Summary
Här presenterar vi ett protokoll för snabb virus nukleinsyra utvinning från den virus-inaktiverat helblod. Utvinning sker i blod insamling rören och kräver ingen utrustning eller elektricitet. Metoden är inte beroende av laboratorier och kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus).
Abstract
Snabb diagnos av infektion är viktigt för utbrott management, risk inneslutning och patientvård. Vi har tidigare visat en metod för snabb bedside inaktivering av Ebolavirus under blodprovstagning för säker nukleinsyra (NA) tester genom att lägga till en kommersiell lysis/bindande buffert direkt in i vakuum blod insamling rören. Använder detta sängkanten inaktivering tillvägagångssätt, har vi utvecklat en säker, snabb och förenklad sängkanten NA utvinning metod för efterföljande detektion av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. NA extraktion utförs direkt i blod insamling rören och kräver ingen utrustning eller elektricitet.
När blodet samlas in i Lys/bindande bufferten, innehållet blandas genom att vrida röret för hand och blandningen inkuberas i 20 min i rumstemperatur. Magnetiska glas partiklar (FUP) läggs till röret, och innehållet blandas genom att vända samling röret för hand. De fleråriga utvecklingsprogrammen samlas sedan vid sidan av den bloduppsamlingsrör med hjälp av en magnetisk hållare eller en magnet och ett gummiband. De fleråriga utvecklingsprogrammen tvättas tre gånger och efter tillägg av eluering buffert direkt in i samling röret, NAs är redo för NA tester, såsom qPCR eller isotermiska loop amplifiering (lampa), utan avlägsnande av de fleråriga utvecklingsprogrammen från reaktionen. Den NA utvinning metoden är inte beroende av någon laboratorieresurser och lätt kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus och vårdrum isolering). När denna NA extraktionen metod kombineras med lampa och ett bärbart instrument, kan en diagnos erhållas inom 40 min av blodinsamling.
Introduction
I virus utbrottssituationer, när patienter är begränsade till sjukhusavdelningar isolering eller när en snabb diagnos behövs, är en säker, enkel och korrekt point-of-care molekylär diagnos viktigt för patientens vård och risk inneslutning. De två senaste viral utbrott, Ebola-viruset (EBOV) i västra Afrika (2013) och zikaviruset i Sydamerika (2015), har ökat intresset för förbättrad point-of-care molekylär diagnostiska tester, såsom omvänd Transkription loop-medierad isotermiska förstärkning (RT-lampa)1,2 och recombinase polymeras amplifiering (RPA)3,4. Både RT-lampa och RPA är snabb, känsliga och specifika molekylära tester som kan utföras på förenklat prov preparat. För zikaviruset, har RT-lampa kombinerats med en lateral flow-analys (LFA), som kan upptäcka zikavirus i icke-renat hela blodprov inom 30 min1; för EBOV, som är klassificerat som en risk grupp 4 patogen och är mycket smittsam, proverna måste dock hanteras under biosäkerhet nivå 4 (BSL-4) villkor och inaktiverat innan några säkra diagnostiska procedurer kan utföras.
Förenklade inaktivering metoder för EBOV, såsom tillägg av Lys buffertar till prov2,3,4,5, användes under utbrottet; dessa metoder kräver dock hantering BSL-4 villkor med laboratorieutrustning, till exempel BSL-3 biosäkerhet skåp, centrifuger, värmeblocken pipetter, minst. Denna utrustning finns normalt inte i isolering vårdavdelningar eller ute i fältsjukhus. För att övervinna denna utmaning, försök har gjorts att utföra diagnostik i resväskor3, och flera bärbara enheter och maskiner har varit utvecklade [e.g., en bärbar enhet för extraktion av nukleinsyra (NA)]6. EBOV-positiva prover behöver dock fortfarande inaktiveras innan dessa enheter kan användas.
Vi har tidigare rapporterat en snabb bedside virus inaktivering metod för EBOV7, vacciniavirus och Cowpox virus8 genom tillsats av en kommersiell lysis/bindande buffert till vanliga vakuum blod insamling rör, möjliggör direkt överföring av blod från patienten till den inaktivering buffer7. Detta direkt och omedelbar inaktivering i ett stängt system eliminerar behovet av hantering av proverna med någon fullständig inneslutning, såsom BSL-4 villkor7, och proverna kan hanteras under normala BSL-2. Denna inaktivering metod är kompatibel med flera NA utvinning system, såsom robotar och hand rening kit7; dessa metoder kräver dock laboratorieutrustning, som robotar, centrifuger och el, som inte alltid finns i Fältinställningar eller inuti isolering sjukhusavdelningar.
I den här rapporten beskriver vi en säker, snabb och förenklad manuell NA utvinning metod för efterföljande molekylär påvisande av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. Den NA utvinning metoden kräver inte någon utrustning än en magnet/magnetiska hållare. Ingen centrifuger, värme block, eller el behövs för NA utvinning. Därför, denna metod är inte beroende av laboratorier och lätt kan användas var som helst (t.ex., i fältsjukhus, i isolering sjukhusavdelningar eller med resurssnål inställningar). NA utvinning metoden är snabb och enkel och kan användas direkt i någon nedströms NA tester, såsom qPCR, RT-qPCR, lampa eller RT-lampa. När denna NA extraktionen metod kombineras med lampa och en bärbar batteridriven isotermiska instrument, kan en bedside diagnos erhållas inom 40 min av blodinsamling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utskottet för biomedicinsk forskningsetik, huvudstadsregionen har gett ett informerat samtycke, och alla metoder som beskrivs här har undantagits från en översyn av kommittésystemet för etiska, i enlighet med den danska lagen om assay utvecklingsprojekt.
1. beredning av blod insamling vakuumrör för Virus inaktivering och snabba NA utvinning
FÖRSIKTIGHET: Musbufferten för detta protokoll innehåller guanidinium kaliumtiocyanat (GITC) och en icke-jonisk tensid, som är irriterande. Vidta lämpliga laboratorium säkerhetsåtgärder, använder en flöde huva och Använd handskar vid hantering av den. Undvika hud och ögonkontakt. Om bufferten spills, desinficeras aldrig den kontaminerade ytan direkt med kloramin eller natriumhypoklorit (de aktiva ingredienserna i ”blekmedel”) eftersom denna blandning kan leda till bildandet av giftiga cyanid. Först torka upp utspillt bufferten med absorberande vävnad. Nästa, rengör ytan med 70% etanol och sedan med vatten, och slutligen använda kloramin eller natriumhypoklorit.
- För att förbereda den blod insamling vakuumrör, injicera 1,6 mL den särskilda kommersiella lyseringsbuffert en 4 mL EDTA vakuumrör genom att punktera locket på röret med en 25 G x 1 nål och en 3 mL spruta.
Obs: Ta inte bort locket till vakuumrör. Vakuum upprätthållas. - Lagra den vakuumrör som innehåller bufferten i rumstemperatur fram till användning.
Obs: Rören är stabila i minst 1 år efter deras förberedelser.
2. beredning av buffertar för NA utvinning
- Att förbereda buffertar för en NA-extraktion, plats två 1,8 mL, två 4,5 mL och en 3,6 mL tuber i ett rack.
- Lägga till, genom pipettering, 960 µL av magnetiska glas partiklar (FUP) till en ren 1,8 mL tub och etikett med FUP. Omsuspendera MGP suspensionen helt före pipettering det.
Obs: De fleråriga utvecklingsprogrammen tenderar att snabbt samla på botten av röret. - Lägga till, genom pipettering, 4 mL av tvättbuffert jag till en ren 4,5 mL tub och etiketten som WB-1.
FÖRSIKTIGHET: Tvättbuffert I innehåller guanidinium klorid, som är irriterande. Vidta lämpliga laboratorium säkerhetsåtgärder, använder en flöde huva och Använd handskar vid hantering av den. Undvika hud och ögonkontakt. - Lägga till, genom pipettering, 1.5 mL av tvättbuffert II till en ren 3.6 mL tub och etiketten som WB-2.
- Lägga till, genom pipettering, 3 mL av tvättbuffert III till en ren 4,5 mL tub och etiketten som WB-3.
- Lägga till, genom pipettering, 100 µL eluering buffert till en ren 1,8 mL tub och etiketten som EB.
- Lagra aliquoted buffertar i rumstemperatur fram till användning.
Obs: Rören är stabila i minst 1 månad efter deras förberedelser.
3. blod insamling från patienter med tecken och symtom på en infektion
Varning: Ta lämpligt laboratorium säkerhetsåtgärder när du samlar in helblod från patienten. Använd skyddshandskar och glasögon. Om patienten är i isolering, följ biosäkerhet nivå 4 förfaranden.
- Att samla in intravenös helblod från patienten, använda en fjärilsnål med småkalibriga förlängning slangar och en blod insamling vakuumrör som innehåller en Lys/bindande buffert. Vila patientens arm i en nedåtgående position och placera samling röret lägre än fjäril nålen. Nålen fjäril i ven av patienten och fäst vakuum bloduppsamlingsrör småkalibriga förlängningen.
Obs: Detta förhindrar tillbaka-flöde. - Efter blodinsamling, blanda innehållet i röret genom att vrida röret 5 - 10 gånger.
Obs: På grund av det återstående vakuumet i den bloduppsamlingsrör innehållande 1,6 mL lysis/bindande buffert, volymen som samlas kommer automatiskt att 1,6 mL. - Desinfektera utsidan av röret med 70% etanol.
- Inkubera rören under 20 minuter vid rumstemperatur.
Obs: Protokollet kan pausas här och full blod insamling rören kan förvaras vid-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C eller 37 ° C i minst 1 månad7. - Fortsätt direkt till den förenklade NA utvinning metoden.
4. förenklade NA utvinning i helblod
- För att rena NA från Lys/bindande buffert-inaktiverat insamlade blodet, blanda röret innehållet i röret genom att vända vakuum för hand 5-10 x.
- Ta bort locket på röret försiktigt och ur locket.
- Häll den beredda alikvoten av FUP (1 mL) direkt i bloduppsamlingsrör.
- Placera ett nytt lock från en oanvänd bloduppsamlingsrör på röret som innehåller provet.
- Placera ett finger på locket för att se till att röret är tillsluten och blanda innehållet i röret genom att vända bloduppsamlingsrör hand 5 - 10 gånger.
- Placera röret i Magnethållare och hålla ett finger på locket för att se till att röret är tillsluten.
- Vänd den magnetiska hållaren med röret några gånger för hand att se till att alla de fleråriga utvecklingsprogrammen samlas på sidan av röret med magneten.
Obs: Den magnetisk hållaren kan ersättas med en långsträckt magnet och en gummisnodd. - Avlägsna locket på röret och kassera innehållet i röret antingen via en disponibel pipett eller helt enkelt genom att hälla innehållet i en 50 mL samling tub.
Obs: Undvik aerosoler från 50 mL samling röret genom att stänga röret med ett lock. - Häll den beredda alikvoten av WB-1 (4 mL) direkt in i blodet samling röret.
- Placera locket på tuben och placera ett finger på locket för att se till att röret är tillsluten.
- Ta bort röret från innehavaren av magnetiska, hålla locket ordentligt åtdragna med ett finger.
Obs: Om du använder en magnet och ett gummiband, helt enkelt bort gummiband och magnet från röret. - Återsuspendera de fleråriga utvecklingsprogrammen genom att vända bloduppsamlingsrör hand 5 - 10 gånger.
- Upprepa steg 4.6-4.8.
- Häll den beredda alikvoten av WB-2 (1,5 mL) direkt in i blodet samling röret.
- Placera locket på tuben och ta bort röret från den magnetiska hållaren.
Obs: Om du använder en magnet och ett gummiband, helt enkelt bort gummiband och magnet från röret. - Placera ett finger på locket för att se till att röret är tillsluten.
- Återsuspendera de fleråriga utvecklingsprogrammen genom att vända bloduppsamlingsrör i några sekunder för hand.
- Upprepa steg 4.6-4.8.
- Häll den beredda alikvoten av WB-3 (3 mL) direkt in i blodet samling röret.
- Placera locket på tuben och ta bort röret från den magnetiska hållaren.
Obs: Om du använder en magnet och ett gummiband, helt enkelt bort gummiband och magnet från röret. - Placera ett finger på locket för att se till att röret är tillsluten.
- Återsuspendera de fleråriga utvecklingsprogrammen genom att vända bloduppsamlingsrör hand 5 - 10 gånger.
- Upprepa steg 4.6-4.8.
- Häll den beredda alikvoten av EB (100 µL) direkt in i blodet samling röret.
- Placera locket på tuben och ta bort röret från den magnetiska hållaren.
Obs: Om du använder en magnet och ett gummiband, helt enkelt bort gummiband och magnet från röret. - Återsuspendera de fleråriga utvecklingsprogrammen i EB genom att trycka på bloduppsamlingsrör 5 - 10 gånger med ett finger.
Obs: Protokollet kan pausas här och rören kan förvaras vid-20 ° C. - Överföra en droplet (5-8 µL) av de återsuspenderade FUP till nedströms NA förstärkning reaktion mixen med 1,5 mL disponibla pipett (något nedströms diagnostiska NA förstärkning assay såsom lampa/RT-lampa eller qPCR/RT-qPCR-analyser kan användas).
Obs: NAs kommer att hålla sig till de fleråriga utvecklingsprogrammen, så se till att använda de fleråriga utvecklingsprogrammen i nedströms NA förstärkning reaktionen. Blanda MGP suspensionen före användning. Efter blandning samlar de fleråriga utvecklingsprogrammen på botten av röret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som presenteras här är enkel och effektiv och i stort sett kan tillämpas på någon molekylär analys ska utföras på infektiös helblod prover inactivateds med Lys/bindande bufferten. Arbetsflödet för blod inaktivering och NA utvinning visas i figur 1, inklusive utarbetandet av blod insamling vakuumrör7 (figur 1A), den blod insamling7 (figur 1B), NA utvinning ( Siffror 1 c - 1 H), och nedströms NA analys (figur 1I).
På grund av det förenklade NA extraktion protokollet, de fleråriga utvecklingsprogrammen tas inte bort från eluering steg, och, därför, NAs tenderar att hålla sig till de fleråriga utvecklingsprogrammen. Eventuella efterföljande molekylär analys, till exempel qPCR eller lampa analys, måste utföras direkt på de fleråriga utvecklingsprogrammen (figur 1I och figur 2) för att säkerställa ett positivt resultat.
NA utvinning metoden är effektiv och RNA - eller DNA-virus-positiva hela blodprov med virusbelastning så lågt som 130-3 000 kopior/mL kan extraheras och analyseras med qPCR eller RT-qPCR (figur 3).
Använder metoden NA utvinning, lampa eller RT-lampa och en bärbar batteridriven isotermiska enhet för virus-positiv hela blodprov, kan en diagnos erhållas inom 40 min från blodinsamling (figur 4).
Figur 1 : Arbetsflöde för förenklade NA utvinning av helblod prover. (A) Förbered lysis/bindande buffert vakuum blodinsamling rör med en nål och en spruta. (B) samla blod med en fjärilsnål. (C) Placera bloduppsamlingsrör i en hållare, ta bort locket och häll de fleråriga utvecklingsprogrammen i röret. (D) Stäng tuben med nya lock och blanda innehållet genom att vrida röret för hand. (E) samla de fleråriga utvecklingsprogrammen på sidan av bloduppsamlingsrör genom att vrida röret i den magnetiska hållaren. (F) ta bort supernatanten med disponibla pipett. (G) Häll tvätt eller eluering buffertar direkt i bloduppsamlingsrör och upprepar de åtgärder som visas i panelerna D - F. (H), denna panel visar FUP redo för direkt användning i en qPCR, RT-qPCR, lampa eller RT-lampa reaktion. (jag) överföring en droplet (5-8 µL) av FUP till en PCR eller lampa reaktionsröret med 1,5 mL disponibla pipett. Panel A och B: denna siffra har ändrats från Rosenstierne et al. 7. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : NA upptäckt av 28 virus-positiv hela blodprov extraheras med metoden för utvinning av förenklade NA. Helblod prover (1,6 mL) testad negativ för ett virus var spetsat med antingen ett DNA-virus [Epstein - Barr virus (EBV) (2.0 x 104 - 1,0 x 103 kopior/mL)] eller en RNA-virus [hepatit C-virus (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 kopior/mL)] eller denguefeber virus (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 kopior/mL). NAs extraherades med metoden som beskrivs ovan, och de extraherade NAs analyserades i två exemplar av specifika interna qPCR, RT-PCR, lampa eller RT-lampa, med eller utan FUP. X-axel = NA identifieringsmetoden, y-axel = procentandelen av prover positiva i qPCR/lampa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Känslighet i den förenklade metoden för extrahering av NA. För ett proof of concept av metoden, virus negativa helblod var spetsat med olika RNA eller DNA-virus preparat som innehåller en definierad virusmängd och NAs extraherades med förenklade NA utvinning metod. (A) negativa helblod (1,4 mL) var spetsat med 200 µL 10-faldig spädningar av den EBOV standard som utarbetats för diagnostiska ändamål (ENIVD), vilken var beredd från det senaste utbrottet i Guéckédou/Guinea (2,0 x 106 kopior/mL). Extraherade NAs analyserades i två exemplar av en in-house EBOV-specifika RT-qPCR-7 använder en MX3005P termocykel. (B) helblod (1,2 mL) var spetsat med 400 µL 10-faldig utspädningar HCV som standardiserade serum prov (1,2 x 106 IE/mL). Extraherade NAs analyserades i två exemplar av en in-house HCV-specifika RT-qPCR med hjälp av en MX3005P termocykel. (C) helblod (1,2 mL) var spetsat med 400 µL av olika koncentrationer av EBV (2,0 x 104 kopior/mL, 8,0 x 103 kopior/mL, 2,7 x 103 kopior/mL och 9,3 x 102 kopior/mL). Extraherade NAs analyserades i två exemplar av en in-house EBV-specifika qPCR. (D) helblod (1,2 mL) var spetsat med 400 µL 10-faldig utspädningar av BK virus (1,3 x 104 kopior/mL). Extraherade NAs analyserades i två exemplar av en in-house BK-specifik qPCR. X-axel = slutliga koncentrationen av ett virus i spetsiga helblod provet (kopior/mL eller IE/mL), y-axel = Ct-värde (medelvärde ± SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Förenklad NA utvinning och RT-lampa eller lampa använder en bärbar enhet som isotermiska. (A) på grund av EBOV-positiv hela blodprov vid institutionen av Virus & mikrobiologiska speciell diagnostik, Statens Serum Institut, Danmark, 1,4 mL negativa helblod var spetsat med 200 µL av olika spädningar av EBOV standard som utarbetats för diagnostiska ändamål (ENIVD). Spetsade proverna genomgick en NA extraktion med förenklade NA utvinning metod och analyserades av en EBOV-specifika RT-lampa reaktion. Som en negativ kontroll ingick ett negativ hela blodprov. X-axel = EBOV slutliga koncentration i spetsiga helblod provet (kopior/mL), y-axel = min till positiva. (B) för ett proof of concept, helblod (1,6 mL) alikvoter från 7 patienter, konstaterad positiv EBV (13.000-500 kopior/mL) vid Institutionen för Virus & mikrobiologiska speciell diagnostik, Statens Serum Institut, Danmark, genomgick en NA extraktion med förenklade NA utvinning metod och analyserades genom en EBV-specifika lampa reaktion använda den bärbara batteridrivna Genie II isotermiska enheten. Som en negativ kontroll var Parvo B19-positiva prov inkluderade. X-axel = virusbelastningen av EBV i ett patientprov (kopior/mL), y-axel = min till positiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här rapporten beskriver vi en säker, snabb och enkel manuell sängkanten NA utvinning metod för nedströms molekylär påvisande av virus i Lys/bindande buffert-inaktiverat helblod. Den beskrivna NA utvinning metoden utvecklades för att utföras direkt på helblod prov som samlats i vakuum blod insamling rör som innehåller Lys/bindande buffert (Tabell för material)7. Denna specifika buffert inactivates EBOV7 och är en kritisk komponent i metoden. Efter blodinsamling rekommenderar vi ruvning röret för minst 20 min7 för att garantera en fullständig inaktivering av provet. Sängkanten EBOV inaktivering eliminerar behovet för hantering av alla EBOV-positiva prover under fullständig inneslutning villkor, såsom BSL-4 villkor, och tillåter proverna ska hanteras under normala BSL-2. Det är troligt att andra risk grupp fyra patogener, såsom Lassa viruset, marburgviruset och Krim-Kongo hemorragisk feber viruset inaktiveras också av denna buffert, men detta återstår visas.
Den beskrivna NA utvinning metoden utvecklades för att utföras bredvid en patient i en isolering vårdavdelningen eller i ett fältsjukhus och kräver därför ingen laboratorieutrustning, centrifuger, värmeblocken eller elektricitet. Allt som kräver metoden NA utvinning är rören som innehåller en fast volym av FUP eller tvätta buffertar, en magnetisk hållare, och disponibel pipetter. Före beredning av rören som innehåller buffertar förenklar protokollet eftersom det eliminerar behovet av pipetter och istället aliquoted buffertar hälls direkt i provrör. Magnethållare fångar de fleråriga utvecklingsprogrammen som innehåller NA och förmedlar en enkel hantering av tvätta stegen. Den magnetisk hållaren kan ersättas med en vanlig magnet och en gummisnodd om en magnetisk hållare inte är tillgänglig; Magnethållare minskar dock praktisk risken för att tappa röret och rinner innehållet när tillämpa magnet och gummiband. På grund av viskositeten hos lysis/bindande buffert-inaktiverat helblod provet används disponibla pipetter ta bort supernatanten/vätska/tvätt buffertar från röret. De disponibla pipetterna kan ersättas med en direkt hälla innehållet från röret i en avfallsinsamling tub, men tänk på att inte skapa några droppar utanför röret. Om droppar skapas, desinficeras aldrig den kontaminerade ytan direkt med kloramin eller natriumhypoklorit (de aktiva ingredienserna i ”blekmedel”) eftersom denna blandning kan leda till bildandet av giftiga cyanid. Därför, om spillt först, torka upp spill med en absorberande vävnad. Nästa, rengör ytan med 70% etanol och därefter med rikligt med vatten, och slutligen använda kloramin eller natriumhypoklorit. Detta inkluderar allt avfall som har varit i kontakt med Lys/bindande bufferten (inklusive avfallsinsamling röret och de disponibla pipetterna). Istället samla allt avfall i en separat papperskorg och endast desinfektera utsidan av behållaren med 70% etanol.
NAs är normalt elueras från de fleråriga utvecklingsprogrammen under ett värme-steg, men detta värme steg har tagits i det förenkla NA extraktion protokollet att eliminera användningen av elektricitet och utrustning. Därför tenderar NAs att hålla sig till de fleråriga utvecklingsprogrammen, som därför måste läggas till nedströms NA upptäckt analysen för en positiv NA upptäckt. De fleråriga utvecklingsprogrammen överförs till nedströms reaktion mixen med en droppe från 1,5 mL disponibla pipett. Detta tillägg är inte så exakt som normal tillsats med fin spets pipett; dock ospecifika tillägg av NA/FUP till lampan, RT-lampa, qPCR eller RT-qPCR reaktionsblandning inte hämmar reaktionen eller påverka fluorescensen signalen i vår in-house diagnostiska test. Ändå, detta kan skilja sig från analys till analys, och vi rekommenderar att varje nedströms NA testet valideras, och att känsligheten i analysen testas metoden förenklade NA extraktion. NA utvinning metoden är relativt känslig och helblod prover som innehåller en DNA- eller RNA-virus som är så låg som 3 000 kopior/mL lätt kan extraheras och upptäckt i de efterföljande molekylära testerna, såsom qPCR. Virusbelastningen i kliniska prover är oftast mycket hög under den akuta fasen av infektion och hemorragisk feber-virus, till exempel EBOV, Lassa virus och Krim-Kongo hemorragisk feber-virus, innehåller oftast mer än 105 kopior/mL9 ,10,11. Virus i dessa prov kan därför lätt upptäckas med denna metod för utvinning av NA. Dock MPLB inaktivering av virus än EBOV7, Vaccinia och Cowpox virus8 återstår visas.
Den förenklade NA utvinning metoden kan utföras i isolering sjukhusavdelningar eller i Fältinställningar och är idealisk för point-of-care molekylär diagnostik. Metoden är dock inte tillämpliga för hög genomströmning NA extraktioner på grund av den praktiska hanteringen av ett öppet rör. Om hög genomströmning NA extraktioner behövs, kan inaktiverat hela blodproverna enkelt renas med hjälp av NA utvinning robotar7. En annan nackdel är hanteringen av skadliga reagens såsom lysis/bindande buffert [20-30% polyetylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl eter och 30-50% guanidinium kaliumtiocyanat (GITC)]17 och tvätta bufferten jag (30-50% guanidinium klorid)17 i ett öppet rör utanför flöde huva. Lys/bindande bufferten i koncentrerad form finns inom vakuumrör och med insamling av blod 1:1 (v/v), koncentrationen reduceras innan röret öppnas. Öppnandet av vakuumrör och tillägg/borttagning av FUP eller tvättbuffert jag utförs inom ett par sekunder och därmed risken för inandning av aerosoler är minimal. Efter avlägsnande av tvättbuffert-jag, från röret, inga andra skadliga reagenser som används i protokollet.
Många snabba point-of-care molekylära tester och enheter har utvecklats sedan EBOV utbrottet i 20133,6,12,13,14,15,16 . Många av dessa tester kräver dock fortfarande en uppströms hantering av smittförande material, BSL-3 biosäkerhet skåp och vid en minsta, laboratorieutrustning, såsom pipetter, centrifuger och värmeblocken eller elektricitet. Användning av biosäkerhet skåp försvårar och förlänger en snabb diagnos. Beskrivna sängkanten virus inaktivering med direkta insamling av blod in i rören för inaktivering av virus kombinerat med den förenklade NA utvinning metoden eliminerar behovet för biosäkerhet skåp, el och laboratorieresurser. Dessutom, eftersom den förenklade NA utvinning metoden kan utföras bredvid patienten och kombinerat med en lampa reaktion i en bärbar batteridriven isotermiska enhet, kan en säker sängkanten molekylär diagnos erhållas inom 40 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Susanne Lopes Rasmussen och Solvej Kolbjørn Jensen för deras tekniskt bistånd och för hantering av kliniska prover. Detta projekt är en del av konsortiet EbolaMoDRAD, som har fått stöd från de innovativa läkemedel 2 gemensamma företaget för initiativet under grant avtalet N ° 115843. Detta gemensamma företag får stöd från EU: s Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogrammet- och EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
