Summary
여기, 우리는 바이러스 비활성화 전체 혈액에서 급속 한 바이러스 핵 산 추출에 대 한 프로토콜을 제시. 추출 혈액 컬렉션 튜브에 직접 수행 되 고 필요 없는 장비 또는 전기. 방법과 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 수 있습니다 어디서 나 (예를 들어, 필드 병원에서) 사용.
Abstract
감염의 급속 한 진단 발발 관리, 위험 봉쇄, 그리고 환자 치료를 위해 필수적 이다. 우리 이전 진공 혈액 컬렉션 튜브에 직접 상업 세포/바인딩 버퍼를 추가 하 여 안전한 핵 산 (나) 테스트를 위한 혈액 샘플링 동안 에볼라 바이러스의 급속 한 머리 맡 비활성화 하는 방법을 나타났습니다. 이 침대 비활성화 접근을 사용 하 여, 신속, 안전 하 고 단순화 된 머리 맡 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 검색에 대 한 개발 했습니다. 나 추출 혈액 컬렉션 튜브에서 직접 수행 하 고 아무 장비 또는 전기를 요구 한다.
혈액 세포/바인딩 버퍼에 수집 후 내용을 손으로 튜브를 틀 지 하 여 혼합 하 고 혼합물은 실 온에서 20 분 동안 알을 품을. 자석 유리 입자 (MGPs) 튜브에 추가 되 고 내용을 손으로 컬렉션 튜브를 틀 지 하 여 혼합 됩니다. MGPs는 다음 자석 홀더 또는 자석 및 고무 밴드를 사용 하 여 혈액 컬렉션 튜브 측에 수집 됩니다. MGPs는 세 번 씻어 그리고 컬렉션 튜브에 직접 차입 버퍼의 추가, NAs 나 테스트, 정량 등의 반응에서 MGPs 제거 없이 등온선 루프 증폭 (램프)에 대 한 준비가. 나 추출 메서드는 모든 실험실 시설에 의존 하지 않으며 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원 및 병원 격리 병 동에서) 어디서 나 사용할. 이 나 추출 방법은 램프 및 휴대용 악기와 결합 하면 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.
Introduction
바이러스 발생 상황에서 환자 병원 격리 병 동 또는 때 빠른 진단이 필요 하 고에 수감 되는 때, 간단 하 고, 안전 하 고 정확한 포인트의 케어 분자 진단 환자 관리 및 위험 포함에 대 한 필수적입니다. 에볼라 바이러스 (EBOV) 서 부 아프리카 (2013) 및 남미 (2015), Zika 바이러스의 2 개의 최근 바이러스 발생, 향상 된 관리 포인트 분자 진단 테스트, 반전 녹음 방송 루프 중재 등온 등에 대 한 관심 증가 증폭 (RT-램프)1,2 , recombinase 중 합 효소 증폭 (RPA)3,4. RT-램프와 RPA는 단순화 된 샘플 준비에 수행할 수 있는 빠른, 민감한, 그리고 특정 분자 테스트. Zika 바이러스에 대 한 실시간 램프는 측면 흐름 분석 결과 (LFA), 30 분1; 내 정화 비 전체 혈액 샘플에서 Zika 바이러스를 검출할 수 있는 결합 되었습니다. 그러나, 위험 그룹 4 병원 체로 분류 되는 매우 전염성이 EBOV 샘플 biosafety 아래 처리 될 필요 레벨 4 (BSL-4) 조건 및 안전 진단 절차를 수행할 수 있습니다 전에 비활성화.
단순화 된 비활성화 방법 EBOV, 샘플2,3,,45에 세포의 용 해 버퍼의 추가 같은 발발; 하는 동안 사용 되었다 그러나, 이러한 방법을 BSL-3 biosafety 캐비닛, 원심 분리기, 난방 블록 및 펫, 최소한 같은 실험실 장비와 BSL-4 조건 하에서 처리를 해야합니다. 이 장비는 격리 병 동에 또는 필드 병원에 일반적으로 존재. 이 문제를 해결 하려면 시도에 가방3, 진단 수행 되었습니다 되며 여러 휴대용 장치 및 기계 개발 [예를 들어, (나) 핵 산 추출에 대 한 휴대용 장치]6. 그러나, EBOV 긍정적인 샘플 여전히이 장치를 사용할 수 있습니다 비활성화 될 필요 합니다.
우리가 이전에 보고 된 EBOV7, Vaccinia 바이러스 및 Cowpox 바이러스8 에 대 한 신속한 머리 맡 바이러스 비활성화 방법 상업 세포/바인딩 버퍼의 추가 의해 일반 진공 혈액 컬렉션 튜브를 직접 허용 양도 혈액 환자에서 비활성화 버퍼7에. 어떤 엄격한 봉쇄, BSL-4 조건7, 등을 사용 하 여 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하는 닫힌된 시스템에서이 직접적이 고 즉각적인 비활성화 하 고 샘플 정상적인 BSL-2 조건 하에서 처리 될 수 있습니다. 이 비활성화 방법은 여러 나 추출 시스템, 로봇 등 손 정화 키트7;와 호환 그러나, 이러한 방법은 항상 병원 격리 병 동 내부 또는 필드 설정에 존재 하지 않는 로봇, 원심 분리기, 전기, 등 실험실 장비가 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 단순화 된 수동 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 후속 분자 검출에 대 한 설명합니다. 나 추출 방법에는 어떤 장비의 자석/자석 홀더 필요 하지 않습니다. 아니 원심 분리기, 블록, 또는 전기 난방 나 추출 필요 합니다. 따라서,이 방법은 실험실 시설에 의존 하지 않습니다 하 고 쉽게 될 수 있다 (예를 들어, 필드 병원, 병원 격리 병 동, 또는 낮은 리소스 설정을) 어디서 나 사용할. 나 추출 방법 신속 하 고 간단 하 고 모든 다운스트림 나 테스트, 정량, 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 등에서 직접 사용할 수 있습니다. 이 나 추출 방법은 램프와 휴대용 배터리 구동 등온선 악기와 결합 하면 머리 맡 진단 혈액 컬렉션의 40 분 이내 얻어질 수 있다.
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Protocol
생명 의학 연구 윤리 위원회, 수도권은 동의 그리고 여기에 설명 된 모든 방법을 분석 결과 개발 프로젝트에 덴마크 법률에 따라 윤리 위원회 시스템에 의해 검토에서 제외 된.
1. 바이러스 비활성화 및 빠른 나 추출을 위한 혈액 컬렉션 진공관의 준비
주의:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼 guanidinium 안산 (GITC)과 비 이온 계면 활성 제, irritants을 포함 되어 있습니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. 버퍼를 유출 하는 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 첫째, 흡수 성 조직으로 유출된 버퍼를 닦아냅니다. 다음, 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 염소를 사용 합니다.
- 준비 하려면 혈액 컬렉션 진공관, 25 G x 1 바늘과 3 mL 주사기를 사용 하 여 튜브의 뚜껑을 puncturing 의해 특정 상업 세포의 용 해 버퍼의 1.6 mL 4 mL EDTA 진공 튜브로 주사.
참고: 진공 튜브의 뚜껑을 제거 하지 마십시오. 진공 유지 되어야 합니다. - 실 온에서 버퍼 사용까지 포함 된 진공 튜브를 저장 합니다.
참고: 튜브는 적어도 1 년의 준비 후 안정.
2입니다. 나 추출에 대 한 버퍼의 준비
- 나 추출에 대 한 버퍼를 준비 하려면 랙에서 두 1.8 mL, 두 4.5 mL, 그리고 한 3.6 mL 튜브를 배치 합니다.
- Pipetting, 960 µ L 자석 유리 입자 (MGPs) 깨끗 한 1.8 mL 튜브와 라벨이 MGPs. 그것은 그것을 pipetting 전에 완전히 MGP 정지를 Resuspend 하 여 추가 합니다.
참고:는 MGPs는 튜브의 하단에 신속 하 게 수집 하는 경향이 있다. - Pipetting, 워시 버퍼의 4 mL 나 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 의해, 추가 하 고 WB-1로 그것을 분류.
주의: 워시 버퍼 나 자극성은 guanidinium 염화를 포함 합니다. 적절 한 실험실 안전 조치, 흐름 후드를 사용 하 고 그것을 취급할 때 장갑을 착용. 어떤 피부와 눈 접촉을 피하십시오. - 워시 버퍼 II 깨끗 한 3.6 mL 튜브 1.5 mL를 pipetting에 의해 추가 하 고 WB 2로 그것을 분류.
- Pipetting, 여 깨끗 한 4.5 mL 튜브에 워시 버퍼 III의 3 mL를 추가 하 고 레이블을 WB-3로.
- 깨끗 한 1.8 mL 튜브에 차입 버퍼의 100 µ L pipetting으로 추가 하 고 레이블을 EB로.
- 사용 될 때까지 실 온에서 aliquoted 버퍼를 저장 합니다.
참고: 튜브는 그들의 준비 후 적어도 1 달 동안 안정.
3. 바이러스 감염의 징후와 증상을 가진 환자에서 혈
주의: 환자에서 전체 혈액을 수집 하는 때 적절 한 실험실 안전 조치를 취할. 장갑과 안경 착용. 환자 격리에서는, biosafety 수준 4 절차를 따르시기 바랍니다.
- 환자에서 정 맥 전 혈을 수집 작은-내경 확장 튜브와 나비 바늘과 혈액 컬렉션 진공관 포함 하는 세포/바인딩 버퍼를 사용 합니다. 하향 위치에 환자의 팔을 휴식 하 고 컬렉션 튜브 나비 바늘 보다 낮은 위치. 환자의 정 맥에 나비 바늘을 삽입 하 고 작은-내경 확장 혈액 컬렉션 진공관을 연결할.
참고: 이것은 역류를 방지 합니다. - 혈액 수집 후 5-10 시간 튜브를 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합.
참고: 포함 하는 세포/바인딩 버퍼의 1.6 mL 혈액 컬렉션 튜브에 남아 있는 진공으로 인해 수집 된 샘플의 볼륨 자동으로 됩니다 1.6 mL. - 70% 에탄올을 사용 하 여 튜브의 외부를 소독.
- 실 온에서 20 분 동안 튜브를 품 어.
참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다 및 전체 혈액 컬렉션 튜브-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C 또는 적어도 1 달7에 대 한 37 ° C에 저장 될 수 있다. - 단순화 된 나 추출 방법에 직접 계속.
4. 간단 하 게 전체 혈액의 나 추출
- 세포/바인딩 버퍼 비활성화 수집 된 혈액, 믹스에서에서 나를 정화 진공을 틀 지 하 여 튜브의 내용을 손으로 5-10 x 튜브.
- 신중 하 게 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 뚜껑을 방전.
- 혈액 컬렉션 튜브에 직접 MGPs (1 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
- 샘플 포함 된 튜브에는 사용 하지 않는 혈액 컬렉션 튜브에서 새로운 뚜껑을 장소.
- 튜브 긴밀 하 게 폐쇄 확인 혈액 컬렉션 튜브가 손으로 5-10 시간 틀 지 하 여 튜브의 내용을 혼합을 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
- 자석 홀더에 튜브를 놓고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 유지 합니다.
- 모든 MGPs는 자석으로 튜브의 측면에서 수집 되도록 손으로 튜브와 함께 자석 홀더는 몇 번을 플립.
참고: 자석 홀더는 길쭉한 자석 및 고무 밴드를 교체할 수 있습니다. - 튜브의 뚜껑을 제거 하 고 일회용 피 펫을 사용 하 여 또는 단순히 50 mL 수집 튜브에 내용을 붓는 하 여 튜브의 내용을 삭제 합니다.
참고: 튜브 뚜껑을 닫아서 50 mL 수집 튜브에서에 어로 졸을 피하십시오. - 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-1 (4 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
- 관에 뚜껑을 배치 하 고 튜브 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
- 자석 홀더, 뚜껑을 손가락으로 안전 하 게 강화 유지에서 튜브를 제거 합니다.
참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서. - 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.
- 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
- 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-2 (1.5 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
- 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서. - 튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
- MGPs는 손으로 몇 초 동안 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 여 resuspend.
- 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
- 혈액 컬렉션 튜브에 직접 WB-3 (3 mL)의 준비 된 약 수를 부 어.
- 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서. - 튜브는 단단히 닫혀 있도록 뚜껑에 손가락을 놓습니다.
- 혈액 컬렉션 튜브를 내리고 손으로 5-10 시간 여를 MGPs resuspend.
- 4.6 4.8 단계를 반복 합니다.
- EB의 준비 된 약 수를 부 어 (100 µ L) 혈액 컬렉션 튜브에 직접.
- 관에 뚜껑을 놓고 자석 홀더에서 튜브를 제거 합니다.
참고: 자석 및 고무 밴드를 사용 하는 경우 단순히 제거 고무 밴드 및 자석 관에서. - 혈액 컬렉션 튜브 5-10 배는 손가락으로 두 드려서는 MGPs는 EB에 resuspend.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다, 그리고 튜브-20 ° c.에 저장 될 수 있다 - Resuspended MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫 (모든 다운스트림 진단 나 증폭 시험 램프/RT-램프 또는 정량/RT-정량 분석을 사용할 수 있습니다와 같은)를 사용 하 여 다운스트림 나 증폭 반응 혼합 한 방울 (5-8 µ L)를 전송.
참고: NAs는 MGPs에 충실, 다운스트림 나 증폭 반응에는 MGPs를 사용 해야 됩니다. 혼합 사용 하기 전에 MGP 정지. 혼합 후, MGPs는 튜브의 아래쪽에 수집 합니다.
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Representative Results
여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 효율적 이며 세포/바인딩 버퍼와 비활성화 전염 성 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 모든 분자 분석 결과에 광범위 하 게 적용할 수 있습니다. 혈액 비활성화 및 나 추출에 대 한 워크플로 나온 그림 1혈액 컬렉션 진공관7 (그림 1A), 혈액 컬렉션7 (그림 1B), 나 추출 ( 준비 등 그림 1 c - 1 H), 및 다운스트림 나 분석 (그림 1I).
단순화 나 추출 프로토콜 때문에 MGPs 차입 단계에서 제거 되지 않습니다 그리고, 따라서, NAs는 MGPs에 충실 하는 경향이 있다. 모든 다운스트림 분자 분석, 정량 등 램프 분석, 직접 MGPs (그림 1I 및 그림 2) 긍정적인 결과 보장 하에 수행 되어야 합니다.
나 추출 방법은 바이러스 부하 130 3000 복사본/mL 추출 될 수 있다 고 분석 정량 또는 실시간 정량 (그림 3)를 사용 하 여 낮은 효율, 그리고 RNA 또는 DNA-바이러스-양성 전 혈 샘플입니다.
나 추출 방법, 램프 또는 RT-램프, 및를 사용 하는 휴대용 배터리 구동 등온선 장치 바이러스 양성 전 혈 샘플에 대 한 진단 혈액 컬렉션 (그림 4)에서 40 분 이내 얻을 수 있습니다.
그림 1 : 전체 혈액 샘플의 단순화 나 추출 워크플로. (A) 준비 세포/바인딩 버퍼 진공 혈액 컬렉션 바늘과 주사기를 사용 하 여 튜브. (B) 피 나비 바늘을 사용 하 여 수집 합니다. (C) 장소 혈액 컬렉션 튜브 홀더, 뚜껑, 제거 하 고는 MGPs 튜브에 붓는 다. (D) 새로운 뚜껑 튜브 닫고 손으로 튜브를 틀 지 하 여 콘텐츠를 혼합 합니다. (E) 자석 홀더에 튜브를 내리고 여 혈액 컬렉션 튜브 측면 MGPs 수집 합니다. (F) 제거 일회용 피 펫을 사용 하 여 상쾌한. (G) 세척 또는 차입 버퍼 혈액 컬렉션 튜브에 직접 부 어 고 패널 D - F에 표시 된 작업을 반복 합니다. (H)이이 패널에서는 MGPs 직접 사용에 대 한 준비는 정량 실시간 정량, 램프, 또는 RT 램프 반응. (나) 전송 하나의 작은 물방울 (5-8 µ L) MGPs의 1.5 mL 일회용 피 펫을 사용 하 여 PCR 또는 램프 반응 관에. A 와 B패널:이 그림 Rosenstierne 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다 7. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 28 바이러스 양성 전 혈 샘플 단순화 나 추출 메서드를 사용 하 여 추출의 나 탐지. 전체 혈액 샘플 (1.6 mL) 시험된 네거티브 바이러스 했다 어느 DNA 바이러스와 아군에 대 한 [엡 스타인-바 바이러스 (EBV) (2.0 x 104 -3 부/10ml x 1.0)] 또는 RNA 바이러스 [C 형 간염 바이러스 (HCV) (6.0 x 105 -3 부/10ml x 3.0)] 뎅기열 바이러스 (DENV) 또는 (1.7 x 108 -6 복사본/10ml x 1.7). NAs, 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 추출한 고 추출 된 NAs 했다 분석 중복에서 특정 사내 정량, RT-PCR, 램프, 또는 RT-램프, MGPs 없이. X-축 나 검출 방법, y=-축 정량/램프에 긍정적인 샘플의 백분율 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 단순화 나 추출 방법의 감도. 방법의 개념 증명 바이러스 부정적인 전체 혈액은 다른 RNA 또는 DNA 바이러스 준비 포함 하는 정의 된 바이러스 부하와 함께 아군 및 NAs 단순화 나 추출 방법을 사용 하 여 추출 되었다. (A) 부정적인 전 혈 (1.4 mL) 200 µ L 10 희석 EBOV 표준 진단 목적 (ENIVD)에 대 한 준비는 Guéckédou/기니 (2.0 x 106 복사본/mL)에서 최근 발생에서 준비 된의와 함께 아군 이었다. 추출 된 NAs 중복에서 사용 하 여 MX3005P 열 cycler는 사내 EBOV 전용 실시간 정량 Pcr7 에 의해 분석 되었다. (B) 전 혈 (1.2 mL)는 HCV 누가 표준된 혈 청 샘플의 10 희석의 400 µ L로 아군은 (1.2 x 106 IU/mL). 추출 된 NAs는 사내 HCV 관련 RT-정량 MX3005P 열 cycler를 사용 하 여 중복에서 분석 되었다. (C) 전 혈 (1.2 mL) (4 부/10ml x 2.0,3 부/10ml x 8.0, 103 복사본/mL, x 2.7 및2 복사본/10ml x 9.3) EBV의 다른 농도의 400 µ L로 아군 이었다. 추출 된 NAs는 사내 EBV 관련 정량에 의해 중복에서 분석 되었다. (D) 전 혈 (1.2 mL) BK 바이러스 (4 복사본/10ml x 1.3)의 10 희석의 400 µ L로 아군 이었다. 추출 된 NAs는 사내 보 리 전용 정량에 의해 중복에서 분석 되었다. X-축 (복사본/mL 또는 IU/mL), 아군된 전체 혈액 샘플에서 바이러스의 최종 농도 = y-축 = Ct 값 (평균 ± SD). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 나 추출 및 RT-램프 또는 램프 휴대용 등온선 장치를 사용 하 여 간체. (A) 바이러스 학과 & 미생물 특별 진단, Statens 혈 청 인, 덴마크 EBOV 긍정적인 전체 혈액 샘플의 부족, 부정적인 전체 혈액의 1.4 mL는 EBOV의 다른 희석의 200 µ L로 아군은 표준 진단 목적 (ENIVD)에 대 한 준비입니다. 아군된 샘플 나 추출 단순화 나 추출 방법을 사용 하 여 수술 하 고 EBOV 관련 RT-램프 반응에 의해 분석 되었다. 부정적인 통제로 부정적인 전체 혈액 샘플 포함 되었다. X-축 EBOV의 최종 농도 아군된 전체 혈액 샘플 (복사본/mL), y=-축 = 긍정을 분. (B) 개념의 증거, 7 환자에서 전 혈 (1.6 mL) aliquots 진단 바이러스 학과 & 미생물 특별 진단, Statens 혈 청 인, 덴마크, EBV (13000-500 복사본/mL)에 대 한 긍정적인 받았다는 없음을 추출 단순화 나 추출 방법을 사용 하는 휴대용 배터리 구동 요정 II 등온선 장치를 사용 하 여 EBV 관련 램프 반응 분석 했다. 네거티브 컨트롤로 Parvo B19-긍정적인 샘플 포함 되었다. X-축 EBV의 바이러스 부하 환자 샘플 (복사본/mL), y=-축 = 긍정을 분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 보고서에서 우리는, 신속, 안전 하 고 간단한 수동 침대 나 추출 방법 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액에서 바이러스의 다운스트림 분자 검출에 대 한 설명합니다. 직접 세포/바인딩 버퍼 (자료 테이블)7를 포함 하는 진공 혈액 컬렉션 튜브에 수집 된 전체 혈액 샘플에 수행 되어야 할 설명된 나 추출 방법 개발 되었다. 이 특정 버퍼 EBOV7 생긴다 고 방법의 중요 한 구성 요소입니다. 혈액 수집 후 적어도 20 분7 튜브 샘플의 완전 한 비활성화를 위해 배양 하는 것이 좋습니다. 머리 맡 EBOV 비활성화 BSL-4 조건 등 엄격한 제약 조건 하에서 어떤 EBOV 긍정적인 샘플 처리에 대 한 필요성을 제거 하 고 정상 BSL-2 조건 처리 샘플 있습니다. 그것은 다른 위험 그룹 4 개의 병원 체, 같은 Lassa 바이러스, Marburg 바이러스, 및 크림 콩고 출혈 성 열 바이러스 또한이 버퍼에 의해 비활성화 됩니다만이 표시를 남아 있습니다.
설명된 나 추출 방법 병원 또는 병원 격리 병 동에서 환자 옆 수행을 개발 하며, 따라서, 실험실 장비, 원심 분리기, 난방 블록, 전기 등. 모든 것 나 추출 방법 튜브 MGPs 또는 워시 버퍼, 자석 홀더, 및 처분할 수 있는 펫의 고정된 볼륨을 포함 하는 필요 합니다. 포함 하는 버퍼 튜브의 사전 준비 때문에 펫에 대 한 필요성을 제거 하 고 aliquoted 버퍼 샘플 튜브에 직접 부 어 하는 대신, 프로토콜을 단순화 합니다. 자석 홀더 잡는 MGPs는 NA를 포함 하 고 세척 단계를 쉽게 처리를 중재. 자석 홀더는 경우에 일반 자석 및 고무 밴드 자석 홀더를 대용 될 수 있다 그러나, 자석 홀더 튜브를 삭제 하 고 자석 및 고무 밴드를 적용할 때 내용을 흘리 고의 실제 위험을 줄여줍니다. 세포/바인딩 버퍼 비활성화 전체 혈액 샘플의 점성으로 인해 일회용 펫 튜브에서 상쾌한/액체/워시 버퍼를 제거 하는 데 사용 됩니다. 일회용 펫 폐기물 수집 튜브에 튜브에서 내용 직접 붓는 의해 대체 될 수 있습니다 하지만 튜브 외부 모든 방울을 만들 수 없습니다 유의 하시기 바랍니다. 방울을 만든 경우 오염 된 표면 해야 합니다 절대 소독 되어야 chloramine 또는 염소 ("표 백제"의 활성 성분)와 직접이 혼합물 독성 시안 화물의 형성으로 이어질 수 있기 때문에. 따라서, 먼저 유출 하는 경우는 흡수 성 조직으로 유출을 닦아냅니다. 다음, 충분 한 물, 그리고 70% 에탄올으로 표면 청소 하 고 마지막으로, chloramine 또는 나트륨 차 아 염소 산을 사용 하 여. 모든 폐기물 (폐기물 수집 튜브 및 일회용 펫 포함) 세포/바인딩 버퍼 접촉 된 포함 됩니다. 대신, 별도 폐기물 컨테이너에 있는 모든 폐기물을 수집 하 고 70% 에탄올과 컨테이너의 외부만 소독.
NAs는 일반적으로 eluted MGPs는에서 난방 단계 동안 하지만이 난방 단계 전기 및 장비를 사용 하 여 제거 하는 단순화 된 나 추출 프로토콜에서 제거 되었습니다. 따라서, NAs MGPs는, 그러므로, 긍정적인 나 검색에 대 한 다운스트림 나 탐지 분석 결과에 추가 되어야 합니다에 집착 하는 경향이 있다. MGPs는 1.5 mL 일회용 피 펫에서 한 방울을 사용 하 여 다운스트림 반응 혼합 전송 됩니다. 이 추가 지 느 러 미 끝 피 펫;를 사용 하 여 정상적인 또한 정확 하지 않습니다. 그러나, unprecise 추가 없음/MGPs는 램프에,의 RT-램프, 정량, 또는 실시간 정량 Pcr 반응 혼합 하지 않습니다 반응 억제 또는 우리의 사내 진단 분석 결과 형광 신호에 영향을 미칠. 그럼에도 불구 하 고,이 분석에서 분석 결과 다를 수 있습니다 그리고 모든 다운스트림 나 테스트 검증 하 고 분석 결과의 감도 단순화 나 추출 방법을 사용 하 여 테스트 하는 것이 좋습니다. 나 추출 방법은 상대적으로 민감하고 DNA 또는 RNA 바이러스 낮은 3000 복사본/mL 수 있습니다 쉽게 추출 하 고 정량 등 다운스트림 분자 검사에서 발견을 포함 하는 전체 혈액 샘플. 임상 견본에서 바이러스 부하 일반적으로 매우 높은 감염의 급성 단계 동안 그리고는 EBOV 같은 출혈 성 열 바이러스, Lassa 바이러스, 및 크림 콩고 출혈 성 열 바이러스, 일반적으로 10 개 이상의5 복사본/mL9 포함 10,11. 따라서이 샘플에서 바이러스 쉽게 검색할 수 있습니다이 나 추출 방법을 사용 하 여. 그러나, MPLB 비활성화 EBOV7, Vaccinia, 및 Cowpox 바이러스의 바이러스8 표시를 남아 있다.
단순화 된 나 추출 방법 병원 격리 병 동에 또는 필드 설정에서 수행할 수 있습니다 하 고 포인트의 케어 분자 진단에 대 한 이상적 이다. 그러나, 메서드가 열려 튜브의 실제적인 처리로 인해 높은 처리량 나 기사에 대 한 적용 되지 않습니다. 높은 처리량 나 기사 필요 하면 사 전체 혈액 샘플 쉽게 나 추출 로봇7를 사용 하 여 정화 될 수 있습니다. 또 다른 단점은 세포/바인딩 버퍼 [20-30% 폴 리 에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-페 닐 에테르 및 30-50 %guanidinium 안산 (GITC)]17 와 워시 버퍼 같은 유해한 시 약의 처리 나 (30-50 %guanidinium 염화 물) 흐름 후드 외부 오픈 관에17 . 혈액 1: 1의 컬렉션 (v/v)와 진공 튜브 내 집중 형태로 세포/바인딩 버퍼 포함, 튜브 열리기 전에 농도 감소 된다. 여 진공 튜브 및 MGPs 또는 워시 버퍼의 추가/제거의 난 몇 초 이내에 수행 되 고, 따라서,에 어로 졸의 흡입의 위험이 최소화 됩니다. 워시 버퍼의 제거 후-나, 튜브에서 다른 유해한 시 약 프로토콜에 사용 됩니다.
많은 빠른 포인트의 케어 분자 테스트 및 장치 20133,6,12,13,,1415,16 EBOV 발발 이후 개발 되었습니다. . 그러나, 이러한 테스트의 많은 여전히 전염 성 소재, BSL-3 biosafety 캐비닛, 그리고 최소, 실험실 장비, 펫, 원심 분리기, 난방 블록, 또는 전기 등에서 최대 스트림 처리 필요. Biosafety 캐비닛을 사용 하 여 복잡 하 고 급속 한 진단 연장. 단순화 된 나 추출 방법으로 결합 된 바이러스 비활성화 튜브로 혈액의 직접 컬렉션 설명된 머리 맡 바이러스 비활성화 biosafety 캐비닛, 전기, 및 실험실 시설에 대 한 필요가 없습니다. 또한, 수 있기 때문에 단순화 된 나 추출 방법 수 수행 환자 옆 휴대용 배터리 구동 등온선 장치에 램프 반응 결합, 안전 침대 분자 진단 40 분 내에서 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
그들의 기술 지원 및 임상 샘플 처리에 대 한 우리 감사 수잔 달리기 라 스무 센 및 Solvej Kolbjørn 젠 슨. 이 프로젝트는 혁신적인 의학 이니셔티브 2 공동 사업 보조금 계약 N ° 115843 아래에서 자금을 받고 있다 EbolaMoDRAD 컨소시엄의 일부입니다. 이 공동 사업 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 EFPIA에서 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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