Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die schnelle Virus Nukleinsäure-Extraktion aus der Vollblut-Virus inaktiviert. Die Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom. Die Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und kann überall (z.B.in Feldlazaretten) verwendet.
Abstract
Die schnelle Diagnose einer Infektion ist entscheidend für den Ausbruch Management, Risiko Containment und Patientenversorgung. Wir haben zuvor eine Methode für die schnelle am Krankenbett Inaktivierung des Ebola-Virus während der Blutentnahme für sichere Nukleinsäure (NA) Tests gezeigt, indem man einen kommerziellen Lyse/Bindung Puffer direkt in das Vakuum Blutentnahmeröhrchen. Mit diesem Ansatz am Krankenbett Inaktivierung, entwickelten wir eine sichere, schnelle und vereinfachte am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die spätere Entdeckung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktion erfolgt direkt in die Blutentnahmeröhrchen und erfordert keine Ausrüstung oder Strom.
Nachdem das Blut in den Lyse/Bindung Puffer gesammelt, die Inhalte werden durch Umklappen das Rohr von hand gemischt und die Mischung wird für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Magnetische Glaspartikeln (Map) werden hinzugefügt, um das Rohr, und der Inhalt sind durch Umklappen das sammelröhrchen von hand gemischt. Die Map werden dann auf der Seite das blutsammelröhrchen mit einem Magnethalter oder ein Magnet und ein Gummiband gesammelt. Die Map werden dreimal gewaschen, und nach der Zugabe der Elution Puffer direkt in das sammelröhrchen, die NAs sind bereit für NA-Tests, wie qPCR oder Isothermen Schleife Verstärkung (Lampe), ohne die Entfernung von der Map aus der Reaktion. Die NA-Extraktions-Verfahren ist nicht abhängig von jedem Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten und Krankenhaus Isolierstationen) verwendet. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares Gerät kombiniert wird, erhalten Sie eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.
Introduction
In Virus Ausbruch Situationen wenn Patienten auf das Krankenhaus Isolierstationen oder wenn eine schnelle Diagnose benötigt wird beschränkt sind, ist eine sichere, einfache und genaue Molekulare Diagnostik der Point-of-Care unerlässlich, dass die Patienten Pflege und Risiko Containment. Die zwei jüngsten virale Ausbrüche, das Ebola-Virus (EBOV) in Westafrika (2013) und der Zika-Virus in Südamerika (2015), haben das Interesse an verbesserte Point-of-Care Molekulare diagnostische Tests, wie z. B. reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen erhöht. Verstärkung (RT-Lampe)1,2 und Rekombinase Polymerase Verstärkung (RPA)3,4. RT-Lampe und RPA sind schnelle, sensitive und spezifische Molekulare Tests, die auf vereinfachtes Beispiel Vorbereitungen durchgeführt werden können. Für das Zika-Virus wurde RT-Lampe mit einem lateralflow-Assay (LFA), kombiniert die Zika-Virus in Vollblut-gereinigte Proben innerhalb von 30 min1erkennen kann; für EBOV, das ist ein Risiko-Gruppe 4-Pathogen eingestuft und ist hoch ansteckend, die Proben müssen jedoch unter Biosafety behandelt werden Stufe 4 (BSL-4) Bedingungen und inaktiviert werden, bevor eine sichere diagnostischen Verfahren durchgeführt werden können.
Vereinfachte Inaktivierungsverfahren für EBOV, wie die Zugabe von Lyse Puffer auf die Probe2,3,4,5, dienten während des Ausbruchs; Diese Methoden erfordern jedoch Handhabung BSL-4 Bedingungen mit Laborgeräten, wie BSL-3 Biosafety Schränke, Zentrifugen, Heizblöcke und Pipetten, auf ein Minimum. Dieses Gerät ist normalerweise nicht vorhanden, Isolierstationen oder in Feldlazaretten. Um diese Herausforderung zu meistern, wurden Versuche unternommen, im Koffer3Diagnostik durchzuführen, und mehrere tragbare Geräte und Maschinen wurden entwickelt [z. B.ein tragbares Gerät zur Gewinnung von Nukleinsäure (NA)]6. EBOV-positiven Proben müssen jedoch noch inaktiviert werden, bevor diese Geräte verwendet werden können.
Wir haben zuvor eine schnelle am Krankenbett Virus-Inaktivierung-Methode zur EBOV7, Vaccinia Virus und Kuhpocken-Virus8 durch Zugabe eines kommerziellen Lyse/Bindung-Puffers zu gewöhnlichen Vakuum Blutentnahmeröhrchen, berichtet ermöglicht den direkten Übertragung von Blut aus dem Patienten in die Inaktivierung Puffer7. Diese direkte und sofortige Inaktivierung in einem geschlossenen System eliminiert die Notwendigkeit für die Proben unter Verwendung strikte Einschließung, z. B. BSL-4 Bedingungen7, Handhabung und die Proben können unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Diese Inaktivierung Methode ist kompatibel mit mehreren NA Absauganlagen, wie Roboter und Hand-Reinigung-Kits-7; Diese Methoden erfordern jedoch Laborgeräte wie Roboter, Zentrifugen und Elektrizität, die nicht immer in den Bereich Einstellungen oder im Krankenhaus Isolierstationen vorhanden sind.
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und vereinfachte manuelle NA Extraktionsmethode für die anschließende molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die NA-Extraktions-Verfahren erfordert keine Geräte außer einem Magnet/Magnethalter. Für die NA-Extraktion werden keine Zentrifugen, Heizung, Blöcke oder Strom benötigt. Daher, diese Methode ist nicht abhängig von Laboreinrichtungen und lässt sich problemlos überall (z.B.in Feldlazaretten in Isolation Krankenstationen oder mit geringen Ressourcen Einstellungen) verwendet. Die NA-Extraktions-Verfahren ist schnell und einfach und kann direkt in alle nachgelagerten NA-Tests wie qPCR, RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe verwendet werden. Wenn diese NA-Extraktions-Verfahren mit Lampe und ein tragbares batteriebetriebenes Isothermen Instrument kombiniert wird, erhalten Sie eine Nachttisch Diagnose innerhalb von 40 Minuten die Blutentnahme.
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Protocol
Der Ausschuss für biomedizinische Forschungsethik, Hauptstadtregion Einwilligung gegeben hat, und alle hier beschriebene Verfahren befreit aus einer Überprüfung durch die Ethik-Ausschuß-System gemäß dem dänischen Gesetz über Assay-Entwicklung-Projekte.
1. Vorbereitung des Vakuum Blutentnahmeröhrchen für Virus-Inaktivierung und schnellen NA-Extraktion
Achtung: Der Puffer verwendet für dieses Protokoll enthält Guanidinium-Thiocyanat (GITC) und nichtionischen Tensiden, die Reizstoffe sind. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. Wenn der Puffer verschüttet ist, muss die zu reinigende Oberfläche nie direkt mit Chloramin oder Natriumhypochlorit (die Wirkstoffe in "Bleach") desinfiziert werden, da diese Mischung zu der Bildung von toxischen Zyanid führen kann. Erstens die verschüttete Puffer mit einem saugfähigen Tuch aufwischen. Anschließend reinigen Sie die Oberfläche mit 70 % Ethanol und dann mit Wasser und schließlich Chloramin oder Natriumhypochlorit.
- Um das Vakuum Blutentnahmeröhrchen vorzubereiten, injizieren Sie 1,6 mL des Puffers bestimmten kommerziellen Lyse in einer Vakuumröhre 4 mL EDTA durch Punktion des Deckels des Röhrchens mit einer 25 x 1 Nadel und einer Spritze 3 mL.
Hinweis: Nehmen Sie nicht den Deckel von der Vakuum-Röhre. Das Vakuum muss eingehalten werden. - Die Vakuum-Röhren, enthält des Puffers bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern.
Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Jahr nach ihrer Herstellung stabiler.
2. Vorbereitung der Puffer für die NA-Extraktion
- Die Puffer für eine NA-Extraktion, Platz zwei 1,8 mL, zwei 4,5 mL und einem 3,6 mL Röhrchen in einem Rack vorzubereiten.
- Durch pipettieren, 960 µL des magnetischen Glaspartikeln (Map) eine saubere 1,8 mL Tube und Label mit Map. Aufschwemmen die MGP-Aufhängung komplett vor pipettieren sie hinzufügen.
Hinweis: Die Map neigen dazu, schnell an der Unterseite des Rohres zu sammeln. - Fügen Sie durch pipettieren, 4 mL Waschpuffer ich zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und beschriften Sie sie als WB-1.
Achtung: Waschpuffer I enthält Guanidinium Chlorid, das reizend ist. In geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen ergreifen, verwenden eine Fluss-Haube und Handschuhe beim Umgang. Vermeiden Sie Haut- und Augenkontakt. - Hinzufügen von pipettieren, 1,5 mL Waschpuffer II zu einem sauberen 3,6 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-2.
- Hinzufügen von pipettieren, 3 mL Waschpuffer III zu einem sauberen 4,5 mL Schlauch und bezeichnen es als WB-3.
- Fügen Sie durch pipettieren, 100 µL der Elution Puffer, um eine saubere 1,8 mL-Tube und beschriften Sie sie als EB.
- Die regelmäñig Puffer bei Raumtemperatur bis zu seiner Verwendung zu speichern.
Hinweis: Die Rohre sind für mindestens 1 Monat nach ihrer Herstellung stabiler.
3. Blutentnahme von Patienten mit Anzeichen und Symptome einer Virusinfektion
Achtung: Ergreifen Sie in geeigneten Laboratorien Schutzmaßnahmen, wenn Vollblut des Patienten zu sammeln. Tragen Sie Handschuhe und Brille. Wenn der Patient isoliert ist, folgen Sie bitte Biosafety Niveau 4 Verfahren.
- Um intravenöse Vollblut des Patienten zu sammeln, verwenden Sie eine Butterfly-Nadel mit KK Verlängerungsschlauch und einer Blut Sammlung Vakuumröhre, Lyse/Bindung Puffer enthält. Den Arm des Patienten in eine nach unten gerichtete Position ausruhen und dem Sammelrohr niedriger als der Butterfly-Nadel zu positionieren. Schmetterling Nadel in die Vene des Patienten und die KK-Erweiterung der Blut-Sammlung-Vakuum-Röhre beimessen.
Hinweis: Dies verhindert Rückfluss. - Mischen Sie nach der Blutentnahme den Inhalt des Röhrchens durch Umklappen der Röhre 5 - 10 mal.
Hinweis: Durch den restlichen Unterdruck in dem Blut Sammelrohr, 1,6 mL Lyse/Bindung Puffer enthält, wird das Volumen der Probe erfasst automatisch 1,6 mL sein. - Desinfizieren Sie die Außenseite des Schlauches mit 70 % Ethanol.
- Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die volle Blutentnahmeröhrchen können bei-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C und 37 ° C für mindestens 1 Monat7gelagert werden. - Weiterhin die vereinfachte NA-Extraktions-Verfahren.
4. vereinfachte NA Extraktion des Vollblutes
- NA aus dem Lyse/Bindung Puffer-inaktivierten gesammelten Blut, Mischung zu reinigen Rohr den Inhalt des Röhrchens durch Umlegen des Vakuums von hand 5-10 X.
- Entfernen Sie vorsichtig den Deckel des Rohres und Entladen Sie den Deckel zu.
- Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten Map (1 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
- Legen Sie einen neuen Deckel aus einer ungenutzten Blut Sammelrohr auf das Rohr mit der Probe.
- Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist und den Inhalt des Rohres durch Umklappen das blutsammelröhrchen 5-10 mal von hand mischen.
- Legen Sie das Rohr in den Magnet Holder und halten Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
- Flip-Magnethalter mit dem Rohr ein paar Mal von Hand um sicherzustellen, dass die Map auf der Seite des Rohres mit dem Magneten gesammelt werden.
Hinweis: Der Magnethalter kann mit einem länglichen Magneten und einem Gummiband ersetzt werden. - Entfernen Sie den Deckel des Rohres und verwerfen Sie den Inhalt des Rohres mit einer Einweg-Pipette oder einfach durch Gießen den Inhalt in ein Sammelrohr 50 mL.
Hinweis: Vermeiden Sie Aerosole aus dem Sammelrohr 50 mL durch das Rohr mit einem Deckel schließen. - Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-1 (4 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf die Tube und legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
- Entfernen Sie das Rohr aus der Magnethalter, dabei den Deckel fest angezogen mit einem Finger.
Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube. - Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.
- Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten WB-2 (1,5 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube. - Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
- Aufschwemmen der Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen für ein paar Sekunden von hand.
- Wiederholen Sie Schritt 4.6-4.8.
- Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten von WB-3 (3 mL) direkt in das blutsammelröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube. - Legen Sie einen Finger auf den Deckel, um sicherzustellen, dass der Schlauch fest verschlossen ist.
- Die Map durch Umklappen das blutsammelröhrchen eigenhändig 5-10mal aufzuwirbeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.8.
- Gießen Sie die vorbereiteten aliquoten EB (100 µL) direkt in das blutsammelröhrchen.
- Setzen Sie den Deckel auf das Rohr und entfernen Sie das Rohr aus der magnetischen Halterung zu.
Hinweis: Wenn ein Magnet und ein Gummiband verwenden, entfernen Sie einfach das Gummiband und Magnet aus der Tube. - Aufschwemmen der Map in der EB durch das blutsammelröhrchen 5-10 mal mit dem Finger antippen.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten, und die Rohre können bei-20 ° c gelagert werden - Übertragen Sie einen Tropfen (5-8 µL) der resuspendierte Map in den nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion Mix mit einer Einweg-1,5 mL-Pipette (keine nachgeschalteten diagnostische NA Verstärkung assay wie RT-Lampe oder qPCR/RT-qPCR-Assays verwendet werden können).
Hinweis: Das NAs wird halten Sie sich an die Map, so sicher sein, verwenden Sie die Map in der nachgelagerten NA Verstärkung Reaktion. Mischen Sie die MGP Suspension vor dem Gebrauch. Nach dem Mischen werden die Map an der Unterseite des Rohres sammeln.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Protokoll ist einfach und effizient und kann auch im großen und ganzen auf eine molekulare Assay auf infektiöse Vollblut Proben mit dem Puffer Lyse/Bindung inaktiviert durchgeführt werden. Der Workflow für die Inaktivierung von Blut und NA-Extraktion ist in Abbildung 1, einschließlich der Vorbereitung von Blut Sammlung Vakuumröhren7 (Abbildung 1A), die Blut Sammlung7 (Abbildung 1 b), die NA-Extraktion ( dargestellt. Zahlen 1 - 1 H), und die nachgelagerten NA-Analyse (Abbildung 1I).
Aufgrund der vereinfachten NA-Extraktion-Protokoll der Map werden nicht aus der Elution Schritt entfernt und daher tendenziell das NAs an der Map zu halten. Alle nachgeschalteten Molekulare Analysen, wie z.B. qPCR oder Lampe Analyse muss direkt auf der Map (Abbildung 1I und Abbildung 2), um ein positives Ergebnis zu gewährleisten erfolgen.
Die NA-Extraktions-Verfahren ist effizient und RNA oder DNA-Virus-positiven Vollblut-Proben mit Viruslast so niedrig wie 130-3.000 Kopien/mL extrahiert können und analysiert mit qPCR oder RT-qPCR (Abbildung 3).
Mit der NA-Extraktionsmethode, Lampe oder RT-Lampe und einem tragbaren batteriebetriebenen Isothermen Gerät für Vollblut Virus-positiven Proben, eine Diagnose innerhalb von 40 Minuten von der Blutentnahme (Abbildung 4) erhalten.
Abbildung 1 : Workflow für vereinfachte NA Gewinnung von Vollblut-Proben. (A) vorbereiten, die der Lyse/Puffer Vakuum Blut Bindungsauflistung Röhren mit einer Nadel und einer Spritze. (B) sammeln das Blut mit Hilfe einer Butterfly-Nadel. (C) das blutsammelröhrchen in einer Halterung entfernen Sie den Deckel, und Gießen Sie die Map in die Röhre. (D) das Röhrchen mit einem neuen Deckel verschließen und den Inhalt durch Umklappen das Rohr von hand mischen. (E) sammeln die Map auf der Seite das blutsammelröhrchen durch Umklappen der Röhre in den Magnet Holder. (F) Entfernen der Überstand mit einer Einweg-Pipette. (G) waschen oder Elution Puffer direkt in das blutsammelröhrchen Gießen und wiederholen Sie die Aktionen in Platten D - Fgezeigt. (H) dieses Panel zeigt Map bereit für den direkten Einsatz in einem qPCR RT-qPCR, Lampe oder RT-Lampe Reaktion. (ich) Übertragung einen Tropfen (5-8 µL) der Map, eine PCR oder Lampe Reaktionsgefäß mit einer Einweg-1,5 mL-Pipette. A und B-Panel: Diese Zahl verändert wurde, von Rosenstierne Et Al. 7. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : NA Erkennung von 28 Vollblut Virus-positiven Proben mit der vereinfachten NA-Extraktions-Verfahren extrahiert. Vollblut Proben getestet negativ (1,6 mL) für ein Virus waren gespickt mit entweder einem DNA-Virus [Epstein - Barr-Virus (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 Kopien/mL)] oder ein RNA-Virus [Hepatitis C Virus (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 Kopien/mL)] oder ein Dengue-Virus (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 Kopien/mL). NAs mit dem oben beschriebenen Verfahren extrahiert wurden, und die extrahierten NAs analysiert wurden in zweifacher Ausfertigung durch spezifische interne qPCR, RT-PCR, Lampe oder RT-Lampe, mit oder ohne map. Die X-Achse = NA Nachweisverfahren, die y-Achse = den Anteil der Proben positiv qPCR/Lampe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Empfindlichkeit der vereinfachten NA Extraktionsmethode. Ein Proof of Concept der Methode Virus negative Vollblut war gespickt mit verschiedenen RNA oder DNA-Virus Zubereitungen, die eine definierte Viruslast und NAs mit der vereinfachten NA-Extraktions-Verfahren extrahiert wurden. (A) Negative Vollblut (1,4 mL) war gespickt mit 200 µL 10-divisibel Verdünnungen der EBOV Norm vorbereitet zu diagnostischen Zwecken (ENIVD), die aus den jüngsten Ausbruch in Guéckédou/Guinea (2,0 x 106 Kopien/mL) zubereitet wurde. Die extrahierten NAs wurden in zweifacher Ausführung durch eine hauseigene EBOV-spezifische RT-qPCR7 mit einer MX3005P-Thermocycler analysiert. (B) Vollblut (1,2 mL) war gespickt mit 400 µL 10-divisibel Verdünnungen von einem HCV, die standardisierte Serumprobe (1,2 x 106 IU/mL). Die extrahierten NAs wurden in zweifacher Ausfertigung durch eine hauseigene HCV-spezifische RT-qPCR mit einem MX3005P Thermocycler ausgewertet. (C) Vollblut (1,2 mL) war mit 400 µL der verschiedenen Konzentrationen von EBV (2.0 x 104 Kopien/mL, 8.0 x 103 Kopien/mL, 2,7 x 103 Kopien/mL und 9,3 x 102 Kopien/mL) versetzt. Die extrahierten NAs wurden in zweifacher Ausführung durch eine hauseigene EBV-spezifische qPCR analysiert. (D) Vollblut (1,2 mL) war mit 400 µL 10-divisibel Verdünnungen eines BK-Virus (1,3 x 104 Kopien/mL) versetzt. Die extrahierten NAs wurden in zweifacher Ausführung durch eine hauseigene BK-spezifische qPCR analysiert. Die X-Achse = Endkonzentration von einem Virus in der Spike Vollblut-Probe (Kopien/mL oder IU/mL), der y-Achse = Ct-Wert (Mittelwert ± SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Vereinfacht NA Extraktion und RT-Leuchte oder Lampe mit einem tragbaren Gerät Isothermen. (A) aufgrund der fehlenden EBOV-Positive Vollblut Proben bei der Abteilung des Virus & spezielle mikrobiologische Diagnostik, Statens Serum Institut, Dänemark, 1,4 mL der negativen Vollblut war gespickt mit 200 µL der verschiedenen Verdünnungen von der EBOV Standard für diagnostische Zwecke (ENIVD) vorbereitet. Die Spikes Proben unterzog sich eine NA-Extraktion mit der vereinfachten NA Extraktionsmethode und analysiert wurden durch eine EBOV-spezifische RT-LAMP-Reaktion. Als Negativkontrolle wurde eine negative Vollblut-Probe aufgenommen. Die X-Achse = Endkonzentration von EBOV in der Spike Vollblut-Probe (Kopien/mL), der y-Achse = min auf positiv. (B) für ein Proof of Concept, Vollblut (1,6 mL) Aliquote von 7 Patienten diagnostiziert positiv für EBV (13.000-500 Kopien/mL) im Department des Virus & spezielle mikrobiologische Diagnostik, Statens Serum Institut, Dänemark, unterzog sich einer NA Extraktion mit der vereinfachten NA-Extraktions-Verfahren und wurden durch eine EBV-spezifische LAMP-Reaktion mit dem tragbaren batteriebetriebenen Genie II Isothermen Gerät analysiert. Als Negativkontrolle wurde eine Parvo B19-positiven Probe aufgenommen. X-Achse = die Viruslast des EBV in einer Patientenprobe (Kopien/mL), der y-Achse = min auf positiv. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir eine sichere, schnelle und einfache manuelle am Krankenbett NA Extraktionsmethode für die nachgelagerten molekulare Erkennung eines Virus im Vollblut Lyse/Bindung Puffer inaktiviert. Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um direkt auf Vollblut-Proben im Vakuum Blutentnahmeröhrchen, enthält die Lyse/Bindung Puffer (Table of Materials)7durchgeführt werden. Dieser spezielle Puffer inaktiviert EBOV7 und ist die entscheidende Komponente in der Methode. Nach der Blutentnahme empfiehlt es sich, Inkubation der Röhre für mindestens 20 min7 um eine vollständige Inaktivierung der Probe zu gewährleisten. Am Krankenbett EBOV Inaktivierung eliminiert die Notwendigkeit für den Umgang mit jedem EBOV-positiven Proben unter strikter Einschluss Bedingungen, z. B. BSL-4, und kann die Proben unter Normalbedingungen BSL-2 behandelt werden. Es ist wahrscheinlich, dass andere Risiko-Gruppe vier Erreger, wie z. B. das Lassa-Virus, Marburg-Virus und das Krim-Kongo-hämorrhagisches Fieber-Virus sind auch durch diesen Puffer inaktiviert, aber dies noch gezeigt werden.
Die beschriebenen NA-Extraktions-Verfahren wurde entwickelt, um neben einem Patienten in einem Krankenhaus Isolierstation oder in einem Feldlazarett durchgeführt werden und erfordert daher keine Laborgeräte wie Zentrifugen, Heizblöcke oder Strom. Alles, was erfordert die NA-Extraktions-Verfahren Rohre, die ein bestimmtes Volumen der Map oder waschen Puffer, ein Magnethalter und Einweg-Pipetten enthalten sind. Die Pre-Vorbereitung der Rohre mit Puffer vereinfacht das Protokoll, da es die Notwendigkeit für Pipetten entfällt, und stattdessen die regelmäñig Puffer sind direkt in das Probenröhrchen gegossen. Der Magnethalter fängt die Map mit der NA und eine einfache Handhabung der Wäsche Schritte vermittelt. Der Magnethalter kann mit einem normalen Magneten und einem Gummiband ersetzt werden, für den Fall, dass ein Magnet Holder nicht verfügbar ist; der Magnethalter reduziert jedoch die praktische Gefahr fallen das Rohr und den Inhalt zu verschütten, bei der Anwendung der Magnet und Gummiband. Aufgrund der Viskosität der Lyse/Bindung Puffer-inaktivierten Vollblut Probe sind Einweg-Pipetten verwendet, um die überstand/Flüssigkeit/Waschgang Puffer aus der Tube zu entfernen. Einweg-Pipetten können durch eine direkte Gießen den Inhalt aus dem Rohr in eine Müllabfuhr-Rohr ersetzt werden, aber bitte beachten Sie nicht, irgendwelche Tröpfchen außerhalb der Röhre zu schaffen. Tröpfchen entstehen, muss die zu reinigende Oberfläche nie direkt mit Chloramin oder Natriumhypochlorit (die Wirkstoffe in "Bleach") desinfiziert werden, da diese Mischung zu der Bildung von toxischen Zyanid führen kann. Daher, wenn zuerst verschüttet, wischen Sie den Überlauf mit einem saugfähigen Tuch. Anschließend reinigen Sie die Oberfläche mit 70 % Ethanol und dann mit viel Wasser und zu guter Letzt Chloramin oder Natriumhypochlorit. Dazu gehören alle Abfälle, die in Kontakt mit der Lyse/Bindung Puffer (einschließlich der Müllabfuhr-Röhre und die Einweg-Pipetten) wurde. Stattdessen sammeln Sie alle Abfälle in einem separaten Abfallbehälter und nur Desinfizieren Sie die Außenseite des Behälters mit 70 % Ethanol zu.
NAs sind normalerweise von der Map in einem Schritt Heizung eluiert, aber dieser Heizung Schritt entfernt wurde im vereinfachten NA Extraktion Protokoll, die Nutzung von Strom und Ausrüstung zu beseitigen. Daher tendenziell das NAs an der Map halten, die daher die nachgelagerten NA Erkennung Assay für eine positive NA-Erkennung hinzugefügt werden muss. Die Map werden die nachgeschalteten Reaktion Mischung mit einen Tropfen aus einer Einweg-1,5 mL-Pipette übertragen. Dieser Zusatz ist nicht so präzise wie die normale Zugabe mit einem Fin-Tipp-Pipette; jedoch die unpräzise Zugabe von NA/Map zur Lampe, RT-Lampe, qPCR oder RT-qPCR Reaktion Mischung nicht hemmen die Reaktion oder beeinflussen das Fluoreszenzsignal in unserer hauseigenen diagnostischen Test. Dennoch, das abweichen von Test zu Test und es wird empfohlen, dass alle nachgelagerten NA-Test überprüft wird und die Empfindlichkeit des Tests getestet wird mit der vereinfachten NA-Extraktions-Verfahren. Die NA-Extraktions-Verfahren ist relativ empfindlich und Vollblut-Proben mit einem DNA- oder RNA-Virus so niedrig wie 3.000 Kopien/mL problemlos extrahiert und in den nachgelagerten Molekulare Tests, wie z. B. qPCR erkannt. Die Viruslast in klinischen Proben ist während der akuten Phase einer Infektion in der Regel sehr hoch, und hämorrhagisches Fieber-Viren, z. B. das EBOV, Lassa Virus und Krim-Kongo-hämorrhagisches Fieber-Virus, enthalten in der Regel mehr als 105 Kopien/mL9 ,10,11. Daher können diese NA-Extraktions-Verfahren mit Viren in diesen Proben leicht erkannt werden. Jedoch die MPLB Inaktivierung von Viren außer den EBOV7"Vaccinia" und Kuhpocken Virus8 bleibt, die angezeigt werden.
Die vereinfachte NA-Extraktions-Verfahren durchgeführt werden kann, im Krankenhaus Isolierstationen oder im Feldeinstellungen und ist ideal für Point-of-Care Molekulare Diagnostik. Allerdings ist die Methode nicht anwendbar für Hochdurchsatz-NA Extraktionen durch die praktische Handhabung der ein offenes Rohr. Wenn Hochdurchsatz-NA Extraktionen benötigt werden, können die inaktivierten Vollblut-Proben leicht mit NA Extraktion Roboter7gereinigt werden. Ein weiterer Nachteil ist der Umgang mit schädlichen Reagenzien wie der Lyse/Bindung Puffer [20-30 % Polyethylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-Phenyl Ether und 30-50 % Guanidinium Thiocyanat (GITC)]17 und waschen Puffer ich (30-50 % Guanidinium Chlorid)17 in ein offenes Rohr außerhalb einer Flow-Haube. Die Lyse/Bindung Puffer in konzentrierter Form enthalten ist, innerhalb der Vakuum-Röhre und mit der Sammlung des Blutes 1:1 (V/V), die Konzentration sinkt, bevor das Rohr geöffnet wird. Die Eröffnung der Vakuum-Röhre und die Ergänzung/Entfernung der Map oder Waschpuffer ich innerhalb weniger Sekunden erfolgt und daher das Risiko der Inhalation von Aerosolen ist minimal. Nach der Entfernung der Waschpuffer-ich, aus der Tube, keine anderen schädlichen Reagenzien werden im Protokoll verwendet.
Viele Point-of-Care molekularen Schnelltests und Geräte wurden seit dem EBOV Ausbruch im Jahr 20133,6,12,13,14,15,16 . Jedoch erfordern viele dieser Tests noch einen Up-Stream Umgang mit infektiösen Materials, BSL-3 Biosafety Schränke und auf ein Minimum zu reduzieren, Laborgeräte, wie Pipetten, Zentrifugen, und Heizblöcke oder Strom. Die Verwendung von biologischen Sicherheit Schränke erschwert und verlängert eine schnelle Diagnose. Die beschrieben am Krankenbett Virus-Inaktivierung mit der direkten Ansammlung von Blut in die Virus-Inaktivierung-Röhren in Kombination mit der vereinfachten NA-Extraktions-Verfahren entfällt die Notwendigkeit Biosafety Schränke, Strom und Laboreinrichtungen. Zusätzlich, weil die vereinfachte NA-Extraktions-Verfahren neben dem Patienten durchgeführt und mit einer Lampe Reaktion in einem tragbaren batteriebetriebenen Isothermen Gerät kombiniert werden kann, eine sichere am Krankenbett Molekulare Diagnose innerhalb von 40 min erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Susanne Lopes Rasmussen und Solvej Kolbjørn Jensen für ihre technische Unterstützung und für den Umgang mit der klinischen Proben. Dieses Projekt ist Teil des Konsortiums EbolaMoDRAD, die Mittel aus der innovativen Medizin Initiative 2 gemeinsamen Unternehmens unter Grant Vereinbarung N ° 115843 erhalten hat. Dieses gemeinsame Unternehmen erhält Unterstützung von der Europäischen Union Horizont 2020 Forschungs- und Innovationsprogramm und EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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