Summary
Hier presenteren we een protocol voor de snelle virus nucleïnezuur extractie van de volbloed virus-geïnactiveerd. De winning gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit. De methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan overal worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen).
Abstract
De snelle diagnose van een infectie is essentieel voor de uitbraak beheer risico insluiting en de patiëntenzorg. Wij hebben eerder een methode voor de snelle bed inactivering van het Ebola-virus tijdens bloedmonsters voor veilige nucleïnezuur (nvt) tests getoond door het toevoegen van een buffer van commerciële lysis/bindende rechtstreeks in de vacuüm bloed collectie buizen. Gebruik deze bed inactivatie-aanpak, hebben we ontwikkeld een veilige, snelle en vereenvoudigde bed nb extractiemethode voor de latere detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De NA extractie gebeurt rechtstreeks in het bloed collectie buizen en vereist geen apparatuur of elektriciteit.
Nadat het bloed is verzameld in de buffer lysis/bindende, de inhoud door het omkeren van de buis met de hand worden gemengd en het mengsel wordt gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Magnetische glas deeltjes (MOP's) worden toegevoegd aan de buis, en de inhoud zijn gemixt door het omkeren van de buis van de collectie met de hand. De meerjarige oriëntatieprogramma's worden vervolgens verzameld aan de zijkant van de bloed collectie buis met behulp van een Paperclip Magneethouder of een magneet en een rubberen band. De meerjarige oriëntatieprogramma's zijn drie keer gewassen, en na de toevoeging van elutie buffer rechtstreeks in de collectie buis, de NAs zijn klaar voor NA proeven, zoals qPCR of lus isotherme amplificatie (LAMP), zonder de verwijdering van de meerjarige oriëntatieprogramma's uit de reactie. De nb-extractiemethode is niet afhankelijk van enige laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden overal gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen en ziekenhuis isolatie wijken). Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare instrument, kan een diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.
Introduction
Virus uitbraak situaties, wanneer patiënten zijn beperkt tot het ziekenhuis isolatie afdelingen of wanneer een snelle diagnose nodig is, is een veilige, eenvoudige en nauwkeurige point-of-care moleculaire diagnostiek absoluut noodzakelijk dat de patiënt zorg en risico insluiting. De twee recente virale uitbraken, van het Ebola-virus (EBOV) in West-Afrika (2013) en het Zika-virus in Zuid-Amerika (2015), is de belangstelling voor verbeterde point-of-care aan moleculaire diagnostische tests, zoals omgekeerde transcriptie lus-gemedieerde isotherme gestegen versterking (RT-LAMP)1,2 en recombinase polymerase versterking (RPA)3,4. RT-LAMP én RPA zijn snelle, gevoelige en specifieke moleculaire tests die kunnen worden uitgevoerd op vereenvoudigde staalvoorbereiding. Voor de Zika-virus, heeft RT-LAMP is gecombineerd met een laterale stroom assay (LFA), die Zika-virus in monsters van volbloed niet-gezuiverd binnen 30 min1 detecteren kan; echter, voor EBOV, die is ingedeeld als een risico groep 4 pathogeen en is zeer besmettelijk, de monsters moeten worden behandeld onder bioveiligheid niveau 4 (BSL-4) voorwaarden en geïnactiveerd alvorens een veilige diagnostische procedures kunnen worden uitgevoerd.
Vereenvoudigde inactivatie methoden voor EBOV, zoals de toevoeging van lysis buffers naar de monster2,3,4,5, werden gebruikt tijdens de uitbraak; echter, deze methoden vereisen behandeling onder BSL-4 voorwaarden met laboratoriumapparatuur, zoals BSL-3 bioveiligheid kasten, centrifuges, Verwarming blokken en pipetten, minimaal. Deze apparatuur is normaal niet aanwezig in isolatie wijken of in veldhospitalen. Om te overwinnen deze uitdaging, pogingen hebben gedaan voor het uitvoeren van diagnostiek in koffers3en diverse draagbare apparaten en machines zijn ontwikkelde [bijvoorbeeldeen draagbaar apparaat voor de extractie van nucleïnezuur (nvt)]6. EBOV-positieve monsters moeten echter nog worden geïnactiveerd voordat deze apparaten kunnen worden gebruikt.
We hebben eerder gemeld een snelle bed virus inactivatie methode voor de EBOV7, vacciniavirus en Koepokken virus8 door toevoeging van een commerciële lysis/bindende buffer gewone vacuüm bloed collectie buizen, waardoor voor de rechtstreekse overdracht van bloed van de patiënt in de inactivering buffer7. Deze directe en onmiddellijke inactivatie in een gesloten systeem elimineert de noodzaak voor de behandeling van de monsters met behulp van een strikte inperking, zoals BSL-4 voorwaarden7, en de monsters kunnen worden behandeld onder normale omstandigheden van BSL-2. Deze methode inactivatie is compatibel met verschillende nb Extractiesystemen, zoals robots en hand reiniging kits7; echter, deze methoden vereisen laboratoriumapparatuur, zoals robots, centrifuges en elektriciteit, die niet altijd aanwezig in Veldinstellingen of in ziekenhuis isolatie wijken.
In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en vereenvoudigde handmatige nb extractiemethode voor de latere moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De nb-extractiemethode hoeft niet alle apparatuur dan een magneet/magnetische houder. Geen centrifuges, Verwarming blokken, of elektriciteit nodig zijn voor de NA extractie. Vandaar, deze methode is niet afhankelijk van laboratoriumfaciliteiten en kan gemakkelijk worden gebruikt (bijvoorbeeld, in veldhospitalen, in ziekenhuis isolatie wijken, of met lage-broninstellingen) overal. De nb-extractiemethode is snel en eenvoudig en rechtstreeks in elke stroomafwaartse nb proeven, zoals qPCR, RT-qPCR, LAMP of RT-LAMP kan worden gebruikt. Wanneer deze NA-extractiemethode wordt gecombineerd met LAMP en een draagbare batterij-gedreven isothermische instrument, kan een bed diagnose binnen 40 min van de bloedinzameling worden verkregen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het Comité voor biomedische ethiek van het onderzoek, Hoofdstedelijk Gewest geïnformeerde toestemming heeft gegeven, en alle methoden die hier worden beschreven zijn vrijgesteld van een beoordeling door het systeem van het ethisch comité, volgens de Deense wet betreffende assay ontwikkelingsprojecten.
1. bereiding van bloed collectie vacuümbuizen Virus inactivering en snelle NA extractie
Let op: De buffer die wordt gebruikt voor dit protocol bevat guanidinium kaliumthiocyanaat (GITC) en een niet-ionogene oppervlakteactieve stof, die irriterende stoffen. Aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen te nemen, gebruik van een kap stroom en draag handschoenen bij het hanteren van het. Elke huid- en oogcontact vermijden. Als de buffer is gemorst, moet het verontreinigde oppervlak nooit worden ontsmet direct met chloramine of natriumhypochloriet (de werkzame bestanddelen in "bleekmiddel") omdat dit mengsel tot de vorming van giftige cyanide leiden kan. Eerst, veeg omhoog de gemorste buffer met het absorberend weefsel. Volgende, reinig het oppervlak met 70% ethanol en vervolgens met water, en ten slotte gebruiken chloramine of natriumhypochloriet.
- Ter voorbereiding van het bloed collectie vacuümbuizen, injecteren 1.6 mL van de specifieke commerciële lysis-buffermengsel in een tube 4 mL EDTA vacuüm door het deksel van de buis met behulp van een 25 G x 1 naald en een spuit met 3 mL prikken.
Opmerking: Verwijder het deksel van de buis vacuüm niet. Het vacuüm moet worden gehandhaafd. - Bewaar de vacuümbuizen met de buffer bij kamertemperatuur tot gebruik.
Opmerking: De buizen zijn stabiel gedurende ten minste 1 jaar na hun voorbereiding.
2. bereiding van Buffers NA extractie
- Ter voorbereiding van de buffers van een NA extractie, twee 1.8 mL, twee 4.5 mL en een 3,6 mL buizen in een rack te plaatsen.
- Toevoegen, door pipetteren, 960 µL van magnetische glas deeltjes (MOP's) om een schone 1.8 mL tube en een label met meerjarige oriëntatieprogramma's. resuspendeer de schorsing MGP volledig vóór het pipetteren.
Opmerking: De meerjarige oriëntatieprogramma's hebben de neiging om te snel verzamelen aan de onderkant van de buis. - Toevoegen, waarbij eveneens, 4 mL was buffer ik tot een schone 4.5 mL koker en label als WB-1.
Let op: Was buffer I bevat guanidinium chloride, die irriterend is. Aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen te nemen, gebruik van een kap stroom en draag handschoenen bij het hanteren van het. Elke huid- en oogcontact vermijden. - Toevoegen, door pipetteren, 1,5 mL was buffer II tot een schone 3.6 mL koker en label als WB-2.
- Toevoegen, door pipetteren, 3 mL was buffer III tot een schone 4.5 mL koker en label als WB-3.
- Toevoegen, door pipetteren, 100 µL van elutie buffer tot een schone 1.8 mL koker en label als EB.
- De aliquoted buffers bij kamertemperatuur bewaren tot gebruik.
Opmerking: De buizen zijn stabiel gedurende ten minste 1 maand na hun opstelling.
3. de bloedinzameling van patiënten met tekenen en symptomen van een virusinfectie
Let op: Neem aangewezen laboratorium veiligheidsmaatregelen bij het verzamelen van bloed van de patiënt. Draag handschoenen en bril. Als de patiënt geïsoleerd is, volg dan de bioveiligheid niveau 4 procedures.
- Om te verzamelen intraveneuze bloed van de patiënt, gebruiken een vlinder naald met lijst verlenging buizen en een bloed collectie vacuümbuis met een buffer van lysis/bindende Rusten de arm van de patiënt in een neerwaartse positie en plaats de collectie buis lager is dan de vlinder naald. Plaats de vlinder naald in de ader van de patiënt en hechten de bloed collectie vacuümbuis aan de small-bore extensie.
Opmerking: Dit zal verhinderen terug-flow. - Meng de inhoud van de buis door de buis 5 - 10 keer na de bloedinzameling.
Opmerking: Als gevolg van de resterende vacuüm in het bloed collectie buis met 1.6 mL lysis/bindende buffer, het volume van het monster verzameld zullen automatisch worden 1.6 mL. - Desinfecteer de buitenkant van de buis met behulp van 70% ethanol.
- Incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en de volledige bloed collectie buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C of 37 ° C gedurende ten minste 1 maand7. - Direct de vereenvoudigde nb-extractiemethode blijven.
4. vereenvoudigde NA extractie van de volbloed
- De inhoud van de buis door het vacuüm buis om te zuiveren NA uit de lysis/bindende buffer-geïnactiveerd verzamelde bloed, mix met de hand 5-10 x.
- Verwijder het deksel van de buis zorgvuldig en ontladen van de deksel.
- Giet de bereid aliquoot gedeelte van het meerjarige oriëntatieprogramma's (1 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
- Plaats een nieuwe deksel van een ongebruikte bloed collectie buis over de buis met het monster.
- Plaats een vinger op het deksel om te garanderen dat de buis goed is gesloten en meng de inhoud van de tube door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
- Plaats de buis in de magnetische houder en houden een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
- Flip de magnetische houder met de buis een paar keer met de hand om ervoor te zorgen dat alle de meerjarige oriëntatieprogramma's worden verzameld op de kant van de buis met de magneet.
Opmerking: De magnetische houder kan worden vervangen door een langwerpig magneet en een rubberen band. - Verwijder het deksel van de buis en gooi de inhoud van de tube met behulp van een wegwerp pipet of gewoon door het gieten van de inhoud in een tube van 50 mL collectie.
Opmerking: Vermijd aërosolen uit de tube van 50 mL collectie door het sluiten van de buis met een deksel. - Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-1 (4 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
- Plaats het deksel op de buis en plaatsen van een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
- Verwijder de buis van de magnetische houder, het deksel stevig aangedraaid met een vinger te houden.
Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis. - Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
- Herhaal stap 4.6-4.8.
- Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-2 (1,5 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
- Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis. - Plaats een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
- Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis voor een paar seconden met de hand.
- Herhaal stap 4.6-4.8.
- Giet de bereid aliquoot gedeelte van het WB-3 (3 mL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
- Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis. - Plaats een vinger op het deksel om dat de buis is gesloten.
- Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's door flipping de bloed collectie buis met de hand 5 - 10 keer.
- Herhaal stap 4.6-4.8.
- Giet de bereid hoeveelheid EB (100 µL) rechtstreeks in het bloed collectie buis.
- Plaats het deksel op de buis en verwijder de buis van de magnetische houder.
Opmerking: Als een magneet en een elastiekje, gewoon verwijder de rubberen band en magneet van de buis. - Resuspendeer de meerjarige oriëntatieprogramma's in de EB door te tikken op de bloed collectie buis 5 - 10 keer met een vinger.
Opmerking: Het protocol hier kan worden onderbroken, en de buizen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C. - Overdracht één druppel (5-8 µL) van de geresuspendeerde meerjarige oriëntatieprogramma's aan de downstream NA versterking reactie mix met behulp van een 1,5 mL Wegwerp pipet (elke stroomafwaartse diagnostische NA versterking assay zoals LAMP/RT-LAMP of qPCR/RT-qPCR testen kunnen worden gebruikt).
Opmerking: De NAs zal vasthouden aan de meerjarige oriëntatieprogramma's, dus zorg ervoor dat de meerjarige oriëntatieprogramma's te gebruiken in de stroomafwaartse NA versterking reactie. Meng de schorsing MGP vóór gebruik. Na het mengen, zal de meerjarige oriëntatieprogramma's verzamelen aan de onderkant van de buis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier gepresenteerd is eenvoudig en efficiënt en in grote lijnen kan worden toegepast op elke moleculaire test op infectieuze volbloed monsters geïnactiveerd met de buffer lysis/bindend moeten worden uitgevoerd. De workflow voor de inactivering van het bloed en NA extractie is afgebeeld in Figuur 1, met inbegrip van de voorbereiding van bloed collectie vacuümbuizen7 (figuur 1A), het bloed collectie7 (figuur 1B), de nb-extractie ( Cijfers 1 c - 1 H), en de stroomafwaartse NA analyse (figuur 1I).
Als gevolg van het vereenvoudigde NA extractie protocol, de meerjarige oriëntatieprogramma's worden niet verwijderd uit de elutie stap, en daarom de NAs de neiging vast te houden aan de meerjarige oriëntatieprogramma's. Elke stroomafwaartse moleculaire analyse, zoals qPCR of LAMP analyse moet worden uitgevoerd rechtstreeks op de meerjarige oriëntatieprogramma's (figuur 1I en Figuur 2) om een positief resultaat.
De NA extractiemethode is efficiënt en RNA of DNA-virus-positieve geheel bloedmonsters virale drukbelastingen zo laag als 130-3.000 kopieën/mL kan worden geëxtraheerd en geanalyseerd met behulp van qPCR of RT-qPCR (Figuur 3).
Met behulp van de methode NA extractie, LAMP of RT-LAMP en een draagbare batterij-gedreven isothermische apparaat voor virus-positief bloedmonsters, kan een diagnose worden verkregen binnen de 40 min uit de collectie van het bloed (Figuur 4).
Figuur 1 : Workflow voor vereenvoudigde NA extractie van monsters van volbloed. (A) voorbereiden die de bloedinzameling lysis/bindende buffer vacuüm buizen met behulp van een naald en een spuit. (B) verzamelen het bloed met behulp van een naald van de vlinder. (C) plaats de buis collectie bloed in een houder, verwijder het deksel, en giet de meerjarige oriëntatieprogramma's in de buis. (D) Sluit de buis met een nieuwe deksel en meng de inhoud door het omkeren van de buis met de hand. (E) verzamelen de meerjarige oriëntatieprogramma's aan de kant van de buis van de collectie bloed door het wegknippen van de buis in de magnetische houder. (F) Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een wegwerp pipet. (G) de buffers wassen of elutie giet rechtstreeks in het bloed collectie buis en herhaal de acties weergegeven in panelen D - F. (H) dit paneel toont meerjarige oriëntatieprogramma's klaar voor direct gebruik in een qPCR, RT-qPCR, LAMP of RT-LAMP reactie. (ik) overdracht één druppel (5-8 µL) van de meerjarige oriëntatieprogramma's tot een PCR of LAMP reactiebuis met behulp van een 1,5 mL Wegwerp pipet. A en Bvan het deelvenster: deze figuur is gewijzigd van Rosenstierne et al. 7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : NA detectie van 28 virus-positief bloedmonsters geëxtraheerd met behulp van de vereenvoudigde nb-extractiemethode. Volbloed monsters (1.6 mL) getest negatief voor een virus werden verrijkt met ofwel een DNA-virus [Epstein - Barr virus (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 kopieën/mL)] of een RNA-virus [Hepatitis C-virus (HCV) (6.0 x 105 - 3.0 x 103 kopieën/mL)] of een Dengue virus (DENV) (1,7 x 108 - 1,7 x 106 kopieën/mL). NAs werden gehaald met behulp van de hierboven beschreven methode, en de uitgepakte NAs werden geanalyseerd in tweevoud door specifieke interne qPCR, RT-PCR, LAMP of RT-LAMP, met of zonder de meerjarige oriëntatieprogramma's. De x-as = de nb detectiemethode, de y-as het percentage van de monsters in qPCR/LAMP positief =. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Gevoeligheid van de vereenvoudigde nb-extractiemethode. Voor een proof of concept van de methode, virus negatieve volbloed werd verrijkt met verschillende RNA of DNA-virus preparaten die een gedefinieerde virale lading, en NAs werden gewonnen met behulp van de vereenvoudigde nb-extractiemethode. (A) negatieve volbloed (1,4 mL) werd verrijkt met 200 µL 10-fold verdunningen van de EBOV standaard voorbereid voor diagnostische doeleinden (ENIVD), die bereid was uit de recente uitbraak in Guéckédou/Guinese (2.0 x 106 kopieën/mL). De uitgepakte NAs werden door een in-house EBOV-specifieke RT-qPCR-7 met behulp van een MX3005P thermische cycler in duplo geanalyseerd. (B) bloed (1,2 mL) werd verrijkt met 400 µL 10-fold verdunningen van een HCV die gestandaardiseerde serummonster (1.2 x 106 IU/mL). De uitgepakte NAs werden door een in-house HCV-specifieke RT-qPCR met behulp van een MX3005P thermische cycler in duplo geanalyseerd. (C) volbloed (1,2 mL) werd verrijkt met 400 µL van verschillende concentraties van EBV (2.0 x 104 kopieën/mL, 8.0 x 103 kopieën/mL 2,7 x 103 kopieën/mL en 9.3 x 102 kopieën/mL). De uitgepakte NAs werden door een in-house EBV-specifieke qPCR in duplo geanalyseerd. (D) volbloed (1,2 mL) werd verrijkt met 400 µL 10-fold verdunningen van een BK-virus (1.3 x 104 kopieën/mL). De uitgepakte NAs werden door een in-house BK-specifieke qPCR in duplo geanalyseerd. De x-as = de uiteindelijke concentratie van een virus in het monster van de puntige volbloed (kopieën/mL of IU/mL), de y-as = de Ct-waarde (gemiddelde ± SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Vereenvoudigde NA extractie en RT-LAMP of LAMP met behulp van een draagbaar apparaat voor isothermische. (A) als gevolg van het ontbreken van EBOV-positief bloedmonsters op het departement van Virus & microbiologische speciale diagnostiek, Statens Serum Institut, Denemarken, 1,4 mL negatieve volbloed werd verrijkt met 200 µL van verschillende verdunningen van het EBOV standaard voorbereid voor diagnostische doeleinden (ENIVD). De verrijkte monsters onderging een nb-extractie met behulp van de vereenvoudigde nb-extractiemethode en werden geanalyseerd door de reactie van een EBOV-specifieke RT-LAMP. Als een negatieve controle was een negatieve volbloed steekproef opgenomen. De x-as = de uiteindelijke concentratie van EBOV in de puntige volbloed monster (kopieën/mL), de y-as = de min naar positief. (B) voor een proof of concept, volbloed (1.6 mL) aliquots van 7 patiënten gediagnosticeerd positief voor EBV (13.000-500 kopieën/mL) op het departement van Virus & microbiologische speciale diagnostiek, Statens Serum Institut, Denemarken, onderging een nb Extractie met behulp van de vereenvoudigde nb-extractiemethode en werden geanalyseerd door een reactie van de EBV-specifieke LAMP met behulp van het draagbare batterij-gedreven Genie II isothermische apparaat. Als een negatieve controle was een Parvo B19-positieve steekproef opgenomen. De x-as = de virale lading van EBV in een patiënt monster (kopieën/mL), de y-as = de min naar positief. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit verslag beschrijven we een veilige, snelle en eenvoudige handleiding bed nb extractiemethode voor de downstream moleculaire detectie van een virus in cellysis/bindende buffer-geïnactiveerd volbloed. De beschreven nb-extractiemethode werd ontwikkeld om rechtstreeks op volbloed monsters verzameld in vacuüm bloed collectie buizen met de lysis/bindende buffer (Tabel of Materials)7worden uitgevoerd. Deze specifieke buffer inactiveert EBOV7 en is de kritische component in de methode. Na de bloedinzameling, is het raadzaam het broeden van de buis voor ten minste 20 min7 met het oog op een volledige inactivering van het monster. De bed EBOV inactivering elimineert de noodzaak voor de behandeling van de EBOV-positieve monsters onder strikte inperking voorwaarden, zoals de BSL-4 omstandigheden, en laat de monsters moeten worden verwerkt onder normale omstandigheden van BSL-2. Het is waarschijnlijk dat andere risico groep vier ziekteverwekkers, zoals de Lassa-virus, het Marburgvirus en het Krim-Kongo hemorragische koorts virus zijn ook geïnactiveerd door deze buffer, maar dit blijft worden getoond.
De beschreven nb-extractiemethode werd ontwikkeld om te worden uitgevoerd naast een patiënt in een ziekenhuis isolatie afdeling of in een veldhospitaal en vereist daarom geen laboratoriumapparatuur, zoals centrifuges, blokken van de verwarming of elektriciteit. Alles wat vereist de nb-extractiemethode zijn buizen die bevatten een vast volume van meerjarige oriëntatieprogramma's of wassen buffers, een magnetische houder en wegwerp pipetten. De pre voorbereiding van de buisjes met buffers vereenvoudigt het protocol omdat het elimineert de noodzaak voor pipetten, en in plaats daarvan de aliquoted buffers rechtstreeks in de steekproef buizen zijn gegoten. De Magneethouder vangsten van de meerjarige oriëntatieprogramma's die bevatten de waarde N.V.T. en bemiddelt een eenvoudige behandeling van de stappen wassen. De magnetische houder kan worden vervangen door een gewone magneet en een rubberen band in het geval dat een magnetische houder is niet beschikbaar; de Magneethouder vermindert echter de hands-on risico van de buis te laten vallen en morsen van de inhoud bij de toepassing van de magneet en de rubber band. Als gevolg van de viscositeit van het monster van de volbloed buffer-geïnactiveerd lysis/bindende, worden wegwerp pipetten gebruikt om de bovendrijvende vloeistof/vloeistof/afwas buffers van de buis. De wegwerp pipetten kunnen worden vervangen door een directe gieten van de inhoud van de buis in een buis afvalinzameling, maar wees u ervan bewust niet te creëren eventuele druppels buiten de buis. Als druppeltjes worden gemaakt, moet het verontreinigde oppervlak nooit worden ontsmet direct met chloramine of natriumhypochloriet (de werkzame bestanddelen in "bleekmiddel") omdat dit mengsel tot de vorming van giftige cyanide leiden kan. Daarom, als eerste gemorst, veeg omhoog de lekkage met een absorberend weefsel. Volgende, reinig het oppervlak met 70% ethanol en vervolgens met veel water, en ten slotte gebruiken chloramine of natriumhypochloriet. Het gaat hierbij om al het afval dat al in contact met de lysis/bindende buffer (inclusief de afvalinzameling buis en de wegwerp pipetten). In plaats daarvan, verzamelen van alle afval in een aparte afvalcontainer en alleen het desinfecteren van de buitenkant van de container met 70% ethanol.
NAs worden normaal geëlueerd van de meerjarige oriëntatieprogramma's tijdens de stap van een Verwarming, maar deze stap verwarming is verwijderd in het vereenvoudigde NA extractie protocol bij het elimineren van het gebruik van elektriciteit en apparatuur. Dus, de NAs de neiging vast te houden aan de meerjarige oriëntatieprogramma's, die daarom moeten worden toegevoegd aan de downstream NA detectie assay voor een positieve NA detectie. De meerjarige oriëntatieprogramma's zijn overgebracht naar de downstream-mix met behulp van een druppel van een 1,5 mL Wegwerp pipet. Deze toevoeging is niet zo nauwkeurig als de normale toevoeging met behulp van een precisiepipet van fin tip; echter de onprecies toevoeging van nb/meerjarige oriëntatieprogramma's voor de LAMP, RT-LAMP, qPCR of RT-qPCR reactie mix niet remmen de reactie of het signaal van de fluorescentie bij onze in-house diagnostische test beïnvloeden. Niettemin, dit kan verschillen van assay te assay, en we raden dat elke stroomafwaartse NA test is gevalideerd en dat de gevoeligheid van de test is getest met behulp van de vereenvoudigde nb-extractiemethode. De nb-extractiemethode is relatief gevoelig en volbloed monsters met een DNA- of RNA-virus zo laag als 3.000 kopieën/mL kan gemakkelijk worden geëxtraheerd en gedetecteerd in de stroomafwaartse moleculaire tests, zoals qPCR. De virale lading in klinische monsters is meestal zeer hoog tijdens de acute fase van een infectie en hemorragische koorts virussen, zoals de EBOV, Lassa-virus en Krim-Kongo hemorragische koorts virus, bevatten meestal meer dan 105 kopieën/mL9 ,10,11. Daarom, virussen in deze monsters kunnen gemakkelijk worden opgespoord met behulp van deze methode NA extractie. Echter de MPLB inactivering van virussen dan de EBOV7, "vacciniavirus" en Koepokken virus8 blijft worden getoond.
De vereenvoudigde nb-extractiemethode kan worden uitgevoerd in ziekenhuis isolatie wijken of Veldinstellingen en is ideaal voor point-of-care moleculaire diagnostiek. De methode is echter niet van toepassing voor high-throughput NA extracties als gevolg van de praktische afhandeling van een open buis. Als hoge-doorvoer NA extracties nodig zijn, kunnen de monsters geïnactiveerd volbloed gemakkelijk gezuiverd worden met behulp van NA extractie robots7. Een ander nadeel is de behandeling van schadelijke reagentia zoals de lysis/bindende buffer [20-30% polyethyleenglycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenyl ether en 30-50% guanidinium kaliumthiocyanaat (GITC)]17 en wassen buffer ik (30-50% guanidinium chloride)17 in een open buis buiten een stroom kap. De lysis/bindende buffer in de geconcentreerde vorm is opgenomen binnen de vacuümbuis en met de inzameling van bloed 1:1 (v/v), de concentratie wordt verminderd voordat de buis wordt geopend. De opening van het vacuüm buis en de toevoeging of verwijdering van de meerjarige oriëntatieprogramma's of wassen buffer ik wordt uitgevoerd binnen een paar seconden en, vandaar, het risico van inademing van aërosolen is minimaal. Na het verwijderen van was buffer-ik, uit de buis, geen andere schadelijke reagentia in het protocol worden gebruikt.
Veel snelle point-of-care moleculaire tests en apparaten zijn ontwikkeld sinds de uitbraak van de EBOV in 20133,6,12,13,14,15,16 . Veel van deze tests vereisen echter nog een stroomopwaarts behandeling van besmettelijk materiaal, BSL-3 bioveiligheid kasten, en op een minimum, laboratoriumapparatuur, zoals pipetten, centrifuges, en blokken van de verwarming of elektriciteit. Het gebruik van bioveiligheid kasten compliceert en verlengt een snelle diagnose. De inactivering van de beschreven bed virus met de directe inzameling van bloed in de virus inactivatie buizen gecombineerd met de vereenvoudigde nb-extractiemethode elimineert de noodzaak voor bioveiligheid kasten, elektriciteit en laboratoriumfaciliteiten. Bovendien, omdat de vereenvoudigde nb-extractiemethode kan worden uitgevoerd naast de patiënt en gecombineerd met een reactie van de LAMP in een draagbare batterij-gedreven isothermische apparaat, kan een veilig bed moleculaire diagnostiek worden verkregen binnen de 40 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Susanne Lopes Rasmussen en Solvej Kolbjørn Jensen voor hun technische bijstand en voor de behandeling van de klinische monsters. Dit project is onderdeel van het EbolaMoDRAD consortium, dat financiering heeft ontvangen van de innovatieve geneeskunde initiatief 2 gemeenschappelijke onderneming onder grant overeenkomst N ° 115843. Deze gemeenschappelijkeonderneming krijgt ondersteuning van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoeks- en innovatie-programma en EFPIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
