Summary
Her presenterer vi endringene må vel preget og brukte små dyr ferric klor-indusert (FeCl3) arteria carotis skade modell for bruk i en stor dyr vaskulære skader modell. Den resulterende modellen kan benyttes for pre-klinisk prøve vurdering av både forebyggende og thrombolytic farmakologiske og mekanisk intervensjoner.
Abstract
Occlusive arteriell trombose fører til cerebral iskemiske hjerneslag og hjerteinfarkt bidrar til ~ 13 millioner dødsfall hvert år globalt. Her har vi oversatt vaskulære skader modell fra en liten dyr til et stort dyr (hjørnetann), med små modifikasjoner som kan brukes for pre-klinisk screening av forebyggende og thrombolytic. I tillegg til den kirurgiske metoder beskriver endret protokollen de trinnvise metodene for å vurdere arteria carotis Brücke av angiography, detaljerte instruksjoner for å behandle både hjerne og arteria carotis for histologiske analyse å bekrefte carotis Brücke og hjerneblødning, og bestemte parametere for å fullføre en vurdering av nedstrøms thromboembolic hendelser ved å bruke magnetisk resonans imaging (MRI). I tillegg diskuteres spesifikke prosedurale endringer fra tidligere veletablerte liten dyr modellen nødvendig å oversette til en stor dyr (hjørnetann) vaskulære skader.
Introduction
Slag terapi er hovedsakelig modellert etter coronary arterien sykdom behandling, hovedsakelig fordi intervensjoner i kardiovaskulær sykdom har svart godt til stoffet terapi og endovascular intervensjoner1. Disse behandlingene, men har ikke ble oversatt til hjerneinfarkt. Vanskelighetene med gjeldende slag behandling er at av rekombinant vevsplasminogen aktivator (rTPA) ikke kan tilbakeføres og at administrasjonen bærer en 6,4% risiko hemoragisk konvertering2,3, 4. resulterende sykelighet og dødelighet begrenser bruken til en liten, ofte uoppnåelig vinduet5. Også oppstår restenosis og okklusjon ofte etter første thrombolysis, reversere første nevrologiske forbedring. Oppsummert er det et smalt timelige vindu administrere rTPA som utelukker det store flertallet (~ 90%) pasienter som lider av iskemiske cerebrovascular fornærmelser.
Rollen av intravenøs platehemmende terapi har vist lovende i behandling av iskemiske hjerneslag med forbedret fartøyet recanalization, overlevelse og resultatet2. Dessverre disse stoffene har en forutsigbar bivirkning av intra skallen og ekstra skallen blødning, hovedsakelig fordi det er ikke mulig å tilstrekkelig reversere eller kontrollere deres aktivitet2. Mens effektive i å forebygge trombocyttaggregasjon, risiko for blødning og manglende evne til å reversere sin aktivitet har utelukket bruk i rutinen av slagpasienter. Behov, derfor finnes for potent antithrombotic legemidler som opptrer alene eller i kombinasjoner å hindre og lyse clots men har en sikkerhet profil som kan bruke i en lukket, lavt volumplass som hjernen, der blødning er dårlig tolerert.
Forstå mekanismen av arteriell trombose og re-stenose, og evaluere thrombolytics og stoffer som hindrer re-stenose, krever både små og store dyr modeller som en del av pre-klinisk narkotika utvikling. Ferric chloride-indusert vaskulære skader er en mye benyttet teknikk for å raskt og nøyaktig indusere dannelsen av thrombi i synlige blodkar mus, rotter, marsvin, og kaniner6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. disse mindre arter tilbyr flere fordeler som genetisk manipulasjon, rimelig dyr kjøp og lav kostgodtgjørelse boliger kostnader. Dessverre, små dyreforsøk negate flere blod uavgjorte under operasjonen tilgang Platederivert reaktivitet, blod gass analyse og betennelsesreaksjon. Enda viktigere, etterligner store dyr mye nærmere menneskelige Platederivert fysiologi6,13. FeCl3 arteria carotis skade modellen har spilt en dominerende rolle i studiet av i Patofysiologien ved blodpropp, validering av romanen anti-Platederivert og anti-koagulere narkotika og i oppdagelsen av potensielle thrombolytics6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. forrige modellene i mus, rotter, marsvin, og kaniner har gitt lettheten og fleksibiliteten for genetisk manipulering, men oversettbare pre-klinisk modeller er kritisk til pasienten dosering og toksisitet studier av potensielle therapeutics6 ,13. Selv om flere modeller av trombotiske lidelser er utviklet i mus, store dyr modeller av tromboser som gjelder perifer vaskulær sykdom, er slag og hjerteinfarkt få og langt. Første trombose modellene i aper, hunder og griser fokusert på stenose, gjelder hemostats og senere sylindere fartøyer, vanligvis resulterer i syklisk flyt reduksjoner14,15,16. I stedet for en occlusive blodpropp på stedet av endothelial skaden i ferric chloride modellen, blodpropp i disse modellene resulterte i syklisk trombose distale embolisering og returnere til normalt blod flyte. Sammenligning er ferric chloride modellen endret her i et stort dyr, resulterer i en occlusive blodpropp i skaden nettstedet og stabilisert og bekreftet av angiography før thrombolytic behandling. Forutsatt at etterforskeren har masse penger for per diem og kjøp av hjørnetann og tilstrekkelig kirurgisk kompetanse, detalj vi her en stor hjørnetann modell av vaskulære skader å tillate laboratorier for å studere trombose utnytte kirurgisk, bildebehandling og histologiske teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøkelsene beskrevet overholder retningslinjene og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health og ble godkjent av The Ohio State University institusjonelle Animal Care og bruk Committee (#2015A00000029). Alle kirurgiske manipulasjoner ble utført under dyp anestesi og dyrene opplever ikke smerte når som helst under prosedyren. Alle eksperimenter beskrevet var ikke gjenoppretting.
1. forberedelse
- Fersk forberede 50 mL av ferric chloride (FeCl3) 50% (w/v) fortynnet i deionisert vann.
- Klippe umbilical båndet i 5,5 cm biter og suge i nylagde 50% FeCl3 løsningen 1 uke før prosedyren.
Merk: Umbilical tape brukes er tykk og tar litt tid å absorbere den 50% FeCl3 løsningen. - Rask hver hjørnetann natten før operasjonen.
- Merk cryovials for plasma og urin samling, 50 mL steril sentrifuge rør for alle orgel lagring, og 10% formalin beholdere for hjernen og carotis fiksering til H & E farging med dyr identifikasjon, fødselsdato, kirurgi og behandling.
- Forberede 100 mL hver løsning for hver hjørnetann prosedyre: 4% paraformaldehyde i fosfat bufret saltvann (pH 7.4), 10% nøytrale fullbufrede formalin og 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride [TTC i PBS (pH 7.4), lagre i mørket].
- Få rikelig flytende nitrogen for alle cryovials og 50 mL vev rør for flash fryse for dagen av prosedyren.
- Få to ADP/kollagen patroner for PFA-100 (Platederivert funksjonen Analyzer) Platederivert reaktivitet for hver hjørnetann for hvert punkt av interesse.
- Kjøpe en 4,5 mL natriumsitrat blod samling rør, hver blod uavgjort før offer, for plasma separasjon og lagring. På offer, trekke 16 blod samling rør for plasma lagring. Etter hver blod samling rør er full, spinn på 4000 x g for 30 å isolere Platederivert rik plasma og overføre fjerner lag i cryovials. Flash fryse i flytende nitrogen før på-80 ° C.
- Kjøpe en 4,5 mL litium heparin blod samling rør, for hver PFA-100 punkt av interesse for posten Platederivert reaktivitet. På hver blod trekning, innføre 800 µL av hele blod fra en litium heparin blod samling rør i hver ADP/kollagen kassett uten luftbobler å følge Platederivert reaktivitet.
- Kjøpe to EDTA K3 blod samling rør (1,8 mg av vannfri EDTA per 1 mL blod), for full blodstatus (CBC) ved baseline og ved offer.
Merk: Dette er tilstrekkelig for de fleste kjernen fasiliteter til å kjøre to ganger ved mekanisk feil. Selv om en CBC ble kjørt på både den opprinnelige planen før skade og ved offer, etterforskere kan legge til mer blod trekker som godkjent i sine dyr protokoller for ytterligere analyser. Sjekk funksjonen volumer og levering krav for sitt utstyr. - Forberede en 2 mL sprøyte heparinized ved å fylle og belegg sprøyten dagen av prosedyren for blod gass analyse ved offer.
Merk: Se funksjonen volumer og levering krav for sitt utstyr.
2. hjørnetann arteria carotis okklusjon
- Veie voksen (> 18 måneder) beagle hjørnetann og pre-medisinere med intramuskulær acepromazine (0.025-.2 mg/kg) etterfulgt av en innledende intraperitoneal injeksjon av ketamin (5-20 mg/kg) og midazolam (0,01-.25 mg/kg). Indusere dypere anestesi med 1-5% isoflurane basert på hjertefrekvens, respirations og kjeven tone.
Merk: Nøyaktig anestesi er diktert av vekten og godkjent dyr protokollen. Selv om injeksjoner kan resultere i smerte for dyrene, varigheten av dette ubehaget vil være minimal (mindre enn 3 s). - Før dyret til tabellen kirurgi, fjerne hår ved klipping. Gjelde smøring ophthalmica salve bedøvet dyrets øynene å hindre tørrhet.
- Plassere dyret i supine posisjon ved hjelp av et posisjoneringssystem og fest electrocardiography (ECG) fører til foten pads. Intubate gjennom luftrøret med en 6.5 mm cuffed endotracheal tube, mekanisk ventilere på 14 åndedrag/min og opprettholde hver hunden med en kontinuerlig innånding av 1-5% isoflurane (avhengig av godkjent animalsk-protokollen).
- For å fastslå omfanget av Brücke av carotis og lengden på den occlusive blodpropp, utføre angiography før skade, før MRI og ved offer (se nedenfor for mer informasjon).
- Sett inn en femur arteriell skjede og en plast kateter og sikre med en løs 0-silk Sutur. Midlertidig lukke skjede og kateter under transport og imaging studier. Se hjørnetann angiography nedenfor for mer informasjon).
- Sette inn en 16G x 45 mm intravenøs kateter gjennom intakt huden distale til femur arteriell skjede kutte ned området for blod uavgjorte. Fremme kateter inn kirurgisk eksponering og visualisere det som den kommer inn i utsatte femur venen umiddelbart ved arterielle skjede. Når satt helt inn i venen, trekke nålen, cap kateter med en 3-veis stopcock og skylle den med 2 mL 0,9% sterilt saltvann. Sikre kateter til huden med en 0-silk Sutur.
- Gjør en 8-10 cm snitt i huden direkte på toppen av høyre arteria carotis communis regionen og dissekere fascia å isolere fartøyet fra de omkringliggende vev.
- Nøye introdusere tang mellom arteria carotis og nervus vagus skille. Unngå å berøre arteria carotis mer enn nødvendig det kan forårsake innsnevring av fartøyet.
- Tørr eksponert område av arterien med sterilt gasbind å unngå FeCl3 løsning fortynning.
- Sted Doppler flyt sonde rundt carotis gir amble plass Legg umbilical målebåndet rundt carotis uten å berøre flyt sonden og starte innspillingen blod hastigheten og fortsette i hele denne prosedyren (figur 1 topp). Registrere planlagt flyten for ~ 5 min før umbilical båndet.
Merk: Baseline flyt før FeCl3 umbilical bånd plasseringen vanligvis gjennomsnitt rundt 250 mL/min. - Legg forberedt FeCl3 umbilical målebåndet rundt carotis bruker en hemostat rett under flyt sonden uten berørende det for 15 minutter, fjern og kast.
Merk: Okklusjon er angitt som null flyt mL/min. - Stabilisere det occlusive blodpropp for 45 min. Legg til flere saltvann på sonde som nødvendig for å opprettholde et signal.
Merk: Avhengig av alder, kjønn og type hjørnetann, flere plasseringer av forberedt FeCl3 umbilical tape kan være nødvendig for at 30 min for okklusjon oppstår før re-programmet. Ingen forskjeller ble observert i tromboser av ferric chloride program med kjønn i beagles. Det ble ikke funnet nødvendig med denne modellen på nytt en frisk FeCl3 umbilical tape mer enn én gang og har aldri avveket fra FeCl3 umbilical tape forberedelse protokollen. Hvis laboratoriet bruker en annen rase eller alder av hjørnetann, FeCl3 umbilical tape skal brukes på første emner Kontroller at blodpropp protokollen ikke avviker, eller en gruppe av hjørnetann kan være nødvendig å etablere FeCl3 programmet tid for rasen eller alder i bestemte studiet. De okklusjon gangene, i dette eksperimentet, varierer fra 8-30 min etter FeCl3 umbilical tape program. - For å bestemme slag eller blødning volumet i tillegg til nedstrøms thromboembolic hendelser som kan oppstå farmakologiske intervensjoner, transportere hjørnetenner med ekstra ketamin injeksjon til en magnetisk resonans imaging maskin (se nedenfor ytterligere behandling).
- Mens det fortsatt er under et dype kirurgiske fly av anestesi fra en siste angiografi/MRI (se nedenfor for bildebehandling protocol), angitt av en mangel på respons på skadelige stimuli, samle fullblod ønsket for senere analyse og åpne brystet ved skjære gjennom ribbeina begynner på side og avgiftsdirektoratet hjertet ved å kutte blodkar (exsanguination).
Merk: I dette eksperimentet, hele blod (< 10 mL) ble trukket på grunnlinjen, 5 min etter agent administrasjon og 60 min etter infusjon av femur skjeden og så ingen innvirkning på prosessen med thrombolysis. På offer, kan et ubegrenset volum bli trukket for mer plasma lagring hvis godkjent i animalsk-protokollen. Analysere, behandle og lagre alle fullblod innen 30 min offer. Kontroller at blod ikke er trukket over godkjente prosentandelen av dyrets kroppsvekt som godkjente animalsk-protokollen. Alle eksperimenter beskrevet var ikke gjenoppretting. - Skyll hjertet med 0,9% saltløsning og flash fryse prøvene i flytende nitrogen hvis ønskelig.
- Før du fjerner carotis, måle blodpropp lengden ved å plassere en hersker det og post. Sett vev markøren i midten av blodpropp og på samme sted på kontralateral carotis for enkel i histology trimming. Merk kontralateral carotis på samme lengde.
Merk: Gjennomsnittlig blodpropp lengden med denne modellen er 1,75 cm. - Fjerne hele lengden av blodpropp på begge skipene og løse i 10% formalin. Fjerne det kontralateral arteria carotis innenfor lengden preget av vevet markøren. Halvert kontralateral arteria carotis midt på blodpropp. Flash fryse halvparten av kontralateral arteria carotis i flytende nitrogen for senere analyse og fikse halvparten 10% formalin å legge ved skadet carotis for histologiske analyse nedenfor.
- Fjerne organer for noen ønsket analyse, skyll med 0,9% saltløsning og flash fryse i flytende nitrogen.
- Fjerne skallen med en sirkulær bein så. Fjern sakte skallen uten å skade hjernen under.
- Etter hjernen er fjernet fra skallen, skyll den i kaldt 0,9% saltvann, og kutte to 4 mm deler fra midten av hjernen, kutte sidelengs med skarpe skalpell. Plassere en av delene 4 mm i 2% TTC for iskemiske avgrensning (se ytterligere behandling for hjernen TTC), mens andre stykket plassert i 10% formalin i 7 dager for H & E flekker (se ytterligere behandling for hjernen H & E).
3. hjørnetann angiografi
Merk: Dette er vist i figur 2 og gjøres under operasjonen på tid interessepunkter.
- Føler for en puls i regionen rett lysken og gjøre en 3-5 cm ventrale sagittal snitt.
- Utsette femoral arterien og skiller den fra omkringliggende vev med sløv disseksjon.
- Bruk en rettvinklet hemostat for å plassere en 0-silk Sutur rundt distale arteria eksponert.
- Binde den distale 0-silk Sutur og bruke liten spenning til arterien ved clamping løs 0-silk Sutur endene til huden med hemostats.
- Plass en andre 0-silk Sutur rundt den proksimale enden av det synlige segmentet.
- Punktering arterien midtveis mellom den proksimale og distale 0-silk Sutur knytter bruker en 18G introducer nål for å passere en guidekabel i arterien.
- Laste inn en samlet 6Fr kappe og dilator på guidekabel, fatte ledningen fotografiene fra forsamlingen.
- Fremme dilator og skjede over guidekabelen. Pass på å opprettholde en god forståelse av ledningen som stikker fra dilator mens fremme dilator skjede forsamlingen.
- Etter full innsetting, tie det proksimale 0-silk suture rundt skjede å opprettholde hemostasen på webområdet arteriell punktering.
- Samtidig fjerne dilator og guidekabelen.
- Åpne enveis ventilen for å bekrefte tilstedeværelse av pulsatile blodstrøm og flush med 3-5 mL normal saline.
- Koble access skjede enveis ventil til en væske fylt forlengelsesslangen knyttet til en trykktransduceren overvåke og registrere invasiv blodtrykk mål.
- Pre-belaste en 0,35" guidekabel i et 4Fr. angiographic kateter og koble til kontrast injeksjon manifold med en Tuohy y-kort.
- Trekk spissen av guidekabel rett innenfor den distale tuppen på kateter og tømme hele samlingen med saltvann.
- Den angiographic kateter inn hemostatic ventilen av skjede og avansere guidekabelen ca 5 cm utenfor den distale kateter spissen.
- Under fluoroscopic veiledning og bruker en retrograd trans-aorta tilnærming, langsomt vil avansere kateter inn aortabuen.
- Injisere 2-3 mL kontrast agent utvannet 1:1 med vanlig saltvann å identifisere take-off av truncus stammen.
- Bruk guidekabel skal lede kateter inn truncus bagasjerommet, og deretter selektivt inn høyre arteria carotis communis.
- Fjern guidekabelen og injisere 2-3 mL utvannet kontrast til å bekrefte at kateter plasseres i carotis.
- Sette inn 3-4 mL ufortynnet kontrast mens angiographic kjører med både digitale subtraksjon og standard angiographic teknikker.
- Gjenta trinn 3,18-3.21 for den gjentatte angiography på ekstra tid poeng.
4. magnetisk resonans - diffusjon vektet Imaging (DWI) og T2 vektet imaging (T2WI) av hjørnetann hjernen
Merk: Dette er vist i figur 3A-3B.
- Kontroller at hunden er under dyp anestesi.
- Kontroller at hundens fysiologiske parametre overvåkes gjennom avbilding inkludert ECG og hjertefrekvens.
- Kontroller at hunden ligger i supine posisjon med hodet i bilaterale åpningene av hjernen spolen.
- Aktivere 3 Tesla (3T) magneten.
- Utføre T2 vektet bildebehandling (T2WI), en grunnleggende puls-sekvenser i Mr.
Merk: Sekvensen bruker forskjellene i T2 avslapning tid av vev på ulike patologiske forhold. - Utføre localizer for å hente pilot bilder av en hund-hjerne før den anatomiske bildevisning T2-vektet gradient ekko imaging sekvens og finne synsfelt (FOV), skiver og skive tykkelse til dekker hjernen.
- Bruk følgende T2-parametere: Skjær tykkelse = 3 mm, TR = 4000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, oppkjøp matrise = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 piksler, bildeoppløsning = 2.4615 piksler per mm.
- Utføre diffusjon vektet imaging (DWI) bruker ekko planer DTI sekvens 4T etter MCA okklusjon og umiddelbart før offer.
- Bruk følgende DWI parametere: b = 1500 s/mm2, slice tykkelse = 3 mm, TR = 4600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, oppkjøp matrise = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, bildeoppløsning = 0.9333 piksler/mm (tabell 1).
5. hematoxylin og Eosin (H & E) flekker av hjørnetann hjernen
Merk: Dette er vist i figur 3D.
- Etter 7 dager i 10% formalin, bygge delene 4 mm hjernen i parafin.
- Trim parafinblokkene før de er nivå med en mikrotom, fjerne ekstra parafin fra toppen av hjernevevet, deretter kuttet hjernevev på 4 µm og plassere en del av hjernen på lysbildene 2 "x 3" tomme.
Merk: Før farging, plassere alle løsninger i separate containere slik at lysbildene kan flyttes fra en løsning til en annen uten å tørke. - De paraffinize lysbildene hjernen og hydrat med vann fra springen.
- Plass hvert hjernen lysbilde i Hematoxylin 560 i 8 min.
- Skyll lysbildene hjernen i vann fra springen.
- Skille hver hjernen lysbilde med 1% Acid alkohol for 1 s tre ganger.
- Skyll lysbildene hjernen i vann fra springen.
- Blå hver hjernen lysbilder med 1% ammonium hydroksid for 1 s.
- Skyll hvert hjernen lysbilde i rennende vann fra springen i 2 minutter.
- Tørke lysbildene hjernen i 70% etanol (EtOH) for 1 s tolv ganger.
- Counterstain hvert hjernen lysbilde i eosin for 1 min.
- Tørke lysbildene hjernen i 95% EtOH for 1 s tolv ganger.
- Tørke lysbildene hjernen i 100% EtOH.
- Klare hvert hjernen lysbilde i xylen og deretter bruke en 2 "x 3" tommers dekkglassvæske på hjernen lysbildet fjerne luftbobler med resinous monterer medier.
Merk: Alle løsninger brukes unntatt vann og etanol for flere dager i flekker og flere lysbilder. Alle behandling etter hjernen deler er plassert på lysbilder er gjort i glass flekker krukker, men flekker plastbeholdere er kommersielt tilgjengelig også. Erstatt alle løsning når det blir misfarget og holde dem tett dekket.
6. hematoxylin og Eosin (H & E) flekker av hjørnetann carotis
Merk: Dette er vist i figur 1 (til venstre).
- Etter 24-72 h i 10% formalin, halvert skadet carotis midt på blodpropp og legge ned ~ 1 cm av skadde carotis og ~ 1 cm i kontrollen kontralateral i samme parafin kassetten.
Merk: Blodpropp i carotis er skjøre. Vent til fartøyet har blitt fikset i 10% formalin før kutte slik at blodpropp ikke forstyrres. Innebygging både den skadde og kontrollere carotis arteriene samme parafinen blokk vil tillate kutte samtidig på samme sted i blodkaret. - Trim parafin blokker til nivå med en mikrotom, fjerne ekstra parafin. Deretter kuttet deler 4 µm på 25 mm x 75 mm x 1 mm lysbilder uten å rotere parafin blokken slik at delene kontralateral carotis plasseres øverst på lysbildet.
Merk: Tre carotis deler ble plassert på hvert lysbilde, men man kan legge til avhengig flekker rundt. - De paraffinize hvert carotis lysbilde og fuktighet i vann fra springen.
Merk: I motsetning til hjernen lysbildet som skal behandles individuelt, carotis lysbilder kan behandles samtidig ved å plassere i krukker som passer flere lysbilder samtidig uten å berøre hverandre. - Stain hvert carotis lysbilde i hematoxylin i 8 min.
- Skyll hvert carotis lysbilde i vann fra springen.
- Skille hver carotis lysbilde med 1% Acid alkohol for 1 s tre ganger.
- Skyll hvert carotis lysbilde i vann fra springen.
- Blå hvert carotis lysbilde med 1% ammonium hydroksid for 1 s.
- Skyll hvert carotis lysbilde i rennende vann fra springen i 2 minutter.
- Tørke hvert carotis lysbilde i 70% EtOH for 1 s tolv ganger.
- Counterstain hver carotis lysbildet i eosin eller 1 min.
- Tørke hvert carotis lysbilde i 95% EtOH for 1 s x 12.
- Tørke lysbildene carotis 100% EtOH.
- Fjern hvert carotis lysbilde i xylen og legge til en 24 x 50 mm dekkglassvæske med resinous monterer medier å fjerne luftboblene.
7. 2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium Chloride (TTC) flekker av hjørnetann hjernen
Merk: Dette er vist i Figur 3 c.
- Sted andre 4 mm delen fjernet fra midten av hjernen umiddelbart proksimale delen H & E i tidligere forberedt 2% TTC (arteria carotis okklusjon). Inkuber i mørket ved 37 ° C i minst 20 minutter, snu delen hjernen til selv farging hver 5 min.
Merk: Etter 20 min, delen bør være kirsebæret rød på begge sider. Ekstra tid kan være nødvendig avhengig TTC friskhet og tykkelsen på vev delen. - Fjern TTC løsningen og erstatte den med 4% paraformaldehyde i PBS, pH 7.4 å optimalisere fargekontrasten.
- Når kontrasten mellom hvite og røde flekker er optimal, sted TTC hjernen skiver mellom klar plast ark, tørr overflødig væske og skanning med høy oppløsning for sporing av iskemiske regioner.
Merk: Deler kan lagres på ubestemt tid i paraformaldehyde løsning, men flekker vil visne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende detaljerte prosedyrer, vil resultere i utviklingen av en modell som kan brukes for forebyggende eller thrombolytic vurdering av occlusive arteriell intervensjoner. Figur 1A viser planlagte flyten hastighet og den resulterende blod flyten hastigheten før, under og etter behandling av en kommersiell programvare. Data fra denne innspillingen kan brukes til å bestemme prosent av re perfusjon med carotis communis skade og behandling i denne hjørnetann modellen. Figur 1B gir et eksempel av både kontralateral (øverst) og skadet (nederst) hjørnetann carotis deler med H & E som kontrollerer statusen re Brücke ved offer. Det finnes en rekke programmer analysere perfused området av fartøyet av sporing blodkaret (uten blodpropp) som kan deles med totalt areal på skipet ankommer en prosent av Brücke med hver behandling. Figur 2 viser flere eksempler på arteria carotis angiography i denne hjørnetann imaging protokollen som kan brukes til å avgjøre om embolus er occlusive. I tillegg kan bruker kvadrat flyt sonden som en markør, etterforskere bestemme lengden på blodpropp på hver tidspunkt angiografi er tatt. Men her vi har presentert bilder før skaden, 60 min etter kjøretøy behandling og ved offer, kan etterforskeren skreddersy imaging til deres behov. Figur 3 er et resultat av magnetiske tenkelig parameterne brukes hjørnetann hjernen ~ 4 h etter arteria carotis okklusjon umiddelbart før offer, utnytte både diffusion vektet (figur 3A) og T2 vektet imaging (figur 3B) beskrevet i del 4 av denne protokollen. Selv om vi bare vise ett bilde av hele matrisen tatt på ulike nivåer i hjernen, kan størrelsen på både blødning og hjerneslag volumet identifisert i ulike nivåer og områder av hjernen og quantitated på hvert tidspunkt ønsket av etterforskeren. Kvantifisering er fullført ved hjelp av bestemte MRI maskin programvaren gjelder for den investigator imager. TTC fargeresultatene som vist i Figur 3 c kan brukes til å avgrense hjernevev der cellene er fortsatt metabolically aktiv i tillegg til de som ikke. TTC reduseres enzymatisk for å resultere i rød farget lever celler mens døde celler, beholder ikke TTC og således ikke blir rød. Til slutt, hematoxylin og eosin flekker teknikken vist i hjørnetann hjernen i figur 3D vil resultere i flekker røde blodlegemer rød som kan brukes til å kontrollere områder der blødning har oppstått.
Figur 1: overvåking av carotis blodstrøm. (A) representant arteria carotis blod hastigheten (mL/min) spilt inn fra Doppler sonde fra grunnlinjen før skade gjennom offer. (B) representant H & E flekker av begge okkludert arteria carotis (nederst) og kontralateral kontroll (øverst). Forstørrelse er 20 X. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: overvåking av carotis blodstrømmen av angiography. Representant angiography utsikt rett hjørnetann arteria carotis. Bildene ble tatt ved baseline før bilen infusjon (A), 60 min etter kjøretøy infusjon (B), og på offer, 4.5 h etter okklusjon (C). Røde piler indikerer plasseringen på fartøyet FeCl3-indusert skade hvor navle kassetten ble plassert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant bilder av hjørnetann hjernen etter kjøretøy behandling. Magnetisk resonans Imaging (MRI) utført ~ 4 h etter okklusjon, umiddelbart før offer, utnytte diffusjon vektet imaging (DWI, (A) og T2 vektet imaging (B). TTC flekker mediale delen ved offer å avgrense live fra dødt vev (C). H & E farging av mediale delen, umiddelbart proksimale TTC delen, da offer å avgrense vev som metabolically aktiv (rød) fra de som ikke TTC reduseres til en rød produktet når tatt opp av levende celler og derfor vil resultere i deler som kan kvantifiseres med en rekke programvare å spore live vs død regioner. (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperimentell Parameter | T2-vektet | Diffusjon vektet |
| Repetisjon tiden (TR) ms | 4000 | 4600 |
| Ekko tid (TS) ms | 75 | 86 |
| Snu vinkel, grader | 180 | 90 |
| Oppkjøpet matrise | 320 x 256 | 231 x 257 |
| Antall gjennomsnitt | 2 | 4 |
| I flyet bildeoppløsning (piksler/mm) | 2.4615 | 0.9333 |
Tabell 1: magnetisk resonans Imaging (MRI) parametere. Mr parametere som ble utviklet for hjørnetann T2 - og Diffusion-vektet bilder for å maksimere vurdering av hjerneslag og blødning volummåling i hjørnetann arteria carotis trombose modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FeCl3 indusert vascular skade modellen er mye brukt til å studere blodpropp i små dyr og er lett å oversette til en stor dyr, pre-klinisk modell med en rekke fordeler. Små endringer tilpasse protokollen i en hjørnetann tillate bruken av både magnetisk resonans imaging å vurdere slag og blødning etter en farmakologisk intervensjon og angiography å vurdere fartøyet Brücke før, under, og etter behandling. Andre trombotiske store dyr modeller har ikke studert stabilisert occlusive thrombi på stedet av skade og derfor kan ikke utnytte angiografi og histology av arteria carotis å vurdere omfanget av re Brücke for hver profylaktisk eller thrombolytic behandling. I tillegg til fordelene av en stor dyr inkluderer rikelig vev for analyse (plasma, urin, organer for toksisitet studier, osv.), etterligner den store dyremodell mye nærmere hjertefrekvens, blodtrykk og koagulasjonssystemet cascade hos mennesker enn gnager modeller. Tilstrekkelig størrelse på både hjerne og carotis arteriene, resultatet histologiske og biologisk materiale som kan brukes for en overflod av inflammatoriske og biokjemiske undersøkelser på hver eksperimentelle dyr. En annen fordel med å endre FeCl3-indusert vaskulær modell i en hjørnetann er at en mye større blodvolum kan hentes under eksperimentet uten å endre Platederivert reaktivitet eller blodpropp formasjon slik som blod gass og komplett blod teller kan overvåkes gjennom skade og narkotika infusjonen. I tillegg har ferric chloride skaden blitt tillagt oksiderende skaden; Derfor vil det etterligne aterosklerotisk skade foran klinisk slag og hjerteinfarkt mye tettere enn andre typer publisert arteriell skade modeller7. Til slutt, mekanisk intervensjoner som thrombectomy, som rutinemessig brukes klinisk, kan følge farmakologisk behandling slik at re-stenose og status for endothelial veggen helse kan rettes med rikelig histologiske vev for flere undersøkelser på det samme hjørnetann.
Begrensninger av denne modellen er få, men må vurderes. Først, selv om det tidspunkt, og behandlingen valgt i publikasjonen (ofre 4.5 h etter arteria carotis skade, kjøretøy) ikke resulterte i en målbar strek eller blødning, denne metoden er klinisk relevant for etterforskningen av romanen anti-trombotiske og trombolytika å fastslå effekt og dosering. Faktisk både hjerneslag og/eller blødning med første trombotiske fornærme eller med farmakologisk behandling (dvs. rTPA) oppstår med denne modellen. Dernest hjørnetann kostnader for kjøp, levering, genetisk manipulasjon og kostgodtgjørelse er ganske høy og koste uoverkommelige til et medikament er godt karakterisert på gnager modeller.
Avgjørende skritt i protokollen center på Platederivert aktivering, aggregering og heft crux av blodpropp. Siden Platederivert funksjonen Analyzer (PFA-100) kan utføres med 1600 µL av hele blod i duplikat, er denne metoden enkel og lett å spore Platederivert reaktivitet hele prosedyren uten å påvirke blood homeostase. Videre ex vivo studier i blodplater aktivitet impedans eller lumi-aggregometry kan utføres før vaskulære skader uten å påvirke eksperimentelle blodpropp som den siste blod trekningen er > 1 uke før kirurgi i tillegg til etter skade og behandling ved offer. Idet tidligere omtalt, tilleggsprogrammer umbilical tape dynket i 50% FeCl3 kan være nødvendig avhengig av kjønn, rase eller alder av hver hjørnetann. Vi lov 30 minutter etter skade for okklusjon og re-anvendt frisk 50% FeCl3 for en annen 15 min om nødvendig. Denne prosessen resulterte ikke i en betydelig forskjell i thrombolytic avvik med alder eller kjønn med voksen beagles. I denne studien har vi belyst kritisk og state-of-the-art spredningen vektet imaging (DWI), en MR imaging basert på måling av Brownsk bevegelse (tilfeldig spredning av partikler) av vannmolekyler i vev voxel. Denne teknikken er nyttig for påvisning av akutt iskemiske hjerneslag blant andre patologi som svulster av viser spredningen i hyper-mobilnettet vev eller de med cellular hevelse er lav med høyere spredning koeffisienten17,18 ,19. Diffusjon kart varierer spredningen av vannmolekyler i hjernen vev17,18,19. B-verdien måler graderingen for spredning av H2O molekyler. Iskemiske skade området erfaringer fritt vann sterkeste signalet demping høyere B-verdiene19.
I tillegg til bruk av denne hjørnetann protokollen for studier i dosering, giftighet og effekten av forebyggende og thrombolytic agenter gjør størrelsen på en hjørnetann eksperimenter i mekanisk thrombectomy klinisk relevant og lett oppnåelig. Carotis kan lett behandles, beiset og vurdert utnytte protokoller for menneskelig histology for studiet av immunsystemet celle infiltrasjon etter blodpropp henting. Disse studiene vil bli vår neste detaljert protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi ønsker å takke sentrum for kognitiv og Behavioral hjernen Imaging ved Ohio State University for deres økonomiske og vitenskapelige støtte å utvikle og utføre hjørnetann magnetisk resonans imaging.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
