Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la extracción de ácidos nucleicos de virus rápido de la sangre virus inactivado. La extracción se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad. El método no es dependiente de laboratorios y puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales).
Abstract
El diagnóstico rápido de infección es esencial para el manejo de brote, contención del riesgo y atención al paciente. Previamente hemos demostrado un método para la rápida inactivación cabecera del virus Ebola durante la muestra de sangre para las pruebas de ácido nucleico seguro (NA) mediante la adición de un tampón de lisis/enlace comercial directamente en los tubos de colección de sangre vacío. Usando este método de inactivación de cabecera, hemos desarrollado un seguro, rápido y simplificado cabecera NA método de extracción para la posterior detección de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. La extracción de NA se realiza directamente en los tubos para recogida de sangre y no requiere equipo ni electricidad.
Después se recoge la sangre en el buffer de lisis/vinculante, el contenido se mezcla poniendo el tubo con la mano, y la mezcla se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. Partículas de vidrio magnético (MGP) se agregan al tubo, y los contenidos son mezclados por el tubo de recogida de los bancos a mano. Los pop son recogidos luego en el lado del tubo de la colección de sangre utilizando un soporte magnético o un imán y una banda de caucho. El pop se lavan tres veces, y después de la adición de tampón de elución directamente en el tubo de colección, NAs están listos para pruebas de NA, como qPCR o amplificación isotérmica lazo (lámpara), sin el retiro de los pop de la reacción. El método de extracción de NA no es dependiente en las instalaciones de laboratorio y puede fácilmente ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales y salas de aislamiento del hospital). Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento portátil, puede obtenerse un diagnóstico dentro de 40 min de la colección de sangre.
Introduction
En situaciones de brote de virus, cuando los pacientes están confinados a las salas de aislamiento del hospital o cuando se necesita un rápido diagnóstico, una diagnosis molecular del punto de atención de segura, sencilla y precisa es imprescindible para la contención del cuidado y el riesgo del paciente. Dos brotes recientes virales del virus de Ebola (EBOV) en África del oeste (2013) y el virus Zika en América del Sur (2015), han aumentado el interés en el mayor punto de atención moleculares pruebas diagnósticas, como isotérmico de reversa de la transcripción mediada por el lazo amplificación (RT-LAMP)1,2 y recombinase polimerasa amplificación (RPA)3,4. RT-LAMP y RPA son rápidas, sensibles y específicas pruebas moleculares que pueden realizarse sobre los preparativos de la muestra simplificada. Para el virus Zika, RT-LAMP se ha combinado con un análisis de flujo lateral (LFA), que puede detectar el virus Zika en muestras de sangre no purificados dentro de 30 min1; sin embargo, para EBOV, que está clasificado como un patógeno del grupo 4 de riesgo y es altamente contagiosa, las muestras necesitan manejarse bajo bioseguridad nivel 4 (BSL-4) condiciones e inactivado antes de cualquier procedimiento diagnóstico seguro se puede realizar.
Se utilizaron métodos de inactivación simplificada de EBOV, tales como la adición de buffer de lisis a la muestra de2,3,4,5, durante el brote; sin embargo, estos métodos requieren un manejo bajo condiciones BSL-4 con equipo de laboratorio, tales como gabinetes de bioseguridad BSL-3, centrifugadoras, bloques de calentamiento y pipetas, en un mínimo. Este equipo normalmente no está presente en salas de aislamiento o en hospitales. Para superar este reto, se ha intentado realizar diagnósticos en maletas3, y varios dispositivos portátiles y las máquinas han sido desarrolladas [por ejemplo, un dispositivo portátil para la extracción de ácidos nucleicos (NA)]6. Sin embargo, las muestras positivas de EBOV aún necesitan ser inactivado antes de que estos dispositivos se pueden utilizar.
Hemos divulgado previamente un método de inactivación de virus rápido de cabecera de EBOV7, virus de la Vaccinia y vacuna virus8 por adición de un tampón de lisis/enlace comercial para tubos para colección de sangre vacío ordinario, lo que permite la directa transferencia de sangre del paciente en la inactivación buffer7. Esta inactivación directa e inmediata en un sistema cerrado elimina la necesidad para el manejo de las muestras utilizando cualquier contención rigurosa, como BSL-4 condiciones7, y las muestras pueden ser manejadas bajo condiciones normales de BSL-2. Este método de inactivación es compatible con varios sistemas de extracción de NA, como robots y kits de purificación7de mano; sin embargo, estos métodos requieren equipos de laboratorio, tales como robots, centrifugadoras y la electricidad, que no siempre están presentes sobre el terreno o dentro de pabellones de aislamiento hospitalarios.
En este informe, describimos un seguro, rápido y simplificado NA extracción método manual para la posterior detección molecular de virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/obligatorio. El método de extracción de NA no requiere cualquier dispositivo distinto de un imán magnético soporte. No centrifugadoras, bloques, o la electricidad de la calefacción son necesarios para la extracción de NA. Por lo tanto, este método no es dependiente de laboratorios y fácilmente puede ser utilizado en cualquier lugar (por ejemplo, en hospitales, en las salas de aislamiento del hospital, o con escasos recursos). El método de extracción de NA es rápida y sencilla y puede ser utilizado directamente en pruebas NA aguas abajo, como qPCR, RT-qPCR, lámpara, lámpara de RT. Cuando se combina este método de extracción de NA con lámpara y un instrumento isotermo portátil impulsado por batería, puede obtenerse un diagnóstico cabecera dentro de 40 min de la colección de sangre.
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Protocol
La Comisión de ética de investigación biomédica, región de la Capital ha dado consentimiento informado, y todos los métodos aquí descritos han sido exentos de revisión por el sistema de Comité de ética, conforme a la ley danesa sobre proyectos de desarrollo de ensayo.
1. preparación de tubos de vacío sangre colección para inactivación de Virus y NA rápida extracción
PRECAUCIÓN: El búfer utilizado para este protocolo contiene tiocianato de guanidinio (GITC) y un surfactante no iónico, que son irritantes. Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas, utilizar una campana de flujo y guantes al manipularlo. Evitar cualquier piel y contacto con los ojos. Si el búfer se derrama, la superficie contaminada no se debe nunca desinfectar directamente con cloramina o hipoclorito de sodio (los ingredientes activos en "bleach") ya que esta mezcla puede conducir a la formación de cianuro tóxicos. En primer lugar, limpiar el búfer derramado con papel absorbente. A continuación, limpie la superficie con etanol al 70% y luego con agua y por último, usar cloramina o hipoclorito de sodio.
- Para preparar los tubos de vacío de colección de sangre, inyectar 1,6 mL de la solución de lisis comercial específico en un tubo de vacío con EDTA 4 mL pinchando la tapa del tubo con una aguja de 25 x 1 y una jeringa de 3 mL.
Nota: No retire la tapa del tubo de vacío. El vacío debe mantenerse. - Almacenar los tubos de vacío que contiene el buffer a temperatura ambiente hasta su uso.
Nota: Los tubos son estables durante al menos 1 año después de su preparación.
2. preparación de tampones de extracción de NA
- Para preparar los amortiguadores para una extracción de NA, coloque dos 1.8 mL, dos 4,5 mL y una 3.6 mL tubos en un rack.
- Añadir, mediante pipeteo, 960 μl de cristal magnético partículas (MGP) a un tubo de 1.8 mL limpia y etiqueta con MGPs. Resuspender la suspensión pop totalmente antes de pipetearlo.
Nota: Los pop tienden a recoger rápidamente en la parte inferior del tubo. - Añadir, mediante pipeteo, 4 mL de tampón de lavado I a un tubo de 4,5 mL limpia y etiqueta como WB-1.
PRECAUCIÓN: El tampón de lavado I contiene cloruro de guanidinio, que es irritante. Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas, utilizar una campana de flujo y guantes al manipularlo. Evitar cualquier piel y contacto con los ojos. - Añadir, mediante pipeteo, 1,5 mL de tampón de lavado II a un tubo limpio 3.6 mL y etiquetar como WB-2.
- Añadir, mediante pipeteo, 3 mL de buffer de lavado III a un tubo de 4,5 mL limpia y etiqueta como WB-3.
- Añadir, mediante pipeteo, 100 μl de tampón de elución a un tubo de 1.8 mL limpia y etiqueta como EB.
- Almacenar los buffers alícuotas a temperatura ambiente hasta su uso.
Nota: Los tubos son estables durante al menos 1 mes después de su preparación.
3. colección de sangre de pacientes con signos y síntomas de una infección de Virus
PRECAUCIÓN: Tomar medidas de seguridad de laboratorio adecuadas al recoger sangre de la paciente. Use guantes y gafas. Si el paciente está en aislamiento, por favor siga los procedimientos de nivel 4 de bioseguridad.
- Para recolectar sangre intravenosa al paciente, utilizar una aguja mariposa con tubo de extensión de pequeño calibre y un tubo de vacío de colección de sangre que contiene un tampón de lisis/obligatorio. Descansar el brazo del paciente en una posición hacia abajo y coloque el tubo de colección más bajo que la aguja de la mariposa. Inserte la aguja de la mariposa en la vena del paciente y sujete el tubo de vacío sangre colección la extensión de pequeño calibre.
Nota: Esto evitará el reflujo. - Después de la recolección de la sangre, mezclar el contenido del tubo poniendo el tubo de 5 - 10 veces.
Nota: Debido al vacío restante en el tubo de colección de sangre 1,6 ml de tampón de lisis/enlace, el volumen de la muestra recogida automáticamente será de 1,6 mL. - Desinfectar el exterior del tubo con etanol al 70%.
- Incubar los tubos durante 20 min a temperatura ambiente.
Nota: Puede detener aquí el protocolo y los tubos de colección de sangre completa pueden ser almacenados a-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C o 37 ° C durante al menos 1 mes7. - Seguir directamente el método simplificado de extracción de NA.
4. simplificado NA extracción de la sangre
- Para purificar el NA de la lisis/enlace inactivado con buffer recoge sangre, mezcla el contenido del tubo por el vacío de los bancos de tubo a mano 5-10 x.
- Retire con cuidado la tapa del tubo y la tapa de descarga.
- Vierta el preparado alícuota de MGP (1 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
- Colocar una nueva tapa de un tubo de colección de sangre no utilizadas en el tubo que contiene la muestra.
- Coloque un dedo sobre la tapa para asegurar que el tubo está firmemente cerrado y mezclar el contenido del tubo por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
- Coloque el tubo en el soporte magnético y mantenga un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
- Dar la vuelta el soporte magnético con el tubo un par de veces en mano para asegurarse de que todos los pop se recogen en el lado del tubo con el imán.
Nota: El soporte magnético puede reemplazarse por un imán alargado y una banda de caucho. - Retire la tapa del tubo y deseche el contenido del tubo utilizando una pipeta desechable o simplemente vertiendo el contenido en un tubo de recogida de 50 mL.
Nota: Evite aerosoles desde el tubo de la colección de 50 mL por el tubo con una tapa de cierre. - Vierta el preparado alícuota de WB-1 (4 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
- Retire el tubo del soporte magnético, mantener la tapa bien apretada con un dedo.
Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo. - Resuspender el pop por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
- Repita los pasos 4.6-4.8.
- Vierta el preparado alícuota de WB-2 (1.5 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo. - Coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
- Resuspender los pop poniendo el tubo de la colección de sangre durante unos segundos a mano.
- Repita el paso 4.6-4.8.
- Vierta el preparado alícuota de WB-3 (3 mL) directamente en el tubo de colección de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo. - Coloque un dedo sobre la tapa para que el tubo es cerrado herméticamente.
- Resuspender el pop por el tubo de la colección de sangre los bancos a mano 5 - 10 veces.
- Repita los pasos 4.6-4.8.
- Vierta el preparado alícuota de EB (100 μL) directamente en el tubo de colección de sangre.
- Coloque la tapa en el tubo y retire el tubo del soporte magnético.
Nota: Si usa un imán y una banda de caucho, simplemente retire la goma y el imán del tubo. - Resuspender el POPS en el EB golpeando suavemente el tubo de la colección de sangre 5 - 10 veces con un dedo.
Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí y los tubos pueden ser almacenados a-20 ° C. - Transferencia una gotita (5-8 μL) de la MGP resuspendido a la mezcla de reacción de amplificación de NA aguas abajo con una pipeta desechable 1,5 mL (cualquier amplificación de NA diagnóstico aguas abajo ensayo como pueden utilizar RT-lámpara o ensayos de qPCR/RT-qPCR).
Nota: El NAs se adhieren a los pop, así que asegúrese de usar el POPS en la posterior reacción de amplificación de NA. Mezclar la suspensión de pop antes de su uso. Después de mezclar, la MGP se acumulará en la parte inferior del tubo.
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Representative Results
El protocolo presentado aquí es simple y eficiente y puede aplicarse ampliamente a cualquier análisis molecular para ser realizadas en muestras de sangre infecciosa inactivadas con el tampón de lisis/obligatorio. El flujo de trabajo para la inactivación de la sangre y la extracción de NA se muestra en la figura 1, incluida la preparación de sangre colección tubos de vacío7 (figura 1A), la colección de sangre7 (figura 1B), la extracción de NA ( Figuras 1 - 1 H) y el análisis de NA aguas abajo (figura 1I).
Por el protocolo de extracción de NA simplificado, los pop no se eliminan de la etapa de elución, y, por lo tanto, las NAs tienden a pegarse a los pop. Cualquier análisis molecular aguas abajo, como qPCR o análisis de la lámpara, se deben realizar directamente en la MGP (figura 1I y figura 2) para asegurar un resultado positivo.
El método de extracción de NA es muestras de sangre eficiente y positiva de RNA o DNA virus con cargas virales tan bajas como 130-3.000 copias/mL pueden ser extraídos y analizados usando qPCR o RT-qPCR (figura 3).
Utilizando el método de extracción de NA, lámpara o lámpara de RT y un isotermo portátil batería-conducido para muestras de virus-positivo de la sangre, puede obtenerse un diagnóstico dentro de 40 min de la colección de sangre (figura 4).
Figura 1 : Flujo de trabajo para la extracción de NA simplificada de muestras de sangre. (A) preparar que la colección de sangre vacío de buffer lisis/enlace tubos utilizando una aguja y una jeringa. (B) recoge la sangre usando una aguja de mariposa. (C) Coloque el tubo de la colección de sangre en un soporte, retire la tapa y vierta el POPS en el tubo. (D) cierre el tubo con una nueva tapa y mezcle el contenido poniendo el tubo con la mano. (E) recoge el POPS en el lado del tubo de colección de sangre poniendo el tubo en el soporte magnético. (F) retirar el sobrenadante con una pipeta desechable. (G) verter las colada o elución búferes directamente en el tubo de colección de sangre y repetir las acciones que se muestra en los paneles D - F. (H) este panel muestra Pop listo para su uso directo en un qPCR, reacción de RT-qPCR, lámpara o lámpara de RT. () Transferencia de una gota (5-8 μL) de pop a un tubo de reacción de PCR o lámpara utilizando una pipeta desechable 1,5 mL. Panel A y B: esta figura ha sido modificada de Rosenstierne et al. 7. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Detección de 28 muestras de virus-positivo de la sangre extraída usando el método simplificado de extracción de NA de NA. Muestras de sangre entera negativo probado (1,6 mL) para un virus, se añadió un DNA-virus [virus de Epstein - Barr (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 copias/mL)] o un virus de ARN [virus de la Hepatitis C (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 copias/mL)] o un virus del Dengue (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 copias/mL). NAs fueron extraídos con el método arriba descrito, y NAs extraídos se analizaron por duplicado por qPCR interno específico, RT-PCR, lámpara o lámpara de RT, con o sin pops. El x-eje = el método de detección de NA, y-axis = el porcentaje de muestras positivas en la lámpara de qPCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Sensibilidad del método simplificado de extracción NA. Para una prueba de concepto del método, virus negativo sangre fue enriquecido con diferentes preparaciones de virus de DNA o RNA que contiene una definida carga viral, y NAs se obtuvieron usando el método simplificado de extracción de NA. (A) negativo sangre (1,4 mL) se añadió 200 μL de las diluciones 10 veces de la norma EBOV preparado para propósitos de diagnóstico (ENIVD), que fue preparado desde el reciente brote de Guéckédou/Guinea (2.0 x 106 copias/mL). Las NAs extraídos se analizaron por duplicado por un interno de EBOV específicas RT-qPCR7 utilizando a un termociclador MX3005P. (B) sangre (1,2 mL) se añadieron 400 μL de 10 veces las diluciones de una muestra de suero estandarizados de HCV que (1.2 x 106 IU/mL). El NAs extraídos fueron analizadas por duplicado por un VHC específicos internos RT-qPCR utilizando a un termociclador MX3005P. (C) sangre (1,2 mL) se añadieron 400 μL de diferentes concentraciones de EBV (2.0 x 104 copias/mL, 8.0 x 103 copias/mL, 2.7 x 103 copias/mL y 9.3 x 102 copias/mL). NAs extraídos fueron analizadas por duplicado por un interno qPCR de EBV-específica. (D) sangre (1,2 mL) se añadieron 400 μL de las diluciones 10 veces de un virus de BK (1.3 x 104 copias/mL). NAs extraídos fueron analizadas por duplicado por un qPCR BK específicos interno. X-eje = concentración final de un virus en la muestra de sangre entera con picos (copias/mL o UI/mL), el y-axis = el valor de Ct (media ± SD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Simplificado de extracción de NA y RT-LAMP o lámpara usando un dispositivo portátil isotermo. (A) debido a la falta de muestras de sangre entera de EBOV-positivos en el Departamento de Virus y microbiológicos de diagnóstico especial, Statens suero Institut, Dinamarca, 1,4 mL de sangre negativa se añadió 200 μL de las diluciones diferentes de la EBOV estándar preparado para fines diagnósticos (ENIVD). Las muestras inoculadas experimentaron una extracción de NA usando el método simplificado de extracción de NA y se analizaron por una reacción específica de EBOV RT-LAMP. Como control negativo, se incluyó una muestra de sangre negativa. El x-eje = concentración final de EBOV en la muestra de sangre entera con picos (copias/mL), y-axis = min a positivo. (B) para una prueba de concepto, alícuotas de sangre completa (1,6 mL) de 7 pacientes, diagnosticados positivo para EBV (13.000-500 copias/mL) en el Departamento de Virus y microbiológicos de diagnóstico especial, Statens suero Institut, Dinamarca, experimentó una NA extracción mediante el método simplificado de extracción de NA y se analizaron mediante una reacción de EBV-específica de la lámpara utilizando la batería-conducido Genie II isotermo portátil. Como control negativo, se incluyó una muestra de Parvo B19-positivo. El x-eje = la carga viral del VEB en la muestra del paciente (copias/mL), y-axis = min a positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este informe, describimos un seguro, rápido y simple cabecera NA extracción método manual para la detección molecular aguas abajo de un virus en sangre entera inactivado con buffer de lisis/enlace. El método de extracción descrito NA fue desarrollado para llevar a cabo directamente en muestras de sangre recogidas en vacío sangre colección tubos la lisis/enlace buffer (Tabla de materiales)7. Este búfer específico inactiva EBOV7 y es el componente crítico en el método. Después de la recolección de sangre, se recomienda incubar el tubo para por lo menos 20 min7 para asegurar la completa inactivación de la muestra. La inactivación de EBOV cabecera elimina la necesidad para el manejo de las muestras de EBOV positivo bajo condiciones de confinamiento riguroso, como condiciones BSL-4 y permite que las muestras ser manipulado bajo condiciones normales de BSL-2. Es probable que otros cuatro patógenos de grupo de riesgo, tales como el virus de Lassa, virus de Marburg y el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea Congo son también inactivadas por este buffer, pero esto queda por demostrar.
El método de extracción descrito NA fue desarrollado para realizar junto a un paciente en una sala de aislamiento del hospital o en un hospital de campaña y, por lo tanto, no requiere de ningún equipo de laboratorio, como centrifugadoras, bloques de calefacción o electricidad. Todo lo que el método de extracción de NA requiere son tubos que contienen un volumen fijo de pop o tampones de lavado, un soporte magnético y pipetas desechables. La preparación previa de los tubos que contienen buffers simplifica el protocolo porque elimina la necesidad de pipetas, y en su lugar, los buffers de alícuotas se vierten directamente en los tubos de muestras. El soporte magnético los pop que contiene el NA de capturas y media un fácil manejo de los pasos de lavado. El soporte magnético puede sustituirse con un imán ordinario y una banda elástica en el caso de un soporte magnético no está disponible; sin embargo, el soporte magnético reduce el riesgo práctico de dejar caer el tubo y se derrame el contenido cuando se aplica la goma y el imán. Debido a la viscosidad de la muestra de sangre entera inactivada de buffer de lisis/enlace, pipetas desechables se utilizan para quitar los topes de la colada de sobrenadante de líquido del tubo. Las pipetas desechables pueden ser sustituidas por verter directamente el contenido del tubo en un tubo de recogida de residuos, pero tenga en cuenta no para crear cualquier gotas fuera del tubo. Si se crean las gotas, la superficie contaminada no se debe nunca desinfectar directamente con cloramina o hipoclorito de sodio (los ingredientes activos en "bleach") ya que esta mezcla puede conducir a la formación de cianuro tóxicos. Por lo tanto, si se derrama en primer lugar, limpie el derrame con un paño absorbente. A continuación, limpie la superficie con etanol al 70% y luego con abundante agua y por último, usar cloramina o hipoclorito de sodio. Esto incluye todos los residuos que ha estado en contacto con el buffer de lisis/enlace (incluyendo el tubo de recogida de residuos y las pipetas desechables). Por el contrario, recoger todos los desechos en un recipiente separado y solo desinfectar el exterior del contenedor con etanol al 70%.
NAs son normalmente eluidas de la MGP durante un paso de la calefacción, pero este paso de la calefacción se ha eliminado en el protocolo de extracción de NA simplificado para eliminar el uso de la electricidad y equipo. Por lo tanto, las NAs tienden a pegarse a los pop, que, por lo tanto, se deben añadir a lo análisis de detección NA aguas abajo para una detección positiva de NA. Los pop son transferidos a la mezcla de reacción descendente utilizando una gota de una pipeta desechable 1,5 mL. Esta adición no es tan precisa como la adición normal, con una pipeta de punta aleta; sin embargo, la adición unprecise de NA/pop a la lámpara, mezcla de reacción RT-LAMP, qPCR o RT-qPCR no inhiben la reacción o influir en la señal de fluorescencia en nuestro análisis del diagnóstico interno. Sin embargo, esto puede diferir de un ensayo a ensayo, y recomendamos que cada prueba NA aguas abajo está validado, y que la sensibilidad del ensayo es probada usando el método simplificado de extracción de NA. El método de extracción de NA es relativamente sensible y muestras de sangre entera contiene un DNA o RNA virus tan bajas como 3.000 copias/mL puede fácilmente extraerse y detectados en las pruebas moleculares posteriores, como qPCR. La carga viral en muestras clínicas es generalmente muy alta durante la fase aguda de una infección, y virus de la fiebre hemorrágica, como el EBOV, virus de Lassa y virus de la fiebre hemorrágica de Crimea Congo suelen contengan más de 105 copias/mL9 ,10,11. Por lo tanto, virus en estas muestras pueden ser detectadas fácilmente mediante este método de extracción de NA. Sin embargo, la inactivación MPLB de virus que no sea la7EBOV, Vaccinia y vacuna virus8 queda por demostrarse.
El método simplificado de extracción de NA puede realizarse en salas de aislamiento del hospital o sobre el terreno y es ideal para punto de atención diagnóstico molecular. Sin embargo, el método no es aplicable para las extracciones de NA de alto rendimiento debido a la manipulación práctica de un tubo abierto. Si son necesarias extracciones de NA de alto rendimiento, las muestras de sangre entera inactivada pueden fácilmente ser purificadas mediante NA extracción robots7. Otra desventaja es el manejo de reactivos nocivos, tales como el buffer lisis/enlace buffer [20-30% glicol de polietileno p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter y 30-50% Guanidinio tiocianato (GITC)]17 y lavado I (30-50% de guanidinio cloruro de)17 en un tubo abierto fuera una campana de flujo. El búfer de lisis/Unión en la forma concentrada está contenido dentro del tubo de vacío y con la colección de la sangre 1:1 (v/v), la concentración se reduce antes de abre el tubo. La apertura del tubo de vacío y de la adición/eliminación de pop o tampón de lavado se realiza en unos pocos segundos y, por lo tanto, es mínimo el riesgo de inhalación de aerosoles. Después del retiro de tampón de lavado-, por el tubo, no otros reactivos nocivos se utilizan en el protocolo.
Muchas pruebas de diagnóstico moleculares punto de atención rápidos y dispositivos han sido desarrollados desde el brote EBOV en 20133,6,12,13,14,15,16 . Sin embargo, todavía muchas de estas pruebas requieren un manejo de up-stream de infecciosas materiales, gabinetes de bioseguridad BSL-3 y en un mínimo, equipo de laboratorio, tales como pipetas, centrífugas y bloques de calefacción o electricidad. El uso de gabinetes de bioseguridad complica y prolonga una diagnosis rápida. La inactivación de virus cabecera descrita con la colección directa de la sangre en los tubos de inactivación de virus combinado con el método simplificado de extracción de NA elimina la necesidad de gabinetes de bioseguridad, electricidad e instalaciones de laboratorio. Además, porque el método simplificado de extracción de NA puede realiza junto a la paciente y combinado con una reacción de la lámpara en un dispositivo portátil de isotermo impulsado por batería, un seguro diagnóstico molecular cabecera puede obtenerse dentro de 40 minutos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Susanne Lopes Rasmussen y Solvej Kolbjørn Jensen por su asistencia técnica y para el manejo de las muestras clínicas. Este proyecto forma parte del consorcio EbolaMoDRAD, que ha recibido financiación de la empresa de común innovadora medicina iniciativa 2 bajo subvención Convenio N ° 115843. Esta empresa común recibe el apoyo del investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea y el programa de innovación y la EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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