans thrombectomie mécanique cliniquement pertinentes et facilement réalisables. Carotides peuvent être facilement traitées, colorées et évalués en utilisant des protocoles pour histologie humaine pour l’étude de l’infiltration de cellules immunitaires après extraction du caillot. Ces études seront nos prochains protocoles détaillés.
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Disclosures
Aucun
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le centre de Cognitive and Behavioral Brain Imaging à la Ohio State University pour leur appui financier et scientifique à l’élaboration de l’imagerie par résonance magnétique canine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
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