Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’extraction des acides nucléiques virus rapide de virus inactivés Germains. L’extraction est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité. La méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne).
Abstract
Le diagnostic rapide d’une infection est essentiel pour la gestion des épidémies, le confinement de risque et les soins aux patients. Nous avons déjà montré une méthode pour l’inactivation rapide chevet du virus Ebola lors des prélèvements sanguins pour les tests de sécurité d’acide nucléique (NA) en ajoutant un tampon de lyse/liaison commerciale directement dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide. Avec cette approche de chevet inactivation, nous avons développé une sûre, rapide et simplifiée chevet NA méthode d’extraction pour la détection ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. L’extraction de la NA est effectuée directement dans les tubes de prélèvement sanguin et ne nécessite aucun équipement ou l’électricité.
Après que le sang est prélevé dans le tampon de lyse/liaison, les contenus sont mélangés en retournant le tube à la main, et le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante. Particules de verre magnétique (POP) sont ajoutés au tube, et le contenu est mélangé en retournant le tube de prélèvement à la main. Pop est ensuite recueillies sur le côté du tube de prélèvement à l’aide d’un support magnétique ou un aimant et un élastique. Les pop est lavées trois fois, et après l’addition de tampon d’élution, directement dans le tube de prélèvement, le NAs sont prêt pour les tests de NA, comme qPCR ou amplification isotherme boucle (lampe), sans l’élimination des pop de la réaction. La méthode d’extraction de NA ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans les hôpitaux de campagne et les salles d’hôpital isolement). Lorsque cette méthode d’extraction de NA est combinée avec lampe et un instrument portatif, un diagnostic peut être obtenu au sein de 40 min de la collecte de sang.
Introduction
En cas d’épidémie de virus, lorsque les patients sont confinés à l’hôpital d’isolement ou lorsqu’un diagnostic rapide est nécessaire, un diagnostic moléculaire précis, simple et sûr de point-of-care est impératif pour le confinement des soins et risque patient. Les deux récentes éclosions virales, du virus Ebola (EBOV) en Afrique de l’Ouest (2013) et le virus Zika en Amérique du Sud (2015), ont augmenté l’intérêt pour l’amélioration point-of-care moléculaires tests diagnostiques, comme isotherme boucle-négociée de transcription inverse amplification (RT-lampe)1,2 et recombinase polymérase amplification (RPA)3,4. RT-lampe tant l’APR sont des tests moléculaires rapides, sensibles et spécifiques qui peuvent être effectuées sur les préparatifs de l’exemple simplifié. Pour le virus Zika, RT-lampe a été combinée avec un essai d’écoulement latéral (LFA), qui peut détecter des virus Zika dans des échantillons de sang total non épurées dans 30 min1; Toutefois, pour EBOV, qui est classé comme un pathogène de groupe 4 risque et est extrêmement contagieuse, les échantillons doivent être gérées en vertu de la biosécurité de niveau 4 (BSL-4) les conditions et inactivés avant toute procédure de diagnostic sûr puisse être exécutée.
Méthodes d’inactivation simplifiée pour EBOV, telles que l’ajout de tampons de la lyse de l’échantillon2,3,4,5, ont été utilisés lors de l’épidémie ; Cependant, ces méthodes nécessitent un traitement dans des conditions de BSL-4 avec matériel de laboratoire, tels que BSL-3 armoires de biosécurité, centrifugeuses, blocs de chauffage et pipettes, au minimum. Cet équipement n’est pas normalement présent dans les quartiers d’isolement ou dans des hôpitaux de campagne. Pour relever ce défi, a tenté d’effectuer des diagnostics de valises3et plusieurs appareils portables et les machines ont été développées [par exemple, un appareil portatif pour l’extraction des acides nucléiques (NA)]6. Toutefois, les échantillons positifs EBOV encore besoin être inactif avant que ces dispositifs peuvent être utilisés.
Nous avons déjà rapporté une méthode d’inactivation des virus chevet rapide pour le EBOV7, virus de la vaccine et Cowpox virus8 par addition d’un tampon de lyse/liaison commerciale pour les tubes de prélèvement sanguin sous vide ordinaire, permettant le direct transfert de sang du patient dans l’inactivation tampon7. Cette inactivation directe et immédiate dans un système fermé élimine le besoin de manipuler les échantillons à l’aide de n’importe quel un confinement rigoureux, tels que BSL-4 conditions7, et les échantillons peuvent être traités dans des conditions normales de BSL-2. Cette méthode d’inactivation est compatible avec plusieurs systèmes d’extraction de la NA, tels que les robots et main purification kits7; Cependant, ces méthodes nécessitent des équipements de laboratoire, tels que les robots, centrifugeuses et l’électricité, qui ne sont pas toujours présents sur le terrain ou à l’intérieur de l’hôpital d’isolement.
Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simplifiée NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire ultérieure d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction de NA ne nécessite pas un équipement autre qu’un magnet/Magnet holder. Aucun centrifugeuses, blocs, ou électricité de chauffage ne sont nécessaires pour l’extraction de NA. Par conséquent, cette méthode ne dépend pas des installations de laboratoire et peut facilement être utilisé n’importe où (par exemple, dans des hôpitaux de campagne, dans les salles d’hôpital d’isolement, ou avec faibles ressources). La méthode d’extraction de NA est rapide et simple et peut être utilisée directement dans les tests de NA en aval, comme qPCR, RT-qPCR, lampe ou RT-lampe. Cette méthode d’extraction de NA est associé à la lampe et un instrument portable isotherme axée sur la batterie, un chevet diagnostic puisse être obtenu dans 40 min de la collecte de sang.
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Protocol
Le Comité sur l’éthique de la recherche biomédicale, région de la capitale a donné un consentement éclairé, et toutes les méthodes décrites ici ont été exemptés de l’examen par le système des comités éthiques, conformément à la loi danoise sur les projets de développement de test.
1. préparation des Tubes sous vide de prélèvement sanguin pour l’Inactivation des Virus et Extraction rapide de NA
ATTENTION : La mémoire tampon utilisée pour ce protocole contient guanidinium thiocyanate (GITC) et un agent tensio-actif non ionique, qui sont irritants. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux. Si la mémoire tampon a été renversé, la surface contaminée ne doit jamais être désinfectée directement avec la chloramine ou hypochlorite de sodium (les ingrédients actifs de « bleach ») parce que ce mélange peut conduire à la formation de cyanure toxique. Tout d’abord, enlever le tampon déversé avec du papier absorbant. Ensuite, nettoyez la surface avec l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau et pour finir, utilisez chloramine ou hypochlorite de sodium.
- Pour préparer les tubes sous vide de prélèvement sanguin, injecter 1,6 mL de tampon lyse commerciale spécifique dans un tube à vide 4 mL EDTA en perforant le couvercle du tube à l’aide d’une aiguille de 25 x 1 et une seringue de 3 mL.
Remarque : Ne pas retirer le couvercle du tube. Le vide doit être maintenu. - Stocker les tubes à vide contenant le tampon à la température ambiante jusqu'à utilisation.
NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 an après leur préparation.
2. préparation des tampons pour l’Extraction de NA
- Pour préparer les tampons pour une extraction de NA, placer deux 1,8 mL, deux 4,5 mL et un 3,6 mL tubes dans un rack.
- Ajouter par pipetage, 960 µL de particules de verre magnétique (POP) à un tube propre 1,8 mL et étiquette avec pop.. remettre en suspension la suspension du projet gazier Mackenzie complètement avant de pipetage il.
NOTE : Les POP ont tendance à recueillir rapidement au fond du tube. - Ajouter, en pipettant également, 4 mL de tampon de lavage j’ai dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette en tant que WB-1.
ATTENTION : Tampon de lavage j’ai contient du chlorure guanidinium, qui est irritant. Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriés, utiliser une hotte à flux et porter des gants pour manipuler. Éviter toute peau et contact avec les yeux. - Ajouter, par pipetage, 1,5 mL de tampon de lavage II dans un tube propre 3,6 mL et étiquetez-le comme WB-2.
- Ajouter, en pipettant également, 3 mL de tampon de lavage III dans un tube propre 4,5 mL et l’étiquette que WB-3.
- Ajouter, en pipettant également, 100 µL de tampon d’élution dans un tube propre 1,8 mL et étiquetez-le comme EB.
- Conserver les tampons aliquotés à température ambiante jusqu'à l’utilisation.
NOTE : Les tubes sont stables pendant au moins 1 mois après leur préparation.
3. Blood Collection provenant de Patients présentant des signes et symptômes d’une infection par le Virus
ATTENTION : Prendre des mesures de sécurité de laboratoire appropriées lors de la collecte de sang du patient. Porter des gants et des lunettes. Si le patient est en isolement, s’il vous plaît suivre les procédures de sécurité biologique niveau 4.
- Pour collecter par voie intraveineuse du sang du patient, utiliser une aiguille à ailettes avec tube de rallonge de petit calibre et un tube vide de prélèvement contenant un tampon de lyse/liaison. Reposer le bras du patient dans une position à la baisse et positionner le tube de prélèvement inférieur à l’aiguille à ailettes. Insérer l’aiguille à ailettes dans la veine du patient et attacher le tube de prélèvement sous vide à l’extension de petit calibre.
Remarque : Cela évitera les reflux. - Après la collecte de sang, mélanger le contenu du tube en renversant le tube de 5 à 10 fois.
Remarque : En raison de la dépression reste dans le tube de prélèvement de sang contenant 1,6 mL de tampon de lyse/liaison, le volume de l’échantillon prélevé sera automatiquement 1,6 mL. - Désinfecter l’extérieur du tube à l’aide d’éthanol à 70 %.
- Incuber les tubes pendant 20 min à température ambiante.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les tubes de prélèvement de sang peuvent être conservés à-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C ou 37 ° C pendant au moins 1 mois7. - Passez directement à la méthode d’extraction NA simplifiée.
4. simplifier l’Extraction NA germains
- Pour purifier les NA de la lyse/liaison inactivés par tampon sang, mélange le contenu du tube en faisant basculer l’aspirateur tube à la main 5-10 x.
- Retirez le couvercle du tube délicatement et décharger le couvercle.
- Versez l’aliquote préparé de pop. (1 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
- Placer un nouveau couvercle d’un tube de prélèvement de sang non utilisé sur le tube contenant l’échantillon.
- Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé et mélanger le contenu du tube en renversant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
- Placer le tube dans le support magnétique et garder un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
- Retourner le support magnétique avec le tube quelques fois à la main pour s’assurer que tous les pop est collectés sur le côté du tube avec l’aimant.
NOTE : Le support magnétique peut être remplacé par un aimant allongé et un élastique. - Retirez le couvercle du tube et jeter le contenu du tube à l’aide d’une pipette à usage unique ou simplement en versant le contenu dans un tube de prélèvement de 50 mL.
Remarque : Éviter les aérosols provenant du tube de prélèvement de 50 mL en fermant le tube avec un couvercle. - Verser l’aliquote préparé de WB-1 (4 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
- Placez le couvercle sur le tube et placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
- Retirez le tube du Magnet holder, garder le couvercle bien serré avec un doigt.
Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube. - Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
- Répétez les étapes 4,6 et 4,8.
- Verser l’aliquote préparé de WB-2 (1,5 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube. - Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
- Remettre en suspension le pop en renversant le tube de prélèvement sanguin pendant quelques secondes à la main.
- Répétez l’étape 4,6 et 4,8.
- Verser l’aliquote préparé de WB-3 (3 mL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube. - Placer un doigt sur le couvercle afin d’assurer que le tube est bien fermé.
- Resuspendre le pop en retournant le tube de prélèvement de sang à la main 5 - 10 fois.
- Répétez les étapes 4,6 et 4,8.
- Versez l’aliquote préparé d’EB (100 µL) directement dans le tube de prélèvement de sang.
- Placez le couvercle sur le tube et retirez le tube du support magnétique.
Remarque : Si vous utilisez un aimant et un élastique, supprimez simplement l’élastique et l’aimant du tube. - Resuspendre le pop dans l’EB en tapant sur le tube de prélèvement de sang 5 - 10 fois avec un doigt.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et les tubes peuvent être conservés à-20 ° C. - Transférer une gouttelette (5-8 µL) de suspension pop au mélange en aval de réaction d’amplification de NA à l’aide d’une pipette à usage unique 1,5 mL (toute amplification en aval de NA diagnostique assay tels que lampe/RT-lampe ou qPCR/RT-qPCR dosages peuvent être utilisés).
Remarque : Le NAs va s’en tenir à la pop, alors n’oubliez pas d’utiliser le pop dans la réaction d’amplification en aval de NA. Mélanger la suspension du projet gazier Mackenzie avant utilisation. Après avoir mélangé, pop recueillera au fond du tube.
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Representative Results
Le protocole présenté ici est simple et efficace et peut être largement appliqué à n’importe quel test moléculaire à être effectuées sur des échantillons de sang infectieux inactivés avec le tampon de lyse/liaison. Le flux de travail pour l’inactivation de sang et l’extraction de la NA est illustré à la Figure 1, y compris la préparation de sang collection tubes à vide7 (Figure 1 a), le sang collection7 (Figure 1 b), l’extraction de NA ( Figures 1 - 1 H) et l’analyse en aval de la NA (Figure 1I).
Le protocole d’extraction simplifié NA, pop n’est pas supprimés de l’étape d’élution et, par conséquent, les NAs ont tendance à coller à la pop. Toute analyse moléculaire en aval, comme qPCR ou analyse de lampe, doit être effectuée directement sur les POP ( Figure 2etFigure 1I ) afin d’assurer un résultat positif.
La méthode d’extraction de NA est efficace et RNA-ADN-virus-positif ou sang total des échantillons avec des charges virales aussi faibles que 130-3 000 copies/mL peuvent être extraites et analysées à l’aide de qPCR ou RT-qPCR (Figure 3).
À l’aide de la méthode d’extraction de NA, lampe ou RT-lampe et un appareil portatif isotherme axée sur la batterie pour les échantillons de sang entier séropositifs au virus, un diagnostic peut être obtenu moins de 40 min de la collection de sang (Figure 4).
Figure 1 : "Workflow" pour extraction de NA simplifiée des échantillons de sang entier. (A) préparer que la collecte de sang de vide de tampon lyse/liaison tubes à l’aide d’une aiguille et une seringue. (B) collecter le sang à l’aide d’une aiguille à ailettes. (C) Placez le tube de prélèvement de sang dans un support, enlever le couvercle et verser les POP dans le tube. (D) fermer le tube avec un nouveau couvercle et mélanger le contenu en renversant le tube à la main. (E) à frais virés le pop sur le côté du tube de prélèvement de sang en renversant le tube dans le support magnétique. (F) supprimer le surnageant à l’aide d’une pipette à usage unique. (G) Versez les tampons de lavage ou d’élution directement dans le tube de prélèvement sanguin et répéter les actions sur les panneaux D - F. (H), ce panneau affiche pop prêts à être utilisés directement dans un qPCR, RT-qPCR, lampe ou RT-lampe de réaction. (I) transfert une gouttelette (5-8 µL) de pop dans un tube de réaction PCR ou la lampe à l’aide d’une pipette à usage unique 1,5 mL. Panneau de A et B: ce chiffre a été modifié par Rosenstierne et al. 7. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Détection de NA de 28 échantillons de sang entier séropositifs au virus extraite à l’aide de la méthode d’extraction NA simplifiée. Sang total des échantillons (1,6 mL) testé négatif pour un virus ont été fortifiés avec soit un virus ADN [virus Epstein - Barr (EBV) (2,0 x 104 - 1,0 x 103 copies/mL)] ou un virus à ARN [virus de l’hépatite C (VHC) (6,0 x 105 - 3,0 x 103 copies/mL)] ou un virus de la Dengue (DENV) (1,7 x 108 - 1.7 x 106 copies/mL). SAR ont été extraits à l’aide de la méthode décrite ci-dessus, et le NAs extrait ont été analysé en double exemplaire par qPCR interne spécifique, RT-PCR, lampe ou RT-lampe, avec ou sans pop. Le x-axe = la méthode de détection de NA, y-axe = le pourcentage d’échantillons positifs en qPCR/lampe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Sensibilité de la méthode d’extraction NA simplifiée. Pour une validation de principe de la méthode, sang entier négatif de virus a été dopé avec différentes préparations d’ARN ou d’ADN virus contenant une charge virale, et NAs ont été extraits à l’aide de la méthode d’extraction NA simplifiée. (A) sang négatif (1,4 mL) a été dopé avec 200 µL de 10 fois les dilutions de la norme EBOV préparé à des fins diagnostiques (ENIVD), qui a été préparé à partir de l’éclosion récente de Guéckédou/Guinée (2,0 x 106 copies/mL). Le NAs extrait ont été analysé en double exemplaire par un interne spécifique EBOV RT-qPCR7 , à l’aide d’un thermocycleur MX3005P. Sang total (B) (1,2 mL) a été additionné de 400 µL de 10 fois les dilutions d’un échantillon de sérum standard VHC qui (1.2 x 106 UI/mL). Le NAs extrait ont été analysé en double exemplaire par un interne RT-qPCR VHC spécifiques à l’aide d’un cycleur thermique MX3005P. (C) sang (1,2 mL) a été additionné de 400 µL de différentes concentrations d’EBV (2,0 x 104 copies/mL, 8,0 x 103 copies/mL, 2.7 x 103 copies/mL et 9,3 x 102 copies/mL). Le NAs extrait ont été analysé en double exemplaire par un interne qPCR EBV spécifique. Sang total (D) (1,2 mL) a été additionné de 400 µL de 10 fois les dilutions d’un virus de BK (1,3 x 104 copies/mL). Le NAs extrait ont été analysé en double exemplaire un qPCR BK spécifiques interne. Le x-axe = la concentration finale d’un virus dans l’échantillon de sang enrichi (copies/mL ou UI/mL), y-axe = la valeur Ct (moyenne ± écart-type). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Simplifié extraction NA et RT- ou une lampe à l’aide d’un dispositif portable isotherme. (A) en raison de l’absence d’échantillons de sang total EBOV séropositifs au département des Virus & Diagnostics spéciaux microbiologiques, Statens Serum Institut, Danemark, 1,4 mL de sang total négatif a été additionné de 200 µL de différentes dilutions de la EBOV norme élaborée à des fins diagnostiques (ENIVD). Les échantillons enrichis ont subi une extraction de NA à l’aide de la méthode d’extraction NA simplifiée et ont été analysés par une réaction spécifique EBOV RT-lampe. Comme témoin négatif, un échantillon de sang négative a été inclus. Le x-axe = la concentration finale de EBOV dans l’échantillon de sang enrichi (copies/mL), y-axe = le min à positive. (B) pour une preuve de concept, aliquotes de sang total (1,6 mL) chez 7 patients, un diagnostic positif pour EBV (13 000-500 copies/mL) au département de Virus & Diagnostics spéciaux microbiologiques, Statens Serum Institut, Danemark, a subi une NA extraction à l’aide de la méthode d’extraction NA simplifiée et ont été analysés par une réaction spécifique EBV lampe utilisant le portable Genie II axée sur la batterie dispositif isotherme. Comme témoin négatif, un échantillon de Parvo B19 positive a été inclus. Le x-axe = la charge virale de l’EBV dans un échantillon de patient (copies/mL), y-axe = le min à positive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce rapport, nous décrivons une sûre, rapide et simple chevet NA extraction méthode manuelle pour la détection moléculaire en aval d’un virus dans le sang d’entier inactivé tampon lyse/liaison. La méthode d’extraction NA décrite a été développée pour être effectuée directement sur des échantillons de sang prélevés dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide contenant la lyse/fixation tampon (Table des matières)7. Cet mémoire tampon spécifique inactive EBOV7 et est l’élément essentiel de la méthode. Après la collecte de sang, nous vous recommandons d’incubation le tube pendant au moins 20 min7 afin d’assurer une inactivation complète de l’échantillon. L’inactivation de EBOV chevet élimine la nécessité pour la manipulation d’échantillons positifs EBOV dans des conditions de confinement rigoureuses, telles que les conditions de BSL-4 et permet les échantillons à traiter dans des conditions normales de BSL-2. Il est probable qu’autres risques groupe quatre agents pathogènes, tels que le virus de Lassa et le virus de Marburg, le virus de la fièvre hémorragique de Crimée et du Congo sont également inactivés par cette mémoire tampon, mais cela reste à être démontré.
La méthode d’extraction NA décrite a été conçue pour être exécuté à côté d’un patient dans un service d’isolement de l’hôpital ou dans un hôpital de campagne et, il faut donc aucun équipement de laboratoire, tels que les centrifugeuses, blocs de chauffage ou l’électricité. Tout ce que la méthode d’extraction NA nécessite les tubes contenant un volume fixe de pop ou tampons de lavage, un support magnétique et pipettes jetables. La préparation préalable des tubes contenant des tampons simplifie le protocole parce qu’il élimine le besoin pour les pipettes, et au lieu de cela, les tampons aliquotés sont déversent directement dans les tubes à échantillon. Magnet holder intercepte pop contenant la NA et médiatise une manipulation facile des étapes de lavage. Le support magnétique peut être substitué avec un aimant ordinaire et un élastique dans le cas où un support magnétique n’est pas disponible ; Cependant, le support magnétique réduit le risque pratique de laisser tomber le tube et de renverser le contenu lors de l’application de l’aimant et la bande de caoutchouc. En raison de la viscosité de l’échantillon de sang inactivés par la mémoire tampon de lyse/liaison, pipettes jetables sont utilisés pour enlever les tampons de surnageant/liquide/lavage du tube. Les pipettes jetables peuvent être remplacés par une coulée directe du contenu du tube dans un tube de collecte des déchets, mais s’il vous plaît être conscient ne pas de créer des gouttelettes à l’extérieur du tube. Si les gouttelettes sont créés, la surface contaminée ne doit jamais être désinfectée directement avec la chloramine ou hypochlorite de sodium (les ingrédients actifs de « bleach ») parce que ce mélange peut conduire à la formation de cyanure toxique. Par conséquent, en cas de déversement tout d’abord, essuyer le déversement avec un tissu absorbant. Ensuite, nettoyez la surface avec l’éthanol à 70 %, puis avec de l’eau et pour finir, utilisez chloramine ou hypochlorite de sodium. Cela comprend tous les déchets qui a été en contact avec le tampon de lyse/liaison (y compris le tube de collecte des déchets et les pipettes jetables). Au lieu de cela, collecter tous les déchets dans un conteneur à déchets séparé et seulement désinfecter l’extérieur du récipient avec l’éthanol à 70 %.
NAs sont normalement élues des pop au cours d’une étape de chauffage, mais cette étape de chauffage a été supprimée dans le protocole d’extraction NA simplifié pour éliminer l’utilisation de l’électricité et équipement. Par conséquent, les NAs ont tendance à coller à la pop, qui, par conséquent, il faut ajouter à l’essai de détection de NA en aval pour une détection positive de NA. La pop est transférées dans le mélange de réaction en aval à l’aide d’une gouttelette d’une pipette à usage unique 1,5 mL. Cet ajout n’est pas aussi précis que l’ajout de normal à l’aide d’une pipette de bout de nageoire. Toutefois, l’ajout d’imprécisions de NA/pop à la lampe, lampe de RT qPCR et RT-qPCR mélange réactionnel n’inhibent la réaction ni influencer le signal de fluorescence dans notre test de diagnostic interne. Néanmoins, elle peut différer d’un test pour un test, et nous recommandons que chaque test de NA en aval est validé et que la sensibilité du test est testée à l’aide de la méthode d’extraction NA simplifiée. La méthode d’extraction de NA est relativement sensible et des échantillons de sang entier contenant un ADN ou ARN virus aussi faibles que 3 000 copies/mL peut facilement être extraites et détecté dans les tests moléculaires en aval, tels que qPCR. La charge virale dans les échantillons cliniques est généralement très élevée au cours de la phase aiguë d’une infection, et virus de la fièvre hémorragique, comme le EBOV, le virus de Lassa et virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo, contiennent généralement plus de 105 copies/mL9 ,10,11. Par conséquent, virus dans ces échantillons peuvent facilement être détectés en utilisant cette méthode d’extraction de NA. Cependant, l’inactivation de la MPLB des virus autres que les7EBOV, vaccine et Cowpox virus8 reste à être démontré.
La méthode d’extraction NA simplifiée peut être réalisée dans les salles d’isolement hôpital ou sur le terrain et est idéale pour le diagnostic moléculaire point-of-care. Toutefois, la méthode n’est pas applicable pour les extractions de NA de haut débit en raison de la manipulation pratique d’un tube ouvert. Si les extractions NA haut débit sont nécessaires, les échantillons de sang total inactivés peuvent facilement être épurées à l’aide de robots NA extraction7. Un autre inconvénient est la manipulation des réactifs dangereux tels que le tampon de lyse/fixation tampon [20-30 % polyéthylène glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phényl éther et 30 à 50 % guanidinium thiocyanate (GITC)]17 et lavage j’ai (30-50 % guanidinium chlorure)17 dans un tube ouvert à l’extérieur d’une hotte à flux. Le tampon de lyse/liaison sous forme concentrée est contenu dans le tube à vide et à la collecte de sang 1:1 (v/v), la concentration est réduite avant que le tube est ouvert. L’ouverture du tube à vide et l’ajout ou la suppression de pop ou de tampon de lavage j’ai est effectué en quelques secondes et, par conséquent, le risque d’inhalation d’aérosols est minime. Après l’enlèvement du tampon de lavage-I, du tube, aucuns les autres réactifs dangereux ne sont utilisés dans le protocole.
Beaucoup de tests moléculaires rapides point-of-care et de dispositifs ont été développés depuis l’apparition EBOV en 20133,6,12,13,14,15,16 . Cependant, beaucoup de ces tests nécessitent toujours une tenue de route en amont d’infectieuses matérielles, armoires de biosécurité BSL-3 et à un minimum, matériel de laboratoire, tels que les pipettes, centrifugeuses et blocs de chauffage ou l’électricité. L’utilisation des enceintes de sécurité biologique complique et prolonge un diagnostic rapide. L’inactivation des virus chevet décrit avec la collecte directe de sang dans les tubes d’inactivation de virus combinée avec la méthode d’extraction NA simplifiée élimine le besoin pour les armoires de la prévention des risques biotechnologiques, l’électricité et des installations de laboratoire. En outre, parce que la méthode d’extraction NA simplifiée peut être effectuée à côté du patient et combinée à une réaction de la lampe dans un dispositif portatif isotherme axée sur la batterie, un diagnostic moléculaire chevet sûr peut être obtenu au sein de 40 min.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Susanne Lopes Rasmussen et Solvej Kolbjørn Jensen pour leur assistance technique et pour manipuler les échantillons cliniques. Ce projet fait partie du consortium EbolaMoDRAD, qui a reçu un financement de l’innovants médecine Initiative 2 entreprise commune au titre de la subvention contrat N ° 115843. Cette entreprise commune bénéficie du soutien de la recherche Horizon 2020 de l’Union européenne et l’EFPIA et programme d’innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
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