Summary
Здесь мы представляем протокол для извлечения антивирусную нуклеиновой кислоты из цельной крови инактивированный вирус. Добыча осуществляется непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество. Метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях).
Abstract
Быстрая диагностика инфекции имеет важное значение для управления вспышки, сдерживание рисков и ухода за пациентами. Ранее мы показали метод для быстрого прикроватные инактивация вируса Эбола во время забора крови для безопасного нуклеиновой кислоты (NA) тестов, добавив коммерческих лизис/привязки буфера непосредственно в вакуумной пробирки. Используя этот подход прикроватные инактивации, мы разработали безопасного, быстрого и упрощенного метода прикроватные NA извлечения для последующего обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. NA добыча производится непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество.
После того, как кровь собирается в буфере lysis/привязки, содержание смешиваются, щелкая трубки вручную, и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Магнитные стекла частиц (MGPs) добавляются к трубе, и содержание смешиваются, щелкая трубки коллекции вручную. MGPs затем собираются на стороне пробирка с помощью магнита и магнитным держателем или резинкой. MGPs промывают три раза, и после добавления Элюирующий буфер непосредственно в коллекции трубку, NAs готовы для испытаний NA, например ПЦР или изотермический цикл амплификации (лампа), без удаления MGPs от реакции. Метод извлечения NA не зависит от каких-либо лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевые госпитали и больницы изоляторах). Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный инструмент, диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.
Introduction
В ситуациях вспышки вируса когда пациенты сводятся к изоляции стационарах или когда требуется быстрый диагноз, безопасной, простой и точной точки обслуживания молекулярной диагностики является императивом для пациента ухода и риска сдерживания. Два недавних вспышек вирусных, вирус Эбола (EBOV) в Западной Африке (2013) и вирус Зика в Южной Америке (2015), повысили интерес к улучшение обслуживания точки молекулярных диагностических тестов, например обратная транскрипция цикла опосредованной изотермический амплификация (RT-лампа)1,2 и рекомбиназа полимеразы амплификации (РПА)3,4. RT-лампа и РПА, быстрое, чувствительной и конкретные молекулярные тесты, которые могут быть выполнены на упрощенный пример подготовки. Для вируса Зика RT-лампа была объединена с бокового потока проба (LFA), который может обнаружить вирус Зика проб неочищенных цельной крови в течение 30 мин-1; Однако, для EBOV, который классифицируется как риск группы 4 возбудителя и очень заразна, образцы необходимо обрабатывать по биобезопасности уровня 4 (BSL-4) условия и инактивированных перед любой безопасной диагностические процедуры могут быть выполнены.
Упрощенные инактивации методы для EBOV, такие как добавление лизис буферов для образца2,3,4,5, были использованы во время вспышки; Однако эти методы требуют обработки условиях BSL-4 с лабораторным оборудованием, например биобезопасности шкафы BSL-3, центрифуги, Отопление блоков и пипетки, как минимум. Это оборудование обычно не присутствует, в следственных изоляторах или в полевых госпиталях. Чтобы преодолеть эту проблему, были предприняты попытки для выполнения диагностики в чемоданах3, и несколько портативных устройств и машин были развитые [например, портативное устройство для извлечения нуклеиновой кислоты (NA)]6. Однако EBOV-позитивных образцов необходимо инактивированная, прежде чем эти устройства могут быть использованы.
Мы уже ранее сообщали метод инактивации антивирусную Тумба для EBOV7, Vaccinia вируса и вирус коровьей8 добавлением буфера коммерческих лизис/привязки для обычных вакуумной пробирки, позволяя для прямого Передача крови от пациента в инактивации буфера7. Это прямой и непосредственный инактивации в закрытой системе устраняет необходимость для обработки образцов с помощью любой строгий сдерживания, например BSL-4 условия7, и образцы могут быть обработаны при нормальных условиях BSL-2. Этот метод инактивации совместим с несколькими системами извлечения NA, таких как роботы и ручной очистки наборы7; Однако эти методы требуют лабораторного оборудования, таких как роботы, центрифуги и электричество, которые не всегда присутствуют в поле Параметры или внутри изоляции стационарах.
В настоящем докладе мы описываем безопасного, быстрого и упрощенного метода ручной NA извлечения для последующего молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Метод извлечения NA не требуют никакого оборудования помимо магнит/магнитный держатель. Нет центрифуги, Отопление блоков, или электричество необходимо для извлечения NA. Следовательно, этот метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях, в стационарах изоляции, или с ограниченными ресурсами). Метод извлечения NA быстрый и простой и может использоваться непосредственно в любой течению NA тесты, такие как RT-лампа, лампа, ПЦР и RT-ПЦР. Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный аккумулятор driven изотермический инструмент, прикроватные диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике биомедицинских исследований, столичный регион дал согласие, и все методы, описанные здесь были освобождены от обзора по системе этического Комитета, в соответствии с датского Закона о анализа проектов в области развития.
1. Подготовка вакуумной пробирки для инактивирования вирусов и извлечения быстрой NA
Предупреждение: Буфер, используемый для этого протокола содержит Гуанидиновые тиоцианат (GITC) и неионогенные ПАВ, которые являются раздражителями. Принять меры безопасности соответствующие лабораторные, используйте бленду потока и надевайте перчатки при обращении с ней. Избегайте любой кожи и глаза. Если буфер пролилась, загрязненной поверхности должны никогда не быть продезинфицированы непосредственно с хлорамина или гипохлорита натрия (активные ингредиенты в «Блич») потому, что эта смесь может привести к образованию токсичных цианистых. Во-первых Вытрите пролитое буфер с поглощающей ткани. Затем очистите поверхность с 70% этанола, а затем с водой и, наконец, использовать хлорамина или гипохлорита натрия.
- Подготовить Вакуумные пробирки, привнести 1,6 мл конкретных коммерческих литического буфера в вакуумной трубке 4 мл ЭДТА, проколов крышку трубки с помощью 25 G x 1 иглу и шприц 3 мл.
Примечание: Не снимайте крышки вакуумной трубки. Необходимо поддерживать вакуум. - Хранения Вакуумные пробирки, содержащие буфер при комнатной температуре до использования.
Примечание: Трубы устойчивы, по крайней мере 1 год после их подготовки.
2. Подготовка буферов для извлечения NA
- Подготовить буферы для извлечения NA, место два 1.8 мл, два 4.5 мл и один 3,6 мл трубки в стойку.
- Добавьте, дозирование, 960 мкл частиц (MGPs) магнитных стекла чистые 1.8 мл трубки и этикетка с MGPs. Ресуспензируйте MGP подвеска полностью перед его закупорить.
Примечание: MGPs склонны быстро собирать в нижней части трубки. - Добавить, дозирование, 4 мл буфера мытья я к чистой 4,5 мл трубки и пометьте ее как ВБ-1.
Предупреждение: Мыть буфер содержит Гуанидиновые хлорид, который является раздражающим. Принять меры безопасности соответствующие лабораторные, используйте бленду потока и надевайте перчатки при обращении с ней. Избегайте любой кожи и глаза. - Добавить, дозирование, 1,5 мл буфера II мыть чистой 3,6 мл пробирку и пометьте ее как WB-2.
- Добавить, дозирование, 3 мл буфера III мыть чистой 4,5 мл пробирку и пометьте ее как WB-3.
- Добавить, дозирование, 100 мкл буфера в чистой 1.8 мл трубку и пометьте ее как EB.
- Магазин aliquoted буферов при комнатной температуре до использования.
Примечание: Трубы устойчивы, по крайней мере 1 месяц после их подготовки.
3. крови коллекции от пациентов с признаками и симптомами заражения вирусом
Предупреждение: Принять соответствующие лабораторные меры безопасности при сборе цельной крови от пациента. Надевайте перчатки и очки. Если пациент находится в изоляции, выполните процедуры по биобезопасности уровня 4.
- Для сбора внутривенного цельной крови от пациента, используйте Бабочка иглы с малокалиберная расширение трубы и вакуумной пробирки содержащие буфера lysis/привязки. Подлокотники пациента в положении вниз и позицию коллекции трубки, ниже, чем Бабочка иглы. Вставьте Бабочка иглы в вену больного и прикрепите вакуумная пробирка малокалиберная расширение.
Примечание: Это предотвратит обратного потока. - После сбора крови Смешайте содержимое трубки, щелкая трубки 5 - 10 раз.
Примечание: Из-за оставшихся вакуума в пробирки, содержащие 1,6 мл буфера lysis/привязки, объем собранных образцов будет автоматически 1,6 мл. - Продезинфицируйте внешней трубки с помощью 70% этиловом спирте.
- Инкубируйте трубы для 20 мин при комнатной температуре.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь и полный пробирки могут храниться при-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C или 37 ° C для по крайней мере 1 месяц7. - Продолжить прямо на упрощенный метод извлечения NA.
4. упростить извлечение NA цельной крови
- Чтобы очистить NA от лизис/привязки буфера инактивированная собранной крови, смесь содержимое тюбика, щелкая вакуум трубки вручную 5-10 x.
- Осторожно снимите крышку трубки и выполнять крышку.
- Залейте подготовленный Алиготе MGPs (1 мл) непосредственно в пробирки.
- Место новой крышкой от неиспользуемых пробирка на трубка, содержащая образец.
- Поместите палец на крышке убедитесь, что трубка плотно закрыты и смешать содержимое трубки, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
- Трубка в магнитный держатель и держать руку на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
- Флип магнитный держатель с трубки несколько раз вручную, чтобы убедиться, что все MGPs собираются на стороне трубки с магнитом.
Примечание: Магнитный держатель могут быть заменены удлиненные магнит и резинкой. - Снимите крышку трубки и сбросить содержимое трубки, либо с помощью одноразовой пипетки или просто наливание содержимого в коллекции Тюбик 50 мл.
Примечание: Избегайте аэрозолей из коллекции Тюбик 50 мл, закрыв трубки с крышкой. - Залейте подготовленный Алиготе ВБ-1 (4 мл) непосредственно в пробирки.
- Установите крышку на трубе и Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
- Снять трубку с магнитным держателем, сохраняя крышка надежно затянуты с пальцем.
Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки. - Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
- Повторите шаги с 4,6-4,8.
- Залейте подготовленный Алиготе WB-2 (1,5 мл) непосредственно в пробирки.
- Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки. - Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
- Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирки на несколько секунд вручную.
- Повторите шаг 4,6-4,8.
- Залейте подготовленный Алиготе WB-3 (3 мл) непосредственно в пробирки.
- Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки. - Поместите палец на крышке, чтобы убедиться, что трубка плотно закрыты.
- Ресуспензируйте MGPs, щелкая пробирка вручную 5 - 10 раз.
- Повторите шаги с 4,6-4,8.
- Залить подготовленные Алиготе EB (100 мкл) непосредственно в пробирки.
- Установите крышку на трубе и снять трубку из магнитного держателя.
Примечание: Если с помощью магнита и резинкой, просто удалите резинкой и магнит из трубки. - Ресуспензируйте MGPs в EB, нажав пробирка 5 - 10 раз с пальцем.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь, и трубы могут храниться при температуре-20 ° C. - Передача одной капли (5-8 мкл) ресуспензированы MGPs течению NA усиление реакции микс используя одноразовые пипетки 1,5 мл (любой течению диагностических NA амплификации пробирного такие как RT-лампа или ПЦР/RT-ПЦР-анализов могут быть использованы).
Примечание: NAs будет придерживаться MGPs, так что не забудьте использовать MGPs в нижнем реакции амплификации NA. Смешайте MGP подвеска перед использованием. После смешивания, MGPs будет собирать в нижней части трубки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, представленные здесь проста и эффективна и может широко применяться к любой молекулярных пробирного выполняться на образцах инфекционных цельной крови, инактивированная с буфера lysis/привязки. Рабочий процесс инактивации крови и NA добыча показано на Рисунок 1, включая подготовку крови коллекции вакуумные трубки7 (рис. 1а), крови коллекции7 (рис. 1B), добыча NA ( Цифры 1 c - 1 H) и вниз по течению анализ NA (Рисунок 1I).
Благодаря упрощенный протокол извлечения NA MGPs не удаляются из элюции шаг, и, таким образом, склонны придерживаться MGPs NAs. Любые течению молекулярного анализа, например ПЦР или лампа анализа, должны быть выполнены непосредственно на MGPs (1I рисунок и Рисунок 2) для обеспечения положительного результата.
Метод извлечения NA является эффективным и РНК - и ДНК вирус позитивных цельной крови образцы с вирусной нагрузкой как низкий, как 130-3000 копий/мл может быть извлечено и проанализированы с помощью ПЦР или RT-ПЦР (рис. 3).
Используя метод извлечения NA, лампа или RT-лампа и портативные батареи driven изотермический устройство для цельной крови вирус позитивных образцов, диагноз можно получить в течение 40 мин от забора крови (рис. 4).
Рисунок 1 : Рабочий процесс для упрощенной NA извлечения образцов цельной крови. (A) подготовка, которую коллекции механотронное крови буфера lysis/привязки труб с помощью иглы и шприца. (B) сбор крови с помощью Бабочка иглы. (C) место пробирки в держатель, снимите крышку и вылить MGPs в трубку. (D) закрыть трубу с новой крышкой и перемешайте содержимое, щелкая трубки вручную. (E) сбор MGPs на стороне пробирка, щелкая трубки в магнитный держатель. (F) удалить супернатант, используя одноразовые пипетки. (G) вылить мыть или Элюирующий буфер непосредственно в пробирки и повторите действия, показанные в панели D - F. (H) Эта группа показывает MGPs готова для непосредственного использования в ПЦР, RT-ПЦР, лампа или RT-лампа реакции. (I) передача одной капли (5-8 мкл) MGPs в трубу реакции PCR или лампа, используя одноразовые пипетки 1,5 мл. Группа A и B: этот показатель был изменен с Rosenstierne и др. 7. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Обнаружение 28 цельной крови вирус позитивных образцов, извлекаются с помощью метода извлечения упрощенный NA NA. Цельной крови образцы испытания отрицательной (1,6 мл) для вируса были шипами либо ДНК вирус [вирус Эпштейна - Барр (EBV) (2.0 x 104 - 1,0 x 103 копий/мл)] или РНК вирусов [вирус гепатита С (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 х 103 копий/мл)] или вирус денге (DENV) (1,7 x 108 - 1.7 x 106 копий/мл). НАН были извлечены с помощью метода, описанного выше, и извлеченные NAs были проанализированы в двух экземплярах конкретных внутренних ПЦР, RT-PCR, лампа или RT-лампа, с или без MGPs. X-оси = NA метод обнаружения, y-ось = доля проб положительный в ПЦР/лампа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Чувствительность упрощенного метода извлечения NA. Доказательство концепции метода вирус отрицательный цельной крови был шипами с различными РНК и ДНК вируса препараты, содержащие определенные вирусной нагрузки, и NAs извлекали с помощью упрощенного метода извлечения NA. (A), отрицательный цельной крови (1.4 мл) был шипами с 200 мкл десятикратного разведений EBOV стандарт, подготовленный для диагностических целей (ENIVD), который был подготовлен от недавней вспышки в Гекеду/Гвинея (2,0 х 106 копий/мл). Извлеченный NAs были проанализированы в двух экземплярах собственных конкретных EBOV RT-ПЦР7 с помощью MX3005P тепловая велосипедист. (B) цельной крови (1,2 мл) был шипами с 400 мкл десятикратного разведения образца стандартизированных сыворотку HCV кто (1,2 х 106 МЕ/мл). Извлеченный NAs были проанализированы в двух экземплярах доме HCV-конкретных RT-ПЦР с использованием MX3005P тепловая велосипедист. (C) цельной крови (1,2 мл) был шипами 400 мкл различной концентрации EBV (2.0 x 104 копий/мл, 8.0 x 103 копий/мл, 2.7 x 103 копий/мл и 9.3 x 102 копий/мл). Извлеченный NAs были проанализированы в двух экземплярах доме EBV конкретного ПЦР. (D) цельной крови (1,2 мл) был шипами 400 мкл десятикратного разведений BK вирус (1.3 x 104 копий/мл). Извлеченный NAs были проанализированы в двух экземплярах доме BK-конкретного ПЦР. X-оси = конечная концентрация вируса в образце шипами цельной крови (копий/мл или МЕ/мл), y-ось = значение Ct (среднее ± SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Упрощенный NA добычи и RT-лампы или лампы, с помощью портативного устройства изотермический. (A) из-за отсутствия EBOV-позитивных образцов цельной крови на Департамент вирус и микробиологические специальной диагностики, Statens институт сыворотки, Дания, с 200 мкл различных разведениях EBOV шипами 1.4 мл отрицательных цельной крови стандарт, подготовленный для диагностических целей (ENIVD). Шипами образцы прошли с использованием упрощенного метода извлечения NA NA экстракции и были проанализированы RT-лампа EBOV-специфические реакции. Как отрицательный контроль образец отрицательный цельной крови был включен. X-оси = конечная концентрация EBOV в образце шипами цельной крови (копий/мл), y-ось = мин на позитивный. (B) для доказательство концепции, аликвоты цельной крови (1,6 мл) из 7 больных, Диагноз положительный для EBV (13000-500 копий/мл) в Департамент вирус и микробиологические специальной диагностики, Statens институт сыворотки, Дания, претерпел NA Добыча с помощью упрощенного метода извлечения NA и были проанализированы лампа EBV-специфические реакции, используя портативные батареи driven Genie II изотермический устройства. Как отрицательный контроль парво В19 положительный пример был включен. X-оси = вирусная нагрузка EBV в образце пациента (копий/мл), y-ось = мин на позитивный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем докладе мы описываем безопасной, быстрой и простой ручной прикроватные NA извлечения метод для вниз по течению молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Описан метод извлечения NA был разработан непосредственно на пробах цельной крови в вакуумной пробирки, содержащие лизис/привязки буфера (Таблица материалов)7. Этот буфер инактивирует EBOV7 и является важным компонентом в методе. После сбора крови мы рекомендуем инкубации трубки для по крайней мере 20 мин7 с целью обеспечения полной инактивации образца. Тумба EBOV инактивации устраняет необходимость для обработки любых EBOV-положительных проб в условиях строгой локализации, например BSL-4 условия и позволяет образцы обрабатываться при нормальных условиях BSL-2. Вполне вероятно, что другие патогены четыре группы риска, такие как также инактивированный вирус Ласса, марбургского вируса и вирус Конго крымской геморрагической лихорадки в этот буфер, но это по-прежнему будет показан.
Описан метод извлечения NA был разработан, чтобы быть выполнены рядом с пациента в больницу изолятора или в полевой госпиталь и, следовательно, требует не лабораторного оборудования, например, центрифуги, Отопление блоков или электричество. Все, что метод извлечения NA требует трубы содержащие фиксированный объем MGPs или мыть буферов, магнитный держатель и одноразовые пипетки. Предварительной подготовки пробирки, содержащие буферов упрощает протокол, потому что он устраняет необходимость для пипетки, и вместо этого, aliquoted буферов разливают непосредственно в пробоотборные трубки. Магнитный держатель ловит MGPs, содержащие НС и опосредует управляемость мыть шагов. Магнитный держатель может быть заменен с обычным магнит и резинкой в случае магнитный держатель не предоставляется; Однако магнитный держатель уменьшает практический риск падения трубки и разлив содержимого при применении магнит и резинкой. Из-за вязкости образца буфера инактивированная цельной крови лизис/привязки одноразовые пипетки используются для удаления буферов супернатант/жидкость/мыть из трубки. Одноразовые пипетки могут быть заменены прямого наливание содержимого из трубки в трубу сбора отходов, но имейте в виду, чтобы не создавать любые капли за пределами трубки. Если создаются капельки, загрязненной поверхности должны никогда не быть продезинфицированы непосредственно с хлорамина или гипохлорита натрия (активные ингредиенты в «Блич») потому, что эта смесь может привести к образованию токсичных цианистых. Таким образом если пролита во-первых, протрите разливов поглощающей тканью. Затем очистите поверхность с 70% этанола, а затем большим количеством воды и, наконец, использовать хлорамина или гипохлорита натрия. Это включает в себя все отходы, которая соприкасалась с лизис/привязки буфера (включая сбор отходов трубки и одноразовые пипетки). Вместо этого собрать все отходы в отдельный контейнер для отходов и только лечить вне контейнера с 70% этиловом спирте.
NAs обычно этого eluted от MGPs во время шага Отопление, но этот шаг Отопление было удалено в упрощенный протокол извлечения NA для ликвидации использования электроэнергии и оборудования. Таким образом NAs склонны придерживаться MGPs, которые, таким образом, должны быть добавлены к течению NA обнаружения assay для положительных NA обнаружения. MGPs передаются вниз по течению реакция смеси с помощью одной капли от 1,5 мл одноразовые пипетки. Это дополнение не так точно, как нормальный сложения с помощью кончика пипетки плавника; Однако неточным добавлением NA/MGPs к ЛАМПЕ, RT-лампа, ПЦР или RT-ПЦР реакция смеси не ингибируют реакции или влиять на сигнал флуоресценции в нашем доме диагностических assay. Тем не менее это может отличаться от пробирного анализа, и мы рекомендуем, что каждый течению NA теста проверяется, и что чувствительность анализа проверяется с использованием упрощенного метода извлечения NA. Метод извлечения NA является относительно чувствительных и пробы цельной крови, содержащий ДНК или РНК вируса как низкий, как 3000 копий/мл легко могут быть извлечены и обнаружены в нижнем течении молекулярные тесты, такие как ПЦР. Вирусная нагрузка в клинических образцах обычно очень высока во время острой фазы инфекции, и геморрагические лихорадки вирусов, таких как EBOV, вирус Ласса и вирус Конго крымской геморрагической лихорадки, обычно содержат более чем 105 копий/мл9 ,10,11. Таким образом вирусов в этих образцах можно легко обнаружить с помощью этого метода извлечения NA. Однако MPLB инактивирования вирусов помимо7EBOV, Vaccinia и коровьей оспы вирус8 по-прежнему будет показан.
Упрощенный метод извлечения NA может быть выполнена в стационарах изоляции или параметры поля и идеально подходит для точки обслуживания молекулярной диагностики. Однако метод не применяется для высокой пропускной способности NA извлечений из-за практического обращения открытого трубки. Если требуются высок объём NA извлечений, инактивированных цельной крови образцы легко быть очищены с помощью NA извлечения роботы7. Еще одним недостатком является обработка вредных реагентов как лизис/привязки буфера [20-30% полиэтиленгликоль p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-фенил эфира и 30-50% Гуанидиновые тиоцианат (GITC)]17 и мыть буфера I (30-50% Гуанидиновые 17 хлорида) в открытой трубой вне потока Худ. Буфер lysis/привязки в концентрированной форме содержится внутри вакуумной трубки и с сбор крови 1:1 (v/v), концентрация уменьшается до открытия трубки. Открытия вакуумной трубки и добавление/удаление MGPs или мыть буфера я выполняется в течение нескольких секунд, и, следовательно, риск вдыхание аэрозолей является минимальным. После удаления буфера мытья-I, от трубки, никаких других вредных реагентов используются в протоколе.
Многие быстрого обслуживания точки молекулярные тесты и приборы были разработаны после начала EBOV в 2013 году3,6,12,13,14,15,16 . Однако многие из этих тестов по-прежнему требуют обработки вверх по течению инфекционных материалов, шкафы биобезопасности BSL-3 и на минимум, лабораторное оборудование, например, пипетки, центрифуги и Отопление блоков или электричество. Использование биобезопасности шкафы усложняет и продлевает быстрой диагностики. Инактивация описанных прикроватной вирус с непосредственного сбора крови в сочетании с упрощенного метода извлечения NA трубы инактивации вирус устраняет необходимость для биобезопасности шкафы, электричество и лабораторных помещений. Кроме того потому что упрощенный метод извлечения NA может осуществляется рядом с пациентом и в сочетании с лампа реакции в переносное устройство изотермический управляемая батарея, безопасной прикроватные молекулярной диагностики можно получить в течение 40 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Сюзанна Лопес Расмуссен и Солвэй Kolbjørn Дженсен за их технической помощи и для обработки клинических образцов. Этот проект является частью EbolaMoDRAD консорциум, который получил финансирование от инновационной медицины инициатива 2 совместное предприятие под Грант соглашение N ° 115843. Это совместное предприятие получает поддержку от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы и EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
